一种槐蕾茶抗冠状病毒肺炎的靶点筛选方法与流程

2021-01-08 11:01:49|

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本发明属于医药技术领域，具体涉及一种槐蕾茶抗冠状病毒肺炎的靶点筛选方法。

背景技术：

自2019年12月以来，新型冠状病毒(sars-cov-2)引起的新型冠状病毒肺炎(covid-19)在全球相继爆发，截至9月25日全球新冠肺炎确诊病例达32110656例，死亡病例980031例。新冠肺炎潜伏期中位数约为5.1天，常见症状有发烧，咳嗽，乏力，呼吸困难，肌痛，头痛和腹泻等。胸部ct扫描显示的最常见临床特征为在两个肺的胸膜下区域观察到多个外周毛玻璃样混浊，目前仍无针对covid-19的特效药及疫苗。

sars-cov-2属于β型冠状病毒，与sars、mars基因同源性较高，新型冠状病毒3cl水解酶(3clpro)在病毒复制过程中能将病毒复制酶多聚蛋白切割成必须的功能蛋白。病毒的外层刺突蛋白(spike-蛋白)经宿主细胞弗林样蛋白酶或蛋白酶tmspss2等切割激活，与其在细胞表面的受体ace2结合，启动由ace2介导的病毒进入细胞的过程。木瓜样蛋白酶(plpro)在冠状病毒复制中起着重要作用。因此，以新型冠状病毒3cl水解酶，spike-蛋白、ace2及木瓜样蛋白酶为covid-19的治疗靶点进行药物筛选具有重要意义。

数千年来，中医药在防治流行病中拥有举足轻重的地位。中药在干预covid-19中取得良好疗效，其中连花清瘟胶囊与金花清感颗粒在治疗轻症患者中疗效确切。槐花为豆科植物槐sopphorajaponical.的干燥花及花蕾，前者习称槐花，后者习称槐蕾。槐蕾味苦，性微寒，归肝、大肠经。凉血止血，清肝泻火，用于便血，痔血，血痢，吐血，衄血，肝热目赤，头痛眩晕等。我国卫生部2002年将其列在“既是食品又是药品的物品名单”中。槐蕾茶主料为槐蕾，辅料为干大枣、干枸杞和蜂蜜。网络药理学通过“化学成分-靶点-疾病”复杂网络分析，能很好地与中医理、法、方、药理论相结合，有望成为中西医结合的新桥梁。分子对接技术通过特定靶点与配体的化学结合作用，达到辅助分析活性成分的作用。

技术实现要素：

针对上述问题本发明提供了一种槐蕾茶抗冠状病毒肺炎的靶点筛选方法。

目的：利用网络药理学和分子对接技术探究槐蕾茶拮抗新型冠状病毒肺炎的潜在作用机制，分析槐蕾茶与连花清瘟胶囊、金花清感颗粒抗病毒靶点异同进而评估槐蕾茶抗新型冠状病毒肺炎的能力。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

一种槐蕾茶抗冠状病毒肺炎的靶点筛选方法，包括以下步骤：

步骤1、活性成分的筛选及靶标预测；

步骤2、分子对接配体与受体的准备；

步骤3、成分靶点分子对接筛选活性成分；

步骤4、疾病靶点的预测；

步骤5、构建化合物-靶点-疾病网络；

步骤6、关键靶点功能富集分析。

进一步，所述步骤1、活性成分的筛选及靶标预测的具体方法是：在中药系统药理学数据库及分析平台tcmsp检索槐蕾茶已知活性成分，设置口服生物利用度ob≥30％和类药性dl≥0.18，筛选槐蕾茶活性成分，并查询得到活性成分对应的靶点，使用uniprot数据库验证有效靶点对应的基因名称。

