一种检测根际微生物对植物生长及根系发育影响的实验体系及其应用的制作方法

本发明涉及一种研究植物与根际微生物相互作用的实验体系，尤其涉及一种检测根际微生物对植物生长及根系发育影响的实验体系及其应用。属于农业生产技术及应用领域。

背景技术：

根际是指植物根系周围，受根系影响的微域土区。植物的根系能够向其土壤周围分泌大量的糖类、氨基酸、有机酸等多种有机物(badriandvivanco2009)，而这些有机物能够招募和促进微生物在植物根际生长与繁殖(dakoraandphillips2002；dennis,milleretal.2010)。其中，根际细菌是植物根际微生物的主要组成部分，研究发现，植物的根际富含着比周围土区数量更为丰富的根际细菌，其中，变形杆菌门、放线菌门、拟杆菌门以及厚壁菌门是根际细菌的主要组成部分(gong,xiongetal.2020)。

根际细菌通过各种途径促进植物的生长发育，这些对植物生长具有帮助的细菌又被称为根际益生菌(plantgrowth-promotingrhizobacteria,pgpr)(lugtenbergandkamilova2009)。比如，一些根际益生菌可以通过合成生长素或其它具有促生长活性的物质，激活植物的生长素信号通路，进而促进植物根系发育(ortiz-castro,diaz-perezetal.2011；sukumar,legueetal.2013)。也有报道表明，细菌释放的挥发性物质比如2，3-丁二醇促进植物生长及根系发育(ryu,faragetal.2003；zhang,kimetal.2007；zamioudis,mastranestietal.2013)。然而，传统的实验方法通常用二分格的培养皿，一半用固体1/2ms培养基培养植物，一半用固体lb培养基培养细菌，或者直接在含有1/2ms培养基的培养皿里培养5天的幼苗，并在其根的下方(不直接接触植物的根系)接菌培养，观察根际微生物对植物生长发育的影响。

然而，这种体系在近年来受到很多的质疑(piechullaandschnitzler2016；piechulla,lemfacketal.2017)。piechulla认为，在密闭的体系中，细菌呼吸作用产生的co2可能是微生物促进植物生长的主要因素。研究者发现，根际细菌serratiaodorifera能够在密封的二分格的培养皿中促进植物生长，然而，在加入co2吸收剂ba(oh)2后，s.odorifera对植物的促生长效果明显减弱了，暗示很可能细菌释放的co2促进了植物的生长。他们进一步检测密封的二分格系统中的co2水平，发现在细菌与植物共培养的培养皿中的co2含量要比只有植物培养的二分格培养皿中高十倍，因此他们认为，在封闭的二分格培养皿中，细菌呼吸作用产生的co2是促进植物生长的主要物质(kaiandpiechulla2009)。当然，这个观点也遭到很多研究者的否认，他们认为co2可能会影响到植物生长，但并不是主要的促进植物生长的因素，其主要促进植物生长的挥发性物质可能是2，3-丁二醇等有机物(chung,songetal.2016；sharifiandryu2018)，原因主要有三：首先，co2能够促进植物生长，但是这种促进效果往往不会超过两倍，但是根际益生菌的促生效果甚至能达到6倍(blom,fabbrietal.2011a)；其次，很多关于在二分格培养皿中的细菌促生实验用的是透气材料封口，并不是完全封闭的，co2可能并不会在培养皿中大量积累(blom,fabbrietal.2011a)。再次，即使加入ba(oh)2，加入根际益生菌的的二分格培养皿中的植物也明显比对照长的好，表明除co2外，可能还有其它挥发性物质起到促进植物生长的效果(sharifiandryu2018)。

