一种黄瓜氮系统信号敏感度评价方法与流程

本发明涉及黄瓜种质评价方法技术领域，特别涉及一种黄瓜氮系统信号敏感度评价方法。

背景技术：

氮系统信号为在硝态氮分布不均匀的异质环境中，植物存在一种涉及地上部和根系交流的信号途径，促进硝态氮含量丰富一侧的根系的生长，抑制硝态氮含量缺乏一侧根系的生长。研究者观察到拟南芥野生型和某些基因缺失的拟南芥突变体相比表现出不同的氮系统信号敏感性。有研究者以拟南芥为材料，将拟南芥通过固体培养基培养后，利用分根实验模拟土壤中硝态氮含量分布不均匀的生长环境，发现其能够促进硝态氮含量丰富区域中根系的生长，激发由根到地上部再到根的氮系统信号。也有研究者对拟南芥tcp20突变体进行分根实验，发现在氮异质条件下，tcp20突变体丧失了促进硝态氮含量丰富一侧根系生长的能力，即高硝态氮一侧的根系长度和低硝态氮一侧的根系长度没有明显差异。

黄瓜(cucumissativusl.)是我国设施栽培的主要作物，对氮素的依赖性大，长期过量施氮造成土壤中氮素分布不均匀的问题比较突出，影响了黄瓜产业的健康发展。筛选对氮系统信号敏感的种质，对于提高黄瓜对硝态氮异质环境的适应性以及氮利用率都有积极的作用，有利于黄瓜产业的发展。但是目前关于氮系统信号的研究主要集中在植株较小的模式作物拟南芥中，且实验方法为利用固体培养基进行分根研究。黄瓜苗植株相对于拟南芥较大，也不适用固体培养基的培养方法，固体培养基不利于快速准确地测定根系长度。拟南芥研究虽然涉及到氮系统信号敏感性，但未提出具体的的敏感度评价指标，不能为黄瓜种质的筛选提供技术启示。

因此，建立一种黄瓜氮系统信号评价体系，筛选出在硝态氮异质环境下适应性强的黄瓜种质材料，能有效促进黄瓜产业的发展，对于挖掘植物参与氮营养系统信号调控途径的关键基因也有重要意义。

技术实现要素：

基于此，本发明提供了一种黄瓜氮系统信号敏感度评价体系，筛选出在硝态氮异质环境下适应性强的黄瓜种质材料。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种黄瓜氮系统信号敏感度评价方法，包括以下步骤：

黄瓜苗的培养：用第一营养液水培至黄瓜幼苗的子叶展平；

剪主根：剪断主根，仅留取3～4cm主根，剪后继续水培3天，侧根生长；

消耗黄瓜苗内的硝态氮：将所述第一营养液更换成第二营养液，所述第二营养液中不含硝态氮；培育3天，消耗黄瓜苗中的硝态氮；

对黄瓜苗进行硝态氮异质环境处理：将同一株黄瓜苗的侧根均分成两部分，分别用第三营养液和第四营养液培育4～7天；所述第三营养液和第四营养液中硝态氮浓度不同，第三营养液中硝态氮浓度大于第四营养液；

判定黄瓜种质的类型：分别测定在第四营养液中培育的侧根根系总长度sln根系长度和在第三营养液中培育的侧根根系总长度shn根系长度，计算x值，x＝sln根系长度/shn根系长度，判定黄瓜种质氮系统信号敏感类型：x≤0.36时，为敏感型，x≥0.75时，为迟钝型，0.36＜x＜0.75为中间型。

进一步，所述第二营养液成分及浓度为mgso4·7h2o1mm，cacl24mm，kcl10mm，nh4h2po41mm；fenaedta36.7mg/l，h3bo36.2mg/l，cuso4·5h2o0.025mg/l，cocl2·6h2o0.025mg/l，ki0.83mg/l，mnso4·h2o16.9mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，mnso4·7h2o8.6mg/l。