进一步，所述步骤2、分子对接配体与受体的准备的具体方法是：从tcmsp中导出槐蕾茶活性成分mol2结构，通过openbabelgui选用mmff94力场进行能量优化，并保存为mol2格式；通过autodocktools-1.5.6赋予配体原子类型、进行电荷计算，并定义所有柔性键可旋转，保存为pdbqt格式；从pdb数据库中下载sars-cov-23cl水解酶、sars-cov-2s蛋白ace2和木瓜蛋白酶的pdb格式，导入pymol软件去水分子，分离蛋白；导入autodocktools-1.5.6中进行添加极性氢，计算gasteiger电荷并分配电荷，保存为pdbqt文件。

进一步，所述步骤3、成分靶点分子对接筛选活性成分的具体方法是：autodocktools软件分别设置受体的格点参数文本文件，energy_range＝3，num_modes＝10，exhaustiveness＝8；运用autodockvina软件在linux虚拟环境下进行对接，选取结合自由能小且构象较好的作为结果；选取结合能≤-5.0kj/mol的化合物作为槐蕾茶治疗新型冠状病毒肺炎的活性成分。

进一步，所述步骤4、疾病靶点的预测的具体方法是：分别以“2019-ncov”、“novelcoronaviruspneumonia”、“coronavirusdisease2019”、“novelcoronavirus2019”为检索词查询genecards数据库导出，新型冠状病毒肺炎相关基因靶点，筛选得分≥1的基因。

进一步，所述步骤5、构建化合物-靶点-疾病网络的具体方法是：将槐蕾茶活性成分潜在靶点和疾病靶点分别通过venny2.1.0工具取交集。将交集内靶点导入string11.0平台，物种设置为“homosapiens”，设置置信度“minimumrequiredinterationscore”为“mediumconfidence0.400”，隐藏网络中断开连接的节点；整合蛋白相互作用信息与化合物-靶点信息分别构建化合物-靶点网络，运用“networkanalyzer”功能进行拓扑学分析度值degree、介数中心性betweennesscentrality、紧密中心性closenesscentrality；将槐蕾茶ppi网络通过“merge”功能进行合并，得到槐蕾茶治疗新冠肺炎靶点关系。

进一步，所述步骤6、关键靶点功能富集分析的具体方法是：运用“mcode”功能将槐蕾茶治疗新冠肺炎靶点网络进行聚类分析筛选，通过metascape在线分析平台进行biologicalprocess(go)、cellularcomponent(go)、molecularfunction(go)与keggpathway分析。

一种槐蕾茶抗冠状病毒肺炎的应用，槐蕾茶作为药茶预防新冠肺炎。

中医药具有多成分、多靶点、多通路的作用机制，在干预covid-19中取得良好疗效。新型冠状病毒肺炎属于“湿毒热”范畴，可参照中医疫病进行防治。通过“强其正气”、“避其毒气”、“养其神气”可阻止病毒扩散，防止疫情加重。治疗原则可参考“截断以扭转”和“扶正兼祛邪”可避免患者进入危重期，降低病死率。在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》中乏力伴发热医学观察期患者推荐用药为金花清感颗粒、连花清瘟胶囊(颗粒)、疏风解毒胶囊(颗粒)。网络药理学的发展为中药活性成分、潜在靶点和作用机制研究提供了重要方法指导。

与现有技术相比本发明具有以下优点：

本研究采用网络药理学方法及分子对接技术探究槐蕾针对covid-19的活性成分及潜在靶点，进行分子对接验证，构建成分-靶点网络，与连花清瘟胶囊与金花清感颗粒进行对比，探究其机制作用通路，为后续基础实验提供思路。

本发明使用网络药理学方法及分子对接技术，对槐蕾茶、连花清瘟胶囊与金花清感颗粒进行对比分析，收集并筛选槐蕾茶活性成分进行分子对接。以-5.0kcal/mol为筛选标准，3cl水解酶、木瓜蛋白酶、spike-蛋白、ace2与槐蕾茶6种活性成分均有较好的结合活性，表明槐蕾茶活性成分可能直接作用于sars-cov-2病毒3cl水解酶、木瓜样蛋白酶进行复制的过程，作用于病毒spike-蛋白、细胞ace2受体干预病毒进入细胞的过程。