生长素是调控植物生长发育的重要激素，几乎参与植物生长发育的各个方面，具有促进植物细胞伸长，促进植物生长的作用，能够调控植物的向性反应，植物器官发育，根及植物地上部分的形态(woodwardandbartel2005)。然而，高浓度的生长素也会抑制植物生长。在植物的根系发育中，生长素能够明显的促进植物侧根的增加。有研究发现将人工合成的响应生长素启动子元件dr5(directrepeat5)接上β-glucuronidase(gus)报告基因,通过gus染色可以指示生长素的水平(ulmasov,murfettetal.1997)。生长素在植物中可以通过多种途径合成，但目前研究比较清楚的是色胺酸依赖的生长素合成途径(won,shenetal.2011)。除植物之外，一些细菌也能够利用色氨酸为底物合成生长素，如假单胞杆菌属菌株病原菌pseudomonassyringaetomatodc3000(mcclerklin,leeetal.2018)；根际益生菌绿针假单胞杆菌(pseudomonaschlororaphiso6)和粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)均能够合成生长素，促进植物生长(kang,yangetal.2006)。然而，鉴定细菌能否合成生长素通常所用的液相色谱检测，对实验设备要求高，普通实验室难以实现操作，实验操作较繁琐，而且花费较大。经检索，有关利用检测根际微生物对植物生长及根系发育影响的实验体系判断根际微生物对植物生长及根系发育是否具有促进效果，以及判断根际微生物能否合成生长素的应用鲜见报道。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种检测根际微生物对植物生长及根系发育影响的实验体系及其应用。

本发明所述的检测根际微生物对植物生长及根系发育影响的实验体系，其特征在于：所述实验体系是以二分格培养皿为实验模具，将生长5±1天的无菌拟南芥幼苗转移至该二分格培养皿中的1/2ms固体培养基(不含蔗糖)上，其中一格的幼苗根系上直接接种根际细菌菌液，另一格的幼苗为对照，不接菌但加入与菌液等量的无菌水；所述二分格培养皿用透气的压敏胶带封口，于22±1℃光照培养箱中竖直放置，在光周期为16小时光照/8小时黑暗的条件下继续培养4-6天；通过观察测量植株地上部分的幼苗，主根的长度，统计侧根的密度判断接种的微生物能否促进植物生长及根系发育，当接菌后结果显示能够促进植物生长或促进植物根系发育，侧根发生，则表明该细菌对植物生长可能具有帮助作用，初步判断为益生菌；反之，如果接菌后抑制植物生长，则初步推断该细菌为病原菌；若以同样实验体系采用拟南芥幼苗选择转基因拟南芥dr5::gus幼苗，二分格培养皿中的培养基选择含有色胺酸但不含蔗糖的1/2ms固体培养基，将培养后的拟南芥幼苗进行gus染色，观察着色情况，当结果显示接菌后能够明显抑制主根伸长、促进植物侧根密度的增加，并且dr5::gus表达水平明显升高，促进gus染色的程度的增加，则初步推断该细菌具有色氨酸依赖的生长素合成通路，可能依赖色氨酸合成生长素。

上述的检测根际微生物对植物生长及根系发育影响的实验体系中：所述根际细菌菌液是细菌或真菌，其菌液的od值为0.02-0.2。

本发明所述检测根际微生物对植物生长及根系发育影响的实验体系在判断微生物能否促进植物生长及根系发育中的应用。

基于上述的检测根际微生物对植物生长及根系发育影响的实验体系，利用该实验体系判断微生物能否促进植物生长及根系发育的操作时，拟南芥幼苗选择拟南芥野生型幼苗col-0，二分格培养皿中的培养基选择不含蔗糖的1/2ms固体培养基，接种的根际细菌选择根际益生菌沙雷氏菌属(serratia)的粘质沙雷氏菌(s.marcescens)，该菌落用无菌水重悬制成od值为0.02-0.2的菌液，菌液直接浸蘸到幼苗的根系上；通过观察测量植株地上部分的幼苗，主根的长度，统计侧根的密度判断接种的微生物能否促进植物生长及根系发育，当接菌后结果显示能够促进幼苗生长或促进主根发育，侧根发生，则表明该细菌对植物生长具有帮助作用，能够促进植物生长及根系发育。

本发明所述的检测根际微生物对植物生长及根系发育影响的实验体系在鉴定微生物是否具有色氨酸依赖的生长素合成途径中的应用。

基于上述的检测根际微生物对植物生长及根系发育影响的实验体系，利用该实验体系鉴定微生物是否具有色氨酸依赖的生长素合成途径的操作时，拟南芥幼苗选择转基因拟南芥dr5::gus幼苗，二分格培养皿中的培养基选择含有50μm色胺酸但不含蔗糖的1/2ms固体培养基，接种的根际细菌选择根际益生菌沙雷氏菌属(serratia)的粘质沙雷氏菌(s.marcescens)，该菌落用无菌水重悬制成od值为0.02-0.2的菌液，菌液直接浸蘸到幼苗的根系上；通过观察测量植株地上部分的幼苗，主根的长度，统计侧根的密度判断接种的微生物能否促进植物生长及根系发育，接菌后结果显示能够明显抑制主根伸长，促进侧根密度的增加，表现为类似高浓度生长素处理的表型；另外，将培养后的拟南芥dr5::gus幼苗进行gus染色，观察着色情况，当结果显示能够促进植物侧根密度的明显增加，dr5::gus表达水平明显升高且促进gus染色的程度的增加，则初步推断该细菌具有色氨酸依赖的生长素合成通路，可能依赖色氨酸合成生长素。