进一步，所述第三营养液和第四营养液中硝态氮来源于硝酸钾、硝酸钙和硝酸钠中的一种。

进一步，所述第三营养液中硝态氮浓度为20-50mm，所述第四营养液中硝态氮浓度为0-5mm。

进一步，所述硝酸盐为硝酸钾。

进一步，所述第三营养液的硝态氮浓度为20mm，第四营养液中硝态氮浓度为0.1mm。

进一步，所述第三营养液的大量、中量营养元素成分及浓度为mgso4·7h2o1mm，cacl24mm，kno320mm，ca(h2po4)2·h2o0.5mm；所述第四营养液的大量、中量营养元素成分及浓度为mgso4·7h2o1mm，cacl24mm，kno30.1mm，ca(h2po4)2·h2o0.5mm，kcl19.9mm；所述第三营养液和第四营养液微量元素成分及浓度相同：fenaedta36.7mg/l，h3bo36.2mg/l，cuso4·5h2o0.025mg/l，cocl2·6h2o0.025mg/l，ki0.83mg/l，mnso4·h2o16.9mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，mnso4·7h2o8.6mg/l。

进一步，所述第一营养液、第二营养液、第三营养液和第四营养液均用koh调节ph值至5.8-6.0。

进一步，所述黄瓜苗的培育条件为白天温度25℃，相对湿度50-60％，夜晚23℃，相对湿度80-90％，光照时间10h，光合有效辐射强度90-110μmolm^-2s^-1。

本发明的有益效果是：

提供了一种对黄瓜氮系统信号敏感度评价方法，可以确定黄瓜种质的氮系统信号的敏感类型，筛选出氮系统信号敏感度高的黄瓜种质。

附图说明

图1为本发明对黄瓜幼苗进行硝态氮异质环境和硝态氮同质环境处理实验示意图；

图2为本发明黄瓜幼苗培育过程；

图355种黄瓜种质氮系统信号敏感度鉴定结果；

图4实施例和对比例培育的黄瓜根系检测结果。

具体实施方式

本发明中的黄瓜种质9930来源于华中农业大学园艺林学学院。其余黄瓜种质均为黄瓜重测序种质，来源于中国农科院蔬菜花卉研究所。

黄瓜苗的培育在华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室人工气候室中完成，环境条件为：昼温25℃，相对湿度50-60％，夜温23℃，相对湿度80-90％，光照时间10h，光合有效辐射强度90-110μmolm^-2s^-1。

选用55种黄瓜种质进行了氮系统信号敏感度测定，分十一批次进行种植，每批次均以种质9930作为对照。55种黄瓜种质的氮系统信号敏感度测定方法如下：

s1，黄瓜苗的培养

种子消毒及催芽：选取籽粒饱满的黄瓜种子，在浓度为0.1％的高锰酸钾溶液中浸泡15min后，流水冲洗尽量洗净种子表面的高锰酸钾溶液，然后55-60℃的温水浸泡，将种子平铺于湿润的纱布上，放置培养皿中，28℃恒温催芽。待胚根露出2-3cm时，将种子播种在置于水培盆上方打好孔的黑色泡沫板上，每个水培盆播种40-50粒，播好后在种子上方覆盖一层黑色泡沫板用于遮光和保湿。每个水培盆中盛放有6l用koh将ph调至5.8-6.0的第一营养液，成分及浓度如表1和表2。用小型气泵对营养液进行加氧通气，每隔一个小时通气一次。培育至黄瓜幼苗的子叶展平。

表1第一营养液大、中量元素成分及浓度

表2第一、二、三、四营养液微量元素成分及浓度

s2，剪主根

待黄瓜幼苗的子叶展平后，用剪刀将幼苗的主根剪断，残留的主根长度控制在3-4cm，剪根时不伤害到黄瓜幼苗的侧根。剪根后继续水培3天，侧根生长。

s3，消耗黄瓜苗内的硝态氮

将水培盆中的第一营养液更换成第二营养液，第二营养液中的氮为铵态氮，不含硝态氮。第二营养液大、中量元素成分及浓度如表3，微量元素成分及浓度如表2。第二营养液用koh将营养液ph调至5.8-6.0。每个水培盆中加入6l第二营养液，用小型气泵对营养液进行加氧通气，每隔一个小时通气一次。将黄瓜苗在第二营养液中培育3天，使黄瓜苗苗体内的硝态氮消耗完。

表3第二营养液大、中量元素成分及浓度

s4，对黄瓜苗进行硝态氮异质环境处理

将同一植株的根系分为两部分，一侧根系于第三营养液中培养(shn，splitrootinhighnitratenitrogenconcentration)，另一侧根系于第四营养液培养(sln，splitrootinlownitratenitrogenconcentration)。第三营养液的营养液大、中量元素及浓度如表4，微量元素及浓度见表2。第四营养液的营养液大、中量元素及浓度如表5，微量元素及浓度见表2。培养4天。