分别构建槐蕾茶、连花清瘟胶囊与金花清感颗粒ppi网络及活性成分-靶点网络，活性成分角度分析，槐蕾茶中槲皮素、山柰酚、异鼠李素、β-谷甾醇起重要作用；连花清瘟胶囊中槲皮素、木犀草素、汉黄芩素、山柰酚起重要作用；金花清感颗粒中槲皮素、木犀草素、汉黄芩素、山柰酚起重要作用。研究表明槲皮素、山柰酚、异鼠李素、β-谷甾醇具有抗炎、抗病毒、抗氧化作用。其中度值最高的槲皮素可抑制多种流感病毒感染，在流感感染的早期阶段显示抑制活性，并对流感病毒包膜蛋白血凝素存在较高亲和力，抑制病毒引起的溶血反应。进一步证明槐蕾茶有与连花清瘟胶囊、金花清感颗粒活性成分相似的作用。靶点角度分析，槐蕾茶中degree排名靠前的靶点为tnf、il-6、casp3、mapk8。本研究中槐蕾茶主要作用靶点有可能是tnf与il-6等免疫炎症因子，通过抑制促炎因子来减轻炎症反应。研究发现，covid-19患者，特别是重症患者，淋巴细胞计数显著降低，炎症因子显著增高，而il-6在初级和二级风暴中起重要作用。casp3是多种细胞凋亡途径的共同下游效应部分，槐蕾茶可能通过控制casp3表达，干预流感病毒诱导的细胞凋亡。mapk8属于丝裂原活化蛋白激酶家族，mapk信号通路经促炎因子、细胞应激等激活后具有介导细胞炎症反应、肿瘤细胞增殖等的作用。连花清瘟胶囊中degree排名靠前的靶点为ptgs2、nos2、ptgs1、pparg、mapk14、f10、dpp4、casp3、tnf，金花清感颗粒中degree排名靠前的靶点为ptgs2、nos2、ptgs1、pparg、mapk14、dpp4f10、casp3、nos3、tp53。槐蕾茶与连花清瘟胶囊、金花清感颗粒作用可能具有相似性。

在go与kegg通路富集分析中涉及细菌、病毒、肿瘤、免疫调节及炎症通路等生物效应，相关通路中与病毒相关的为甲型流感、乙型肝炎、单纯疱疹感染、病毒致癌等通路。主要涉及il-17信号通路、hif-1信号通路、nf-κb信号通路、t细胞受体信号通路、tnf信号通路、th17细胞分化通路等，槐蕾茶可能应用于病毒感染的辅助治疗。肺部疾病相关的通路有肺结核，小细胞肺癌等通路。以上通路可能在病毒复制与进入细胞过程中起到干预作用。其中nf-κb信号通路产生大量促炎因子可对肺脏产生损伤，异鼠李素通过灭活nf-κb，阻断tlr4途径和减少ros的产生来减轻bv2小胶质细胞中脂多糖诱导的炎症反应。tnf信号通路中tnf与trail受体特异性结合，病毒感染使正常细胞对trail介导的细胞凋亡易感，诱发炎症反应。研究表明，β-谷甾醇可通过抑制tnf-α-nf-κb和tβr1-smad2/3信号通路抗小鼠肝纤维化损伤。槐蕾茶可通过以上作用靶点调节相关通路的表达，具有防治新型冠状病毒的潜力。

综上所述，本研究基于网络药理学和分子对接技术对槐蕾茶辅助治疗新型冠状病毒肺炎潜在作用机制、槐蕾茶与连花清瘟胶囊、金花清感颗粒的相似性进行了探索。槐蕾茶可通过多成分、多靶点、多通路对新型冠状病毒肺炎进行干预，作为药食同源类药茶可长期服用，可制成槐蕾口服液方便使用，为进一步针对covid-19的防治药物选择提供了理论依据。由于网络药理学和分子对接技术的局限性，以及槐蕾茶是否通过作用靶点调节相关通路的表达，仍需进一步实验验证。

