一种止血抗菌促愈合的冷冻凝胶海绵制备方法与流程

本发明涉及水凝胶材料的技术领域，尤其是指一种止血抗菌促愈合的冷冻凝胶海绵制备方法。

背景技术：

目前，市场上已有很多商用的止血剂，如：商用纱布、纤维蛋白胶、明胶海绵等，这些材料在处理一般的组织表面伤口时能够有效的终止出血。但是，对于由子弹和尖锐物引起的弹道伤和穿透伤等不可压缩和不规则深层创面伤口，商用止血剂表现出低效率，甚至不能及时阻止伤口出血，造成较高的患者死亡率。除此之外，这些材料功能较为单一，仅仅有止血功能，不能在止血后杀死创面细菌保护组织创面不被感染和进一步释放生物活性因子促进创伤愈合。

冷冻凝胶是一种新型的制备大孔水凝胶方法，其可以在低温下(小于0℃)形成凝胶，常温下融化或冷冻干燥后即可得到大孔水凝胶或大孔海绵。与传统水凝胶相比，冷冻凝胶有互穿的大孔结构、迅速的水吸收能力和强韧的力学性能，因此冷冻凝胶被广泛的用于组织工程(创伤愈合和骨修复等)、生物分离和药物释放等领域。本方案根据冷冻凝胶法制备大孔形状记忆海绵的原理和特点，将mbg纳米颗粒作为生物活性颗粒，引入反应体系，拟设计一种大孔、迅速吸水恢复其形状的冷冻凝胶海绵，可作为性能优良的止血和促愈合材料。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提出了一种止血抗菌促愈合的冷冻凝胶海绵制备方法，该方法制备的海绵具有连通大孔结构，能够快速吸收血液中的水分，浓缩血液，加速血栓的形成；冷冻凝胶制备的海绵具有形状记忆功能，能够在压缩后，迅速吸收血液中的水分，恢复形状；另外，该方法使用的qcs是一种阳离子高分子，能够有效杀死创面的细菌，避免伤口感染；且海绵内的介孔生物活性玻璃纳米颗粒能够释放生物活性离子，si离子，促进纤维原细胞的迁移增殖和分泌大量生物活性增长因子和蛋白，如vegf、ⅰ型胶原等，加速创伤愈合。冷冻凝胶海绵具备优异的生物相容性，可作为高效的止血促愈合海绵，在止血和促进创伤愈合领域具有巨大的临床应用潜能。

为实现上述目的，本发明所提供的技术方案为：一种止血抗菌促愈合的冷冻凝胶海绵制备方法，首先，用2,3环氧丙基三甲基氯化铵gtmac对壳聚糖进行接枝改性，得到预设接枝率的季铵化壳聚糖，即qcs，其次通过溶胶凝胶法，结合牺牲模板法，制备出介孔的生物活性玻璃纳米颗粒，即mbg，将mbg分散于水溶液中，利用均质机使其分散均匀，然后逐滴加入qcs水相溶液，搅拌混合均匀，再利用戊二醛交联季铵盐壳聚糖分子链上的氨基，在低温下形成水凝胶，冷冻干燥后得到形状记忆海绵，即冷冻凝胶海绵；其包括以下步骤：

1)将qcs溶解于去离子水中，得到qcs水相溶液；

2)将mbg加入去离子水中，使用均质仪分散，得到mbg水相溶液；

3)将mbg水相溶液与qcs水相溶液混合，搅拌均匀，冰浴下加入戊二醛交联剂，得到混合溶液；

4)将混合溶液加入孔板中，低温下冷冻成胶，冻干，即得到大孔的形状记忆海绵，即冷冻凝胶海绵。

进一步，qcs的接枝率为18-46％，壳聚糖的分子量为100000-300000。

进一步，制备qcs的gtmac加入量为5-18g。

进一步，qcs水相溶液的浓度为0.8-4.8％。

进一步，mbg的粒径为100-800nm，介孔孔径为5-20nm。

进一步，mbg水相溶液的浓度为0-4.8％。

进一步，均质仪的转速为1-2万转。

进一步，将mbg水相溶液与qcs水相溶液混合，搅拌时间为0.5-2h。

进一步，戊二醛交联剂的浓度为0.0125-0.5％。

进一步，采用的孔板为24-96孔板，冷冻成胶的温度为-6～-198℃。

本发明与现有技术相比，具有如下优点与有益效果：

1、本发明得到的冷冻凝胶海绵具有良好的生物相容性。

2、使用冷冻凝胶方式成胶，反应所需交联剂浓度比传统水凝胶制备方法低，减少了材料毒性，提高了细胞相容性。

3、冷冻成胶法得到的连通大孔的海绵，溶胀率高，有利于快速吸水浓缩血液，缩短凝血级联反应时间，促进凝血。

4、冷冻凝胶法制备的海绵具有形状记忆功能，能够循环压缩，结构仍然保持完整，可将冷冻凝胶海绵压缩后，通过注射器注射进入伤口。

5、冷冻凝胶法制备的海绵含有季铵盐壳聚糖，其分子链上的正电基团不仅能够有效聚集血细胞加速血栓的形成，还能够杀死创面细菌防止出血口感染。

6、生物活性玻璃纳米颗粒的引入，不仅能够释放活性元素si⁴⁺，促进纤维原细胞迁移增殖和分泌大量生长因子和蛋白，还能释放ca²⁺以及纳米颗粒内部介孔结构吸水，加速血栓的形成，和qcs协同止血。