硝态氮异质环境处理实验的示意图见图1.将黄瓜苗进行硝态氮异质环境处理4天。

表4第三营养液大、中量元素成分及浓度

表5第四营养液大、中量元素成分及浓度

s5，判定黄瓜种质的类型；

随机选取长势一致的黄瓜幼苗10棵测定根系长度，取平均值。将植株放入la-s加拿大regent公司生产的根系扫描仪中，加入去离子水至没过根系，将重叠在一起的根系分开使根系尽量充分展开。将根系扫描仪的范围调至根系范围，通过应用系统winrhizo软件扫描得到图片并分析得到根长等数据。

在第四营养液中培育的黄瓜根系长度简称为sln根系长度，在第三营养液中培育的黄瓜根系长度简称为shn根系长度，计算x，x＝sln根系长度/shn根系长度。

55种黄瓜种质的鉴定结果见图3。

对x值进行统计分析，每一批次均以黄瓜9930种质作为对照。各批次9930种质实验数据的稳定性，可作为整个鉴定实验体系是否稳定性的依据，结果如图3a所示，十一批次9930种质x值均在0.43～0.53之间且无显著性差异，表明各批次之间实验误差较小，实验体系较为稳定。

对55份黄瓜种质的氮系统信号敏感度评价结果如图3b，55份种质的x平均值为0.5398，大部分种质的x值在0.36～0.75之间，只有个别种质的x值低于0.36或高于0.75。有5个种质的x值低于0.36，将这5个种质命名为氮系统信号敏感型种质，这5个氮系统信号敏感型种质分别为种质9、种质33、种质47、种质17和种质31，其中种质9最为敏感，评价指标值最小。有5个种质的评价指标值高于0.75，将这5个种质命名为氮系统信号迟钝型种质。这5个氮系统信号迟钝型种质分别为种质5、种质6、种质24、种质15和种质23，其中种质23最为迟钝，评价指标值最大。

因此，根据55种黄瓜种质的评价结果，确定黄瓜种质的氮系统信号敏感度评价指标，x≤0.36时，为敏感型，x≥0.75时，为迟钝型，0.36＜x＜0.75为中间型。

实施例1

s1，黄瓜苗的培养

种质9种子消毒及催芽：选取籽粒饱满的黄瓜种子，在浓度为0.1％的高锰酸钾溶液中浸泡15min后，流水冲洗尽量洗净种子表面的高锰酸钾溶液，然后55-60℃的温水浸泡，将种子平铺于湿润的纱布上，放置培养皿中，28℃恒温催芽。待胚根露出2-3cm时，将种子播种在置于水培盆上方打好孔的黑色泡沫板上，每个水培盆播种40-50粒，播好后在种子上方覆盖一层黑色泡沫板用于遮光和保湿。每个水培盆中盛放有6l用koh将ph调至5.8-6.0的第一营养液，其营养液成分及浓度如表1和表2。用小型气泵对营养液进行加氧通气，每隔一个小时通气一次。培育至待黄瓜幼苗的子叶展平。

s2，剪主根

待黄瓜幼苗的子叶展平后，用剪刀将幼苗的主根剪断，残留的主根长度控制在3-4cm，剪根时不伤害到黄瓜幼苗的侧根。剪根后继续水培3天，侧根生长。

s3，消耗黄瓜苗内的硝态氮

将水培盆中的第一营养液更换成第二营养液，第二营养液中的氮为铵态氮，不含硝态氮。第二营养液大、中量元素成分及浓度如表3，微量元素成分及浓度如表2。第二营养液用koh将营养液ph调至5.8-6.0。每个水培盆中加入6l第二营养液，用小型气泵对营养液进行加氧通气，每隔一个小时通气一次。将黄瓜苗在第二营养液中培育3天，使黄瓜苗体内的硝态氮消耗完。

s4，对黄瓜苗进行硝态氮异质环境处理

将同一植株的根系分为两部分，一侧根系于第三营养液中培养，另一侧根系于第四营养液培养。第三营养液的营养液大、中量元素及浓度如表4，微量元素及浓度见表2。第四营养液的营养液大、中量元素及浓度如表5，微量元素及浓度见表2。培养4天。

