一种提高牡蛎呼吸率稳定性的方法与流程

本发明涉属于贝类生理状态监测领域，具体地说，涉及一种提高牡蛎呼吸率稳定性的方法。

背景技术：

牡蛎是自然分布在潮间带中潮区到潮下带的变温动物，其生理状态极易受环境变化的影响。呼吸率是牡蛎代谢和生理状态的重要指标，也是构建其生理能量模型的重要参数，对牡蛎规模性死亡的预警预报、抗性育种及养殖容量评估等有重要意义。目前静水法是测定牡蛎耗氧率的主流方法，该方法在将牡蛎放入呼吸瓶的过程中可能存在各种环境差异，导致牡蛎产生胁迫反应，进而影响耗氧率测定的准确性。目前已知温度胁迫是牡蛎耗氧率变化的重要影响因素，研究者通常在会测定过程中控制温度差异来减少牡蛎呼吸率测定的波动。而目前贝类呼吸率同时测量的通量较低，且尚无提高牡蛎呼吸率稳定性的监测方法的相关技术报道，这给牡蛎的呼吸率高通量精确测定提出了严峻挑战。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种高通量低成本快速的提高牡蛎呼吸率稳定性的方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种提高牡蛎呼吸率稳定性的方法，将牡蛎于预处理装置中在适宜光照强度下预处理使其趋于稳定，而后将其置于呼吸率测定装置使牡蛎在适宜预处理光照强度、温度进而搅拌下对牡蛎进行驯化，进而使牡蛎的呼吸维持在一个稳定的状态，进而获得牡蛎的准确、稳定的呼吸率。

所述牡蛎预处理为将牡蛎单体以约5-10kg/m³的密度置于盛有过滤海水的暂养容器，保持暂养期与测试期的海水温度及环境光照强度一致，溶解氧保持在8mg/l以上，以2g/m³的标准每12h投喂微藻干粉一次，预处理暂养48-72h。

所述经预处理后的牡蛎置于呼吸率测定装置的呼吸瓶的网架上，保持测试时牡蛎所处的光照强度和温度与暂养期一致，将呼吸瓶放置到恒温水槽中并在下方放置磁力搅拌器，用仪器实时监测呼吸瓶中海水的溶氧浓度变化，消除牡蛎呼吸耗氧的波动性，使牡蛎的呼吸维持在稳定的状态，进而获得牡蛎准确、稳定的呼吸率。

所述预处理和呼吸率测定均放在同一室内房间、相同光照强度、水温下进行；其中，光照强度在200-300lux之间，温度为实验设计的测试温度,即是指预处理驯化和呼吸率测试温度均为实验设计需要的温度，根据不同的测试需求，可进行不同变换，例如：半致死温度、亚致死温度、常温或其他胁迫温度等。

所述预处理后的牡蛎放入呼吸瓶，将呼吸瓶的瓶体和瓶盖完全浸没在暂养容器并灌满海水，然后将待测牡蛎在海水中转移到呼吸瓶的网架上，将呼吸瓶在海水中拧紧瓶盖并保持与地面垂直从暂养容器中取出，待用。

所述装置为预处理装置和呼吸率测定装置，散射光源置于预处理装置和呼吸率测定装置上方；所述预处理装置为暂养容器5内放置牡蛎的网板3，网板3上设有光照强度传感器4，暂养容器5内壁设有控温棒2；所述呼吸率测定装置包括磁旋搅拌器14和其上的水浴控温槽7，水浴控温槽7内至少有一个透明呼吸瓶10，其与溶氧测定仪8通过导线相连，水浴控温槽7两侧分别设有进水孔6和出水孔11。

所述每个透明呼吸瓶10底部设有磁旋转子13，内部设有网架12，并插设光纤溶氧探针9，探针9通过导线与溶氧测定仪8相连。

所述呼吸瓶是容积为500-1000ml透明无色的平底圆柱形塑料瓶，呼吸瓶底部平放磁旋转子，然后放置支撑网架，呼吸瓶顶部开直径为1-2mm的圆孔插入光纤溶氧探针并用兰丁胶密封。