附图说明

图1为分子对接模型示意图；(a:山柰酚-3cl水解酶b:

n-[6-(9-acridinylamino)hexyl]benzamide-木瓜样蛋白酶

c:n-[6-(9-acridinylamino)hexyl]benzamide-spike-蛋白d:槲皮素-ace2e:异鼠李素-ace2)；

图2为槐蕾茶、连花清瘟胶囊、金花清感颗粒与covid-19靶点venn图；

图3为槐蕾茶、连花清瘟胶囊、金花清感颗粒蛋白质-蛋白质互作网络图；(a:槐蕾茶ppi网络；b:连花清瘟胶囊ppi网络；c:金花清感颗粒ppi网络)；

图4为槐蕾茶活性成分-靶点网络示意图；

图5为连花清瘟胶囊活性成分-靶点网络示意图；

图6为金花清感颗粒活性成分-靶点网络；

图7为槐蕾茶、连花清瘟胶囊及金花清感颗粒治疗新冠肺炎靶点关系网络；(a:金花清感颗粒独有靶点b:连花清瘟胶囊、金花清感颗粒共有靶点c:槐蕾茶、连花清瘟胶囊、金花清感颗粒共有靶点)；

图8为预测靶点的go富集分析图；

图9为预测靶点的kegg通路富集分析图。

具体实施方式

实施例1

一种槐蕾茶抗冠状病毒肺炎的靶点筛选方法，包括以下步骤：

步骤1、活性成分的筛选及靶标预测；在中药系统药理学数据库及分析平台tcmsp检索槐蕾茶已知活性成分，设置口服生物利用度ob≥30％和类药性dl≥0.18，筛选槐蕾茶活性成分，并查询得到活性成分对应的靶点，使用uniprot数据库验证有效靶点对应的基因名称。

步骤2、分子对接配体与受体的准备；从tcmsp中导出槐蕾茶活性成分mol2结构，通过openbabelgui选用mmff94力场进行能量优化，并保存为mol2格式；通过autodocktools-1.5.6赋予配体原子类型、进行电荷计算，并定义所有柔性键可旋转，保存为pdbqt格式；从pdb数据库中下载sars-cov-23cl水解酶、sars-cov-2s蛋白ace2和木瓜蛋白酶的pdb格式，导入pymol软件去水分子，分离蛋白；导入autodocktools-1.5.6中进行添加极性氢，计算gasteiger电荷并分配电荷，保存为pdbqt文件。

步骤3、成分靶点分子对接筛选活性成分；autodocktools软件分别设置受体的格点参数文本文件，energy_range＝3，num_modes＝10，exhaustiveness＝8；运用autodockvina软件在linux虚拟环境下进行对接，选取结合自由能小且构象较好的作为结果；选取结合能≤-5.0kj/mol的化合物作为槐蕾茶治疗新型冠状病毒肺炎的活性成分。

步骤4、疾病靶点的预测；分别以“2019-ncov”、“novelcoronaviruspneumonia”、“coronavirusdisease2019”、“novelcoronavirus2019”为检索词查询genecards数据库导出，新型冠状病毒肺炎相关基因靶点，筛选得分≥1的基因。

步骤5、构建化合物-靶点-疾病网络；将槐蕾茶活性成分潜在靶点和疾病靶点分别通过venny2.1.0工具取交集。将交集内靶点导入string11.0平台，物种设置为“homosapiens”，设置置信度“minimumrequiredinterationscore”为“mediumconfidence0.400”，隐藏网络中断开连接的节点；整合蛋白相互作用信息与化合物-靶点信息分别构建化合物-靶点网络，运用“networkanalyzer”功能进行拓扑学分析度值degree、介数中心性betweennesscentrality、紧密中心性closenesscentrality；将槐蕾茶ppi网络通过“merge”功能进行合并，得到槐蕾茶治疗新冠肺炎靶点关系。