本发明公开了一种检测根际微生物对植物生长及根系发育影响的实验体系以及利用该实验体系判断根际微生物对植物生长及根系发育是否具有促进效果，以及判断根际微生物能否合成生长素的应用。本发明所述的实验体系具有以下优点：1、可以减少co2缺陷的影响；2、使对照与接菌处理在同一个气体体系下，避免了挥发性气体的影响；3、将根际细菌直接接种至幼苗的根系上，能够较好的模拟植物与微生物互作的状态；4、可以直接观察根际细菌对植物根系发育的影响。5、能够利用较低的成本初步判断根际细菌能否合成生长素。本发明的实验体系及实施将有助于对促进植物生长及根系发育的根际微生物筛选及应用，对于农业生产及微生物发掘具有重要的价值。

附图说明

图1.本发明所述检测根际微生物对植物生长及根系发育影响的实验体系示意图。

其中二分格培养皿用透气的压敏胶带封口，所用培养基为1/2ms固体培养基，将生长5天的拟南芥幼苗等量的转移至二分格培养皿中，其中一格的幼苗在其根系上直接浸蘸菌液处理，另一格用等量的无菌水处理。

图2.分别在新的体系中用根际益生菌s.marcescens(a)病原菌pstdc3000(b)接种生长5天的拟南芥幼苗，继续共培养5天的拟南芥表型图。

图3.应用本发明所述检测根际微生物对植物生长及根系发育影响的实验体系判断根际细菌能否合成生长素的方法及结果。

(a)将5天的拟南芥幼苗dr5::gus转移至含有色氨酸的1/2ms培养基上，接种根际益生菌s.marcescens共培养5天后，观察植株表型，并与对照(control)比较。(b)dr5::gus转基因植株的gus染色结果及对照。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。

实施例1：利用本发明的实验体系验证细菌包括根际益生菌和病原菌对植物生长及侧根发育的作用。

为了排除co2和其它挥发性物质的影响，研究根际细菌对植物生长或侧根发育的影响，本发明在以前实验的基础上设计了一种检测根际微生物对植物生长及根系发育影响的实验体系：即以二分格培养皿为实验模具，将生长5±1天的无菌拟南芥野生型(col-0)幼苗转移至该二分格培养皿中的不含蔗糖的1/2ms固体培养基上，其中一格的幼苗根系上直接接种根际细菌菌液，另一格的幼苗为对照，不接菌但加入与菌液等量的无菌水；所述二分格培养皿用透气的压敏胶带封口，于22±1℃光照培养箱中竖直放置，在光周期为16小时光照/8小时黑暗的条件下培养5天；

其中，上述根际细菌菌液分别选取能够合成生长素能够促进植物侧根发育的根际益生菌沙雷氏菌属(serratia)的粘质沙雷氏菌(s.marcescens)和能够合成生长素但是抑制植物生长的非寄主病原菌突变体丁香假单胞菌番茄致病变种(pseudomonassyringaepv.tomatodc3000，pstdc3000)。

上述无菌拟南芥野生型(col-0)幼苗的培养制备:

a1将50-500粒拟南芥种子置于1.5mlep管，加入1ml1％次氯酸钠水溶液，悬起，放置10-30分钟。

a2,弃次氯酸钠水溶液，加入1ml无菌水，重悬，洗涤。

a3弃无菌水，重复a2-a3，3-5次。

a4将种子用无菌枪头均匀点播至含1％蔗糖的1/2ms固体培养基上。置于4℃冰箱低温处理2天后，置于22℃光照培养箱(光周期为16小时光照/8小时黑暗)竖直放置，培养4-6天。

上述根际益生菌的培养制备：

划线待实验的根际益生菌菌株至lb培养基，24-28℃培养1-3天，待长出菌落即可用于制备菌液，菌液用无菌水调至od值为0.02-0.2。

在幼苗根系上直接接种根际细菌菌液的方法是：吸取0.5微升菌液滴加至二分板一侧格的拟南芥幼苗主根，使菌液直接浸蘸到幼苗的根系上，二分板另一侧格的拟南芥幼苗加等体积的无菌水做对照。