s5，判定黄瓜种质氮系统信号敏感度类型；

随机选取长势一致的黄瓜幼苗10棵测定根系长度，取平均值。测定sln根系长度和shn根系长度，计算x值。

对比例1h

对比例1h同实施例1，但在步骤s4中未对黄瓜苗进行硝态氮异质环境处理，而是将同一植株分根于第三营养液中中培育。

对比例1l

对比例1l同对比例1h，但在第四营养液中培育。

图4中a、b分别为实施例1、对比例1h和对比例1l的根系形态及根系长度图。a中显示了三种根系形态，从左到右依次为对比例1h，实施例1和对比例1l的根系形态图。b中从左到右依次为对比例1h的黄瓜幼苗根系总长度(totalrootlength)柱状图hn，实施例1中在高浓度硝态氮(第三营养液)中培育的黄瓜幼苗的根系总长度柱状图shn，在低浓度硝态氮(第四营养液)中培育的黄瓜幼苗的根系总长度柱状图sln，对比例1l的黄瓜幼苗根系总长度柱状图ln。

从a中可以看出，在同质硝态氮条件，无论硝态氮浓度高低，黄瓜种质9幼苗两部分侧根根系形态和根系长度之间并没有的明显差异，二者的根系总长度hn和ln均在110cm左右。说明在同质硝态氮条件下，硝态氮浓度对种质9的根系长度并没有明显影响。但在异质硝态氮条件下，两侧根系形态和长度都产生了明显区别，在低浓度硝态氮(第四营养液)一侧培育的侧根长度sln明显小于高浓度硝态氮(第三营养液)一侧侧根长度shn，二者比值x为20.83％，小于36％，属于氮系统信号敏感型黄瓜种质。

实施例2

实施例2同实施例1，但采用的是黄瓜种质9930。

对比例2h

对比例2h同对比例1h，但采用的是黄瓜种质9930。

对比例2l

对比例2l同对比例1l，但采用的是黄瓜种质9930。

图4中c、d分别为实施例2、对比例2h和对比例2l的根系形态及根系长度图。c中显示了三种根系形态，从左到右依次为对比例2h，实施例2和对比例2l的根系形态图。c中从左到右依次为对比例2h的黄瓜幼苗根系总长度柱状图hn，实施例2中在高浓度硝态氮(第三营养液)中培育的黄瓜幼苗的根系总长度柱状图shn，在低浓度硝态氮(第四营养液)中培育的黄瓜幼苗的根系总长度柱状图sln，对比例2l的黄瓜幼苗根系总长度柱状图ln。

从c中可以看出，在同质硝态氮条件下，黄瓜种质9930幼苗在硝态氮浓度为0.1mm一侧反而更发达，根系总长度约180cm，在硝态氮浓度为20mm的根系总长度约120cm。说明在同质硝态氮下，硝态氮浓度也会对根系长度产生影响，x值为45.91％，大于36％，小于75％，属于中间型。

实施例3

实施例3同实施例1，但采用的是黄瓜种质23。

对比例3h

对比例3h同对比例1h，但采用的是黄瓜种质23。

对比例3l

对比例3l同对比例1l，但采用的是黄瓜种质23。

图4中e、f分别为实施例3、对比例3h和对比例3l的根系形态及根系长度图。e中显示了三种根系形态，从左到右依次为对比例3h，实施例3和对比例3l的根系形态图。f中从左到右依次为对比例3h的黄瓜幼苗根系总长度柱状图hn，实施例3中在高浓度硝态氮(第三营养液)中培育的黄瓜幼苗的根系总长度柱状图shn，在低浓度硝态氮(第四营养液)中培育的黄瓜幼苗的根系总长度柱状图sln，对比例3l的黄瓜幼苗根系总长度柱状图ln。

从图中可以看出，在同质硝态氮条件下，硝态氮浓度对黄瓜种质23的根系基本没有影响，硝态氮浓度为0.1mm和20mm条件下培育出的黄瓜幼苗根系形态和根系长度基本相同。在异质硝态氮条件下，x值为91.58％，大于75％，属于迟钝型。

从上述实施例1～3，和对比1h～3h，1l～3l可以看出，用本发明的方法能够有效区分出黄瓜种质对氮系统信号不同的敏感程度，可判断出黄瓜种质是氮系统信号敏感型、中间型还是迟钝型，提供了一种评价黄瓜种质对氮系统信号敏感性的方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，采用并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除