步骤6、关键靶点功能富集分析：运用“mcode”功能将槐蕾茶治疗新冠肺炎靶点网络进行聚类分析筛选，通过metascape在线分析平台进行biologicalprocess、cellularcomponent、molecularfunction与keggpathway分析。

槐蕾茶作为药茶预防新冠肺炎。

实施例2

一种槐蕾茶抗冠状病毒肺炎的靶点筛选方法

1、槐蕾茶、连花清瘟胶囊及金花清感颗粒活性成分的筛选及靶标预测

利用中药系统药理学数据库及分析平台(tcmsp，http://tcmspw.com/tcmsp.php)，检索槐蕾茶、连花清瘟胶囊及金花清感颗粒已知活性成分，设置口服生物利用度(oralbioavailability,ob)≥30％和类药性(drug-likeness,dl)≥0.18，筛选槐蕾茶、连花清瘟胶囊及金花清感颗粒活性成分，并查询得到活性成分对应的靶点，使用uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)验证有效靶点对应的基因名称。

活性成分的筛选及潜在靶点的收集：

筛选tcmsp数据库中ob≥30％且dl≥0.18的成分作为活性成分。槐蕾茶以“槐花”为关键词，收集27个成分，筛选出6个活性成分，uniprot校正及去重后得到183个潜在靶点。连花清瘟胶囊及金花清感颗粒中活性成分(除石膏)连翘23个、金银花23个、麻黄23个、苦杏仁19个、板蓝根39个、贯众7个、鱼腥草7个、广藿香11个、大黄16个、红景天4个、薄荷10个、甘草93个、青蒿22个，知母16个、浙贝母7个、牛蒡子8个、黄芩36个。去除重复值，连花清瘟胶囊中活性成分275个，有效靶点274个。金花清感颗粒中活性成分280个，有效靶点294个见表1，为各单药的adme活性成分筛选见表2。

表1：槐蕾茶、连花清瘟胶囊、金花清感颗粒中各药材的活性成分及作用靶点数目

表2：槐蕾茶、连花清瘟胶囊、金花清感颗粒部分活性成分adme筛选简表

2、分子对接配体与受体的准备

从tcmsp中导出槐蕾茶活性成分mol2结构，通过openbabelgui选用mmff94力场进行能量优化，并保存为mol2格式。通过autodocktools-1.5.6赋予配体原子类型、进行电荷计算，并定义所有柔性键可旋转，保存为pdbqt格式。从pdb数据库(https://www.rcsb.org/)中下载sars-cov-23cl水解酶(mpro，pdbid:6lu7)、sars-cov-2s蛋白(pdbid:6vsb)、ace2(pdbid:1r42)和木瓜蛋白酶(pl^pro,pdbid:4ovz)的pdb格式，导入pymol软件除去水分子，分离蛋白。导入autodocktools-1.5.6中进行添加极性氢，计算gasteiger电荷并分配电荷，保存为pdbqt文件。

分子对接结果：

以能量优化后槐蕾茶6个活性化合物作为配体，以3cl水解酶(6l7u)、木瓜样蛋白酶(4ovz)、ace2(1r42)、刺突蛋白(6vsb)为受体，根据文献、受体复合物中配体坐标及受体活性口袋设置格点参数文本文件，配体设置为柔性，受体设置为刚性。活性口袋信息见表3。

表3：受体活性口袋信息

一般认为配体与受体结合的构象越稳定时，所需能量能量越低，其发生作用的可能性越大。配体与受体结合能≤-5.0kj/mol，表明活性成分与新冠肺炎相关靶点有较好的结合活性。槐蕾茶活性成分均与新冠肺炎相关靶点有较好的结合活性，其中山柰酚与3cl水解酶结合能最低，n-[6-(9-acridinylamino)hexyl]benzamide与木瓜样蛋白酶、spike-蛋白结合能最低，槲皮素、异鼠李素与ace2的结合能较低，n-[6-(9-acridinylamino)hexyl]benzamide与4个蛋白靶点的结合能总数最低，见表4。