所述支撑牡蛎的网架材料为孔径为0.5-1cm的塑料片，网架为圆柱形，外直径为呼吸瓶内壁的直径，高为2-4cm。

所述牡蛎在预处理装置和呼吸率测定装置中的放置方式为牡蛎水平放置，且左壳朝上，右壳朝下。

本发明所具有的有益效果

本发明利用牡蛎对光照的生理响应，通过在恒温、特定的稳定光照环境下对牡蛎进行快速的光照驯化，使牡蛎适应特定的光照环境，进而使牡蛎维持稳定的呼吸率。本方法较传统只控制水温的静水法测定技术，显著降低了牡蛎个体呼吸率的波动，提高了牡蛎呼吸率测定的稳定性。同时采用本发明方法可以克服牡蛎的呼吸率由于日周期变化的影响，进而使得该方法显著提升牡蛎呼吸率的测量精度。总之，通过本方法可高通量低成本快速抑制牡蛎呼吸率波动，显著提升大批量测定呼吸率的效率和呼吸率的测量精度。

附图说明

图1为本发明实施例提的牡蛎预处理装置和呼吸率测定装置；其中，散射光源1、控温棒2、放置牡蛎的网板3、光照强度传感器4、透明暂养容器5；进水孔6、水浴控温槽7、溶氧测定仪8、光纤溶氧探针9、透明呼吸瓶10、出水孔11、网架12、磁旋转子13、磁旋搅拌器14。

图2a为本发明实施例2提供的48h对照组牡蛎在一天内4个时间点的呼吸率效果图。

图2b为本发明实施例2提供的预处理组牡蛎在一天内4个时间点的呼吸率效果图。

图3a为本发明实施例3提供的72h对照组牡蛎在一天内4个时间点的呼吸率效果图。

图3b为本发明实施例3提供的72h预处理组牡蛎在一天内4个时间点的呼吸率效果图。

图3c为本发明实施例3提供的自然光照条件下牡蛎在一天内12个时间段的呼吸率效果图。

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明采用的技术方案由稳定光源、预处理装置、溶氧测定装置组成，其特征是对贝类进行稳定光源、恒温预处理一定时间后再进行呼吸率的测定，预处理暂养装置为不反射光的透明广口塑料容器和固定于水中放置牡蛎的塑料网板，牡蛎放置时采用左壳朝上，右壳朝下的方式，测定装置中控温槽、呼吸瓶均采用透明材料，呼吸瓶距底部2cm处设置塑料网架，网架下部放磁旋转子，上部放置待测牡蛎，整个预处理和测定过程保持无其他光源的干扰。

本发明利用牡蛎对光照的生理响应，通过在恒温、稳定的光照环境下对牡蛎进行快速的光照驯化，使牡蛎适应特定的光照环境，进而使牡蛎的呼吸率维持在一个稳定的状态。本方法较传统只控制水温的静水法测定技术，显著降低了牡蛎个体呼吸率的波动，提高了牡蛎呼吸率测定的稳定性。本发明可高通量低成本快速抑制牡蛎呼吸率的波动，显著提升牡蛎呼吸率的测量精度，可为牡蛎规模性死亡的预警预报、抗性育种及养殖容量评估等提供重要技术支持。

实施例1：

由图1可见，装置为预处理装置和呼吸率测定装置，散射光源置于预处理装置和呼吸率测定装置上方；所述预处理装置为暂养容器5内放置牡蛎的网板3，网板3上设有光照强度传感器4，暂养容器5内壁设有控温棒2。

所述呼吸率测定装置包括磁旋搅拌器14和其上的水浴控温槽7，水浴控温槽7内容置至少一个透明呼吸瓶10，其与溶氧测定仪8通过导线相连，水浴控温槽7两侧分别设有进水孔6和出水孔11。

所述每个透明呼吸瓶10底部设有磁旋转子13，内部设有网架12，并插设光纤溶氧探针9，探针9通过导线与溶氧测定仪8相连。

所述呼吸瓶是容积为500-1000ml透明无色的平底圆柱形塑料瓶，呼吸瓶底部平放磁旋转子，然后放置支撑网架，呼吸瓶顶部开直径为1-2mm的圆孔插入光纤溶氧探针并用兰丁胶密封。

所述支撑牡蛎的网架材料为孔径为0.5-1cm的塑料片，网架为圆柱形，外直径为呼吸瓶内壁的直径，高为2-4cm。

所述牡蛎在预处理装置和呼吸率测定装置中的放置方式为牡蛎水平放置，且左壳朝上，右壳朝下。

实施例2：

2019年11月在中国科学院海洋研究所贝类活体暂养室，对房间的门窗进行遮光处理。选取健康状况良好的牡蛎，除去外壳表面的附着生物和杂质，以约5-10kg/m³的密度将待测牡蛎左壳朝下放置在盛有常温海水的直径为60cm的圆柱形透明塑料暂养容器中的网板上，将房间内的空调设置为23℃，并在暂养容器中放入控温棒(wk-3000，中科海)设置为23℃，在48h的预处理暂养期间使用气泵持续给水体充气，使溶解氧保持在8mg/l以上，并以2g/m³的标准每12h投喂微藻干粉一次。在暂养容器和测试设备上方分别设置相同功率的同型号的led光源，在暂养牡蛎附近和恒温水浴槽的呼吸瓶中放置光照强度传感器(hoboua-002-64pendanttemp/light，onsetcomputercorp)检测，调整光源位置使两者的光照强度为240lux，且保持一致。