7、冷冻凝胶海绵有望称为优良的止血促愈合材料，具有巨大的临床应用潜能。

附图说明

图1为壳聚糖季胺化改性机理图。

图2为壳聚糖与季胺化壳聚糖的红外光谱图。

图3a为qcs海绵电镜扫描结果图。

图3b为qcs/mbg海绵电镜扫描结果图之一(海绵孔壁上有大量的mbg存在)。

图3c为qcs/mbg海绵电镜扫描结果图之二(出现高度互穿的大孔结构，孔径在100-300μm左右)。

图4a为冷冻凝胶海绵的压缩应力应变曲线图。

图4b为冷冻凝胶海绵的压缩应力应变循环曲线图。

图5为冷冻凝胶海绵的体外溶血性测试图。

图6为冷冻凝胶海绵的体外凝血性测试图。

图7为冷冻凝胶海绵对l929细胞增殖性测试图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

一、壳聚糖的修饰与表征

1)壳聚糖的季胺化改性

qcs是壳聚糖经2,3环氧丙基三甲基氯化铵(gtmac)修饰改性制备的，将cs溶于去离子水，加入gtmac，加热后纯化，即制备出季胺盐壳聚糖，季胺化改性机理见图1。

取6g壳聚糖于216mldw中，然后加入1％(v/v)的冰乙酸搅拌使壳聚糖充分溶于水，再加入5ggtmac，升温至55℃，反应18h。然后，4500rpm离心30min，离心后取出倒入预冷的丙酮中粗提纯，将提纯后的产物溶于水，使用8000-14000da的透析袋透析3d，进一步提纯产物。冻干后，即得到接枝率18％的产物。

2)壳聚糖季胺化产物的红外光谱

对上述cs与qcs进行红外光谱分析，检测官能团在红外光谱中的特征吸收，进而确定分子的结构，两种分子的ftir光谱图见图2。

图2上方的为cs的红外光谱，下方为qcs的红外光谱，可以看出在1478波数处，qcs红外光谱多出了一个特征峰，为gtmac上三甲胺基团的-c-h振动峰，说明gtmac成过修饰到壳聚糖分子主链上。

二、mbg的制备与表征

mbg使用乙酸乙酯-溴化十六烷基三甲胺-水微乳液滴合成，将1.4gctab溶解在49.5ml的水中，待完全溶解后加入10mlea，搅拌30min后形成微乳液滴，再加入14ml1m的氨水，搅拌15min后，间隔30min加入7.2mlteos、0.73mltep和5.554gcn，溶液均匀的搅拌4h，清澈的溶液逐渐变得浑浊形成白色沉淀，白色沉淀通过离心收集，并用无水乙醇和去离子水交替洗3次，然后样品在60℃烘箱中干燥24h，在650℃空气中煅烧3h。得到粒径为100nm、介孔孔径5nm的介孔生物活性玻璃纳米颗粒。

三、冷冻凝胶法制备海绵

将116mgqcs溶于12.5ml去离子水中，剧烈搅拌至qcs完全溶解，随后加入2.5ml浓度为0％的mbg水溶液，mbg水溶液使用均质仪1万转速下分散均匀，搅拌0.5h。迅速加入18.125μl戊二醛溶液，随后倒入24孔板成型，并迅速放入-6℃冰箱中，反应24h后，冷冻干燥得到形状记忆海绵，即冷冻凝胶海绵qcs/mbg-1(也可称为qcs/mbg海绵)(根据玻璃加入浓度0％、0.4％、0.8％、1.2％和1.6％，依次记为qcs、qcs/mbg-1、qcs/mbg-2、qcs/mbg-3、qcs/mbg-4)。

四、qcs/mbg海绵的扫描电镜图

将冻干的冷冻凝胶海绵用刀片切成小方块，用导电胶固定在电镜台上，喷金60s，用场发射扫描电镜进行分析，qcs海绵扫描结果见图3a，qcs/mbg海绵扫描结果见图3b和图3c。图3b的海绵孔壁上有大量的mbg存在，且图3c表现出高度互穿的大孔结构，孔径在100-300μm左右。