表4：分子对接结果

对山柰酚-3cl水解酶、n-[6-(9-acridinylamino)hexyl]benzamide-木瓜样蛋白酶、n-[6-(9-acridinylamino)hexyl]benzamide-spike-蛋白、槲皮素-ace2、异鼠李素-ace2的分子对接模型分析结果见图1，其中氢键在配体与受体结合中起关键作用。

3、成分靶点分子对接筛选活性成分

autodocktools软件分别设置受体的格点参数文本文件，energy_range＝3，num_modes＝10，exhaustiveness＝8。运用autodockvina软件在linux虚拟环境下进行对接，选取结合自由能小且构象较好的作为结果。选取结合能≤-5.0kj/mol的化合物作为槐蕾茶治疗新型冠状病毒肺炎的活性成分。

4、疾病靶点的预测

分别以“2019-ncov”、“novelcoronaviruspneumonia”、“coronavirusdisease2019”、“novelcoronavirus2019”为检索词查询genecards数据库(https://www.genecards.org/)，导出新型冠状病毒肺炎相关基因靶点，筛选得分≥1的基因。

槐蕾茶、连花清瘟胶囊与金花清感颗粒治疗新冠肺炎潜在靶点

genecards数据库检索covid-19相关靶点262个，筛选score≥1的靶点258个。经venny网站分析，得到47个槐花治疗新冠病毒肺炎的靶点，56个连花清瘟胶囊治疗新冠病毒肺炎靶点，58个金花清感颗粒治疗新冠病毒肺炎靶点(图2)。

将潜在靶点分别导入string数据库，构建ppi网络(图3)，整合活性成分-靶点信息，通过cytoscape构建活性成分-靶点网络(图4-6)。利用“networkanalyzer”功能对网络进行拓扑分析，节点度越大说明该靶点越重要，其中槐花活性成分-靶点中排名前9位的靶点为：tnf(degree＝42)、casp3(degree＝41)、il-6(degree＝41)、tp53(degree＝40)、mapk8(degree＝40)、il-10(degree＝38)、mapk1(degree＝38)、ptgs2(degree＝38)、ccl2(degree＝37)。连花清瘟胶囊活性成分-靶点中排名前9位的靶点为：ptgs2(degree＝192)、nos2(degree＝119)、ptgs1(degree＝110)、pparg(degree＝105)、mapk14(degree＝94)、f10(degree＝71)、dpp4(degree＝70)、casp3(degree＝54)、tnf(degree＝53)。金花清感颗粒活性成分-靶点中排名前10位的靶点为：ptgs2(degree＝203)、nos2(degree＝133)、ptgs1(degree＝115)、pparg(degree＝110)、mapk14(degree＝98)、dpp4(degree＝88)、f10(degree＝79)、casp3(degree＝57)、tp53(degree＝53)、nos3(degree＝53)。构建槐蕾茶、连花清瘟胶囊及金花清感颗粒治疗新冠肺炎靶点关系网络。其中槐蕾茶、连花清瘟胶囊及金花清感颗粒共有治疗靶点47个。连花清瘟胶囊及金花清感颗粒共有治疗靶点9个(图7)。

5、构建化合物--靶点-疾病网络

将槐蕾茶、连花清瘟胶囊及金花清感颗粒活性成分潜在靶点和疾病靶点分别通过venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)工具取交集。将交集内靶点导入string11.0平台(https://string-db.org/)，物种设置为“homosapiens”，设置置信度“minimumrequiredinterationscore”为“mediumconfidence(0.400)”，隐藏网络中断开连接的节点。查询蛋白相互作用信息，导入cytoscape3.7.2中分别构建蛋白质-蛋白质互作(ppi)网络。整合蛋白相互作用信息与化合物-靶点信息分别构建化合物-靶点网络，运用“networkanalyzer”功能进行拓扑学分析度值(degree)、介数中心性(betweennesscentrality)、紧密中心性(closenesscentrality)。将槐蕾茶、连花清瘟胶囊及金花清感颗粒ppi网络通过“merge”功能进行合并，得到槐蕾茶、连花清瘟胶囊及金花清感颗粒治疗新冠肺炎靶点关系。