将接菌后的二分板拟南芥幼苗放回培养箱，共培养5天，与不接菌的一侧的对照相比，观察植物的生长情况及根系发育情况。

观察测量植株地上部分的幼苗，主根的长度，统计侧根的密度判断接种的微生物能否促进植物生长及根系发育。

当接菌后结果显示能够促进幼苗生长或促进主根发育，侧根发生，则表明该细菌对植物生长具有帮助作用，能够促进植物生长及根系发育。观察发现在此体系下，根际益生菌s.marcescens能够促进植物根系发育，具体表现为侧根密度的增加。而病原菌pstdc3000处理植物后，植株尽管表现出侧根密度的增加，但是其主根变短，植株变小，其地上部分的生长也受到明显的抑制(图2)。

通过在二分格培养皿体系中分别直接接种根际益生菌s.marcescens和病原菌pstdc3000实验表明，本发明的实验体系可以用来判断一种细菌对植物及根系生长发育的影响。

实施例2：利用本发明的实验体系鉴定微生物是否具有色氨酸依赖的生长素合成途径。

很多根际细菌具有依赖色氨酸的生长素合成途径，合成生长素，促进植物根系发育，进而促进植物对土壤中水分和养分的吸收。为了验证本发明的实验体系能否判断某种细菌具有生长素合成途径，能否合成生长素，本实施例对根际益生菌s.marcescens是否能够合成生长素的情况用该实验系统进行了检测。

方法同实施例1，将生长5天的转基因拟南芥幼苗dr5::gus转移至含有50μmtrp的1/2ms固体培养基上，并按实施例1所述方法接种根际益生菌s.marcescens共培养5天，发现接种s.marcescens的一半的二分格培养基上的拟南芥幼苗与不接菌的一半相比，s.marcescens能够明显抑制主根伸长，促进侧根密度的增加，表现为类似高浓度生长素处理的表型(图3a)。除此之外，对转基因拟南芥dr5::gus染色，发现在接种s.marcescens的dr5::gus表达水平明显升高(图3b)，以上结果暗示s.marcescens能够利用色氨酸合成生长素，在调控植物侧根发育方面发挥着重要作用。

上述gus染色的方法是：

将拟南芥幼苗完全浸没于gus染色液中，避光置于37℃放置染色8-16小时，用75％的乙醇脱色液脱色2-3天，其中中间换2-3次脱色液。

其中gus染色液(100ml)配方为：

结果表明本发明的实验体系结合trp处理可以直接通过拟南芥的侧根表型及显示生长素水平的转基因拟南芥dr5:gus染色而方便快速的判断一种根际细菌能否合成生长素。

实施例3：一种检测根际微生物对植物生长及根系发育影响的实验体系。

上述实验体系是以二分格培养皿为实验模具，将生长5±1天的无菌拟南芥幼苗转移至该二分格培养皿中的培养基上(图1)，其中一格的幼苗根系上直接接种根际细菌菌液，另一格的幼苗为对照，不接菌但加入与菌液等量的无菌水；所述二分格培养皿用透气的压敏胶带封口，于22±1℃光照培养箱中竖直放置，在光周期为16小时光照/8小时黑暗的条件下培养4-6天；通过观察测量植株地上部分的幼苗，主根的长度，统计侧根的密度判断接种的微生物能否促进植物生长及根系发育，当接菌后结果显示能够促进植物生长或促进植物根系发育，侧根发生，则表明该细菌对植物生长具有帮助作用，初步判断为益生菌；反之，如果接菌后抑制植物生长，则初步推断该细菌为病原菌；若以同样实验体系采用拟南芥幼苗选择转基因拟南芥dr5::gus幼苗，二分格培养皿中的培养基选择含有色胺酸但不含蔗糖的1/2ms固体培养基，将培养后的拟南芥幼苗进行gus染色，观察着色情况，当结果显示能够促进植物侧根密度的明显增加，dr5::gus表达水平明显升高且促进gus染色的程度的增加，则初步推断该细菌具有色氨酸依赖的生长素合成通路，可能依赖色氨酸合成生长素。

其中：所述根际细菌菌液是细菌或真菌，其菌液的od值为0.02-0.2。

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