在预处理48h后，随机选取6个牡蛎，实时监测在一天内的8:30,11:30，15:30和19:00这4个时间(每个时间点测定1.5h)的溶氧值。随机挑选部分同批未进行预处理的牡蛎作为对照组，在恒温自然光照下测定一天内相同4个时间点呼吸率的变化。呼吸率测定方法如下：

将磁旋转子放入呼吸瓶中网架下方，装入海水，把待测牡蛎以固定姿势放置在呼吸瓶的网架上，盖紧瓶盖，整个过程在暂养容器的水体下进行。然后将呼吸瓶放置在磁旋搅拌器上方的透明恒温水槽中控温为23℃，磁旋搅拌器转速设置为200r/min，均匀搅动呼吸瓶内水体，将光纤溶氧测定探针从呼吸瓶顶端插入呼吸瓶，用兰丁胶将插口处密封，溶氧测定仪(oxy-10stprototype,presensprecisionsensinggmbh,germany)每3s读取一次呼吸瓶中溶氧，测定过程中保持稳定光源照射，无其他光源干扰。

计算呼吸率时，取1h的1200次稳定数据进行拟合，得到拟合线极其方程式，呼吸率计算如下：

or＝k·v/w；式中or为呼吸率(mg/l·g·h)，k为拟合线斜率，v为呼吸瓶容积(l),w为牡蛎软体组织重量(g)。

结果如图2所示，经48h预处理后，4个时间点的呼吸率均值为：0.000071±0.000004，变异率为：5.85％，极差为：0.00001，差异不显著；而未经预处理的牡蛎在4个时间点的呼吸率均值为：0.000144±0.00003，变异率为：20.53％极差为：0.000063，差异显著(p<0.05)。表明预处理的过程改变了牡蛎呼吸率波动的趋势。

实施例3：

2020年6月在中国科学院海洋研究所贝类活体暂养室，房间遮光处理后。选取健康状况良好的牡蛎，除去外壳表面的附着生物和杂质，用实施例1中的同等设备和条件对本批次牡蛎进行预处理，在预处理72h后，随机选取处理后的6只牡蛎，控光条件下实时监测在一天内的8:30,11:30，15:30和19:00这4个时间(每个时间点测定1.5h)的呼吸率值(参见图3a)。

随机挑选6只同批未进行预处理的牡蛎，实时检测其在同等设备和同等光照条件下4个相同时间点的耗氧值，作为本实施例的对照组(参见图3b)。

将上述贝类活体暂养室房间未作任何遮光处理，选取健康状况良好的近似大小的个体，除去壳表面附着的生物和杂质，不做任何光处理，在自然光下恒温20℃暂养48h后，挑选18个个体，分成三组，每组6只个体，分别测定了每组的每只个体在正常光照条件下一天24h内12个时间段的呼吸率变化趋势(参见图3c)。

结果如图3c所示，在正常未进行光照控制处理的条件下，18只长牡蛎在自然光照条件下的耗氧率均显示出显著的日周期变化。其中，日间耗氧率的变化范围较夜间更显著，白天波动更大，在正午时达到峰值；在夜间，它倾向于在一个小范围内连续波动。

结果如图3所示，在经72h预处理后，4个时间点的呼吸率均值为：0.000064±0.000006，变异率为：8.86％，极差为：0.000013，差异不显著；而未经预处理的牡蛎直接在同等环境条件下测得的4个时间点呼吸率均值为：0.0000316±0.000144，变异率为：45.71％，极差为：0.000311，差异显著(p<0.05)；此外，未经光照处理组的18只牡蛎在自然光照条件下的耗氧率均显示出显著的日周期变化。其中，日间耗氧率的变化范围较夜间更显著，白天波动更大，在正午时达到峰值；在夜间，它倾向于在一个小范围内连续波动。以上结果表明本方法使牡蛎的呼吸率变得稳定，进而可见采用本发明方法克服牡蛎的呼吸率由于日周期变化的影响，进而使得该方法显著提升牡蛎呼吸率的测量精度。

上述仅为发明的具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除