6、关键靶点功能富集分析

运用“mcode”功能将槐蕾茶、连花清瘟胶囊及金花清感颗粒治疗新冠肺炎靶点网络进行聚类分析筛选，通过metascape在线分析平台(https://metascape.org)进行biologicalprocess(go)、cellularcomponent(go)、molecularfunction(go)与keggpathway分析。

核心靶点基因本体论及通路分析

运用cytoscape3.7.2中“mcode”功能将槐蕾茶47个治疗新冠肺炎靶点网络进行聚类分析，选择得分为27.2分的聚类，共31个靶点。通过metascape在线分析平台进行go富集分析，包括生物过程、细胞组分和分子功能，以及kegg通路富集分析。在go富集中前10的条目及kegg通路中排名前15的条目见表5。

表5：槐蕾茶治疗covid-19靶点的功能及富集分析

go富集中前20条目及kegg通路中15条通路见图8、9。在生物过程中cytokine-mediatedsignalingpathway、responsetolipopolysaccharide、negativeregulationofcellproliferation靶点富集较集中。细胞组分中membraneraft、perinuclearregionofcytoplasm、vesiclelumen相关性较大。分子功能中cytokinereceptorbinding、phosphatasebinding、tumornecrosisfactorreceptorsuperfamilybinding靶点富集较集中。kegg通路富集共涉及113条通路。靶点数目＞12的通路共9条，包括chagasdisease(americantrypanosomiasis)、pathwaysincancer、il-17signalingpathway、age-ragesignalingpathwayindiabeticcomplications、tnfsignalingpathway、toxoplasmosis、tuberculosis、pertussis、influenzaa。通路上所含靶点越多，槐蕾茶通过此通路发挥作用越强。

通过tcmsp数据库检索并依据adme筛选槐蕾茶、连花清瘟胶囊、金花清感颗粒活性成分与潜在靶点。通过openbabelgui中mmff94力场对槐蕾茶活性成分进行能量优化，构建分子对接的配体。以新型冠状病毒3cl水解酶，spike-蛋白，ace2及木瓜样蛋白酶作为受体，运用autodockvina软件在linux虚拟环境下进行批量对接。检索genecards数据库中与covid-19相关疾病靶点，利用venny2.1.0平台筛选出槐蕾茶、连花清瘟胶囊、金花清感颗粒作用于covid-19的潜在靶点，分别导入string中得到蛋白互作网络，整合化合物-靶点作用信息，通过cytoscape3.7.2分别构建活性成分-靶点作用网络，并构建槐蕾茶、连花清瘟胶囊、金花清感颗粒靶点关系网络。将槐蕾茶、连花清瘟胶囊、金花清感颗粒共同作用靶点利用cytoscape3.7.2中mcode功能进行聚类分析，导入metascape平台中，进行biologicalprocess(go)、cellularcomponent(go)、molecularfunction(go)与keggpathway分析。结果：共收集到槐蕾茶活性成分6个，潜在靶点183个。连花清瘟胶囊活性成分275个，潜在靶点274个。金花清感颗粒活性成分280个，潜在靶点294个。槐蕾茶活性6个成分分别与新型冠状病毒3cl水解酶，spike-蛋白，ace2及木瓜样蛋白酶进行分子对接，均得到较好结合能。genecards数据库检索covid-19相关靶点262个，筛选score≥1的靶点258个。venny网站得到得到47个槐花治疗新冠病毒肺炎的靶点，56个连花清瘟胶囊治疗新冠病毒肺炎靶点，58个金花清感颗粒治疗新冠病毒肺炎靶点。槐蕾茶主要作用于tnf、il-6、casp3、mapk8、tp53、mapkq、il-10、ptgs2、ccl2等治疗covid-19的靶点。go分析得到与炎症反应通路，细胞凋亡通路等相关功能。kegg得到113条信号通路，通过调节il-17信号通路、nf-κb信号通路、t细胞受体信号通路、tnf信号通路等发挥抗炎、抗病毒、调节细胞凋亡等作用。结论：槐蕾茶活性成分可通过作用于sars-cov-2及细胞靶点，调节相关信号通路，可能对新型冠状病毒肺炎具有辅助治疗功能。槐蕾茶与连花清瘟胶囊、金花清感颗粒具有相似作用机制，槐蕾为药食同源产品，可能作为药茶长期服用预防新冠肺炎。