五、冷冻凝胶海绵的压缩应力应变曲线

将冻干后的冷冻凝胶海绵，制备成直接8mm，高10mm的圆柱状样品，将样品放在动态热机分析仪上，设置压缩应变80％，设置恒定轴心力为18n，图4a是压缩应力应变曲线。

对于压缩应力应变循环曲线，设置压缩应变为80％,压缩速度为10mm/min，图4b是压缩应力应变曲线。

其中，qcs/mbg冷冻凝胶海绵可以经历10次压缩循环后，仍然能够保持稳定的结构。

六、冷冻凝胶海绵的体外溶血性测试

取5ml购买的全血，在3000rpm离心10min，纯化红细胞，纯化步骤重复3次以上，至上清液澄清透明，纯化后的红细胞用pbs稀释到浓度10％。将样品磨碎，制备不同浓度的样品悬浮液，500、1000和2000μg/ml，将800μl的悬浮液和200μl的稀释的红细胞加入到1.5ml是ep管中。然后放入37℃温育1h，随后1000g离心10分钟，将200μl上清液转移到96孔板中，使用酶标仪记录。

其中，pbs作为阳性对照组，去离子水作为阴性对照组。图5是海绵的溶血比结果，所有的冷冻凝胶海绵组溶血比均小于5％,说明冷冻凝胶海绵具有良好的血细胞相容性。

七、冷冻凝胶海绵的体外凝血性能测试

将冷冻凝胶海绵放在塑料培养皿中，提前预热至37℃，将100微升复钙化的全血(每100微升血液含有10微升cacl2,0.2m)滴加在样品表面，在37℃孵育5min后，将不稳定的血栓，使用10mldi溶解，同时在50rpm的摇床上(bg组)，均匀摇晃10min，溶液中的血红蛋白浓度使用酶标仪(microplatereader)在542nm处测得。将100微升全血，滴加在10ml去离子水中，作为对照组。图6为海绵在体外的凝血性能，与对照组纱布和明胶海绵(gs)相比，qcs、qcs/mbg海绵表现出良好的体外止血性能。

八、冷冻凝胶海绵对l929细胞增值性测试

使用完全培养基浸泡冷冻凝胶海绵，过滤后得到1mg/ml的浸提液；将10000细胞/孔的l929细胞种在48孔板中，37℃培养24小时，24小时后将不同浓度的浸提液取代之前加入的全培，在培养24小时后，移除浸提液，加入cck-8工作液，使用酶标仪测其在450nm处的吸光度。其中，对照组为全培培养基。图7为细胞增殖结果。

含有生物活性玻璃的冷冻凝胶海绵od值在1天和3天的结果中均显著大于对照组。说明，生物活性玻璃的存在是有利于l929细胞在体外的增殖。

实施例2

与实施例1不同的是本实施例取6g壳聚糖于216mldw中，然后加入1％(v/v)的冰乙酸搅拌使壳聚糖充分溶于水，再加入18ggtmac，升温至55℃，反应18h。然后，4500rpm离心30min，离心后取出倒入预冷的丙酮中粗提纯，将提纯后的产物溶于水，使用8000-14000da的透析袋透析3d，进一步提纯产物。冻干后，即得到接枝率46％的产物。

mbg使用乙酸乙酯-溴化十六烷基三甲胺-水微乳液滴合成，将1.4gctab溶解在49.5ml的水中，待完全溶解后加入10mlea，搅拌30min后形成微乳液滴，再加入14ml3m的氨水，搅拌15min后，间隔30min加入7.2mlteos、0.73mltep和5.554gcn，溶液均匀的搅拌4h，清澈的溶液逐渐变得浑浊形成白色沉淀，白色沉淀通过离心收集，并用无水乙醇和去离子水各洗3次，然后样品在60℃烘箱中干燥24h，在650℃空气中煅烧3h。得到粒径为300nm、介孔孔径20nm的介孔生物活性玻璃纳米颗粒。

将696mgqcs溶于12.5ml去离子水中，剧烈搅拌至qcs完全溶解，随后加入2.5ml浓度为4.8％的mbg水溶液，mbg水溶液使用均质仪2万转速下分散均匀，搅拌2h。迅速加入725μl戊二醛溶液，随后倒入24孔板成型，并迅速放入-198℃冰箱中，反应24h后，冷冻干燥得到形状记忆海绵，即冷冻凝胶海绵(也可称为qcs/mbg海绵)(根据玻璃加入浓度0％、0.4％、0.8％、1.2％和1.6％，依次记为qcs、qcs/mbg-1、qcs/mbg-2、qcs/mbg-3、qcs/mbg-4)。

以上所述实施例只为本发明之较佳实施例，并非以此限制本发明的实施范围，故凡依本发明之形状、原理所作的变化，均应涵盖在本发明的保护范围内。

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