实施例3

自2019年12至2020年6月，疫情期间共捐赠复合槐蕾茶1120盒，总价30.8万元，受用人员10000余人，其中有发热症状132人，在未住院及强化治疗的情况下，给予口服槐蕾茶后体温均降至正常。经过后期随访及核酸检测，所有受试人群均未感染covid-19病毒。由此可见，槐蕾茶具有抗冠状病毒的预防和治疗的作用。

实施例4

临床试验证明槐蕾茶具有抗病毒的作用，具体如下：

选取流行性感冒患者20例为研究对象，进行随机分组：对照组10例，年龄21.5～60.3岁，平均年龄(43.4±3.6)岁；病程3.1h～3.5d；病情分级情况：轻度5例、中度3例、重度2例；治疗前平均体温(38.478±0.734)℃；观察组20例，年龄21.1～61.5岁，平均年龄(42.4±3.625)岁；病程2.9h～3.2d；病情分级情况：轻度4例、中度3例、重度3例；治疗前平均体温(38.289±0.548)℃；本研究项目经医院伦理委员会批准，病例或家庭均签署知情同意书；两组患者的一般资料比较，差异无统计学意义(p>0.05)。

纳入受试者的诊断标准包括西医和中医的诊断标准，具体如下：西医诊断标准为：参考中华医学会呼吸病学分会流行性感冒诊断与治疗指南，出现流行病学史、合并急性高热、全身疼痛、乏力和不同程度的呼吸道症状、胸部x线检查可显示单侧或双侧肺炎，少数可伴有胸腔积液、咽拭子流感病毒检测阳性。中医诊断标准为：发热恶寒，甚则寒战，鼻塞，头身剧痛，面赤，咽红，咳嗽等；舌质正常或红，苔薄白或黄；发病急骤，症状相似，传播快，呈流行性。

对照组给予常规物理降温处理，纠正患者的水电解质紊乱情况，并维持酸碱平衡，同时采用利巴韦林治疗，口服利巴韦林(哈药集团三精制药四厂有限公司，国药准字h19993348，规格20mg×24s)，0.15g/次，3次/d；观察组采取上述方法联合槐蕾茶治疗，口服利巴韦林0.15g/次，3次/d，槐蕾茶10g，泡水，3次/d；对比两组患者治疗前后中医症候缓解时间比较的综合评价患者的临床疗效，见表6。

表6两组患者的中医症候缓解时间比较

与对照组比较，^ap<0.05

流行性感冒的疗效分为痊愈、显效、有效和无效。痊愈：用药治疗后2天内，体温恢复正常、临床症状消失及无复发；显效：用药治疗后2天内，体温恢复正常，其余症状积分降低75％以上；有效：用药治疗后3天内，体温恢复正常，但仍有反复情况发作，其余症状积分降低50％-75％；无效：用药治疗后3后，患者病情无改变；临床总有效率＝(痊愈+显效+有效)/总例数×100％。

采用spss22.0软件进行数据处理，计量资料以表示，采用t检验，计数资料用百分比表示，采用χ²检验，p<0.05为差异具有统计学意义。试验结果如下：观察组临床总有效率为90.00％，对照组临床总有效率为80.00％；组间比较，差异具有统计学意义(p>0.05)，见表7。

表7两组患者临床疗效对比(n＝20,n(％))

与对照组比较，^bp<0.05

本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述，以便于本技术领的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

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