应用外源NAA缓解番茄镉胁迫和/或降低番茄植株镉含量的方法以及外源NAA的应用与流程

本发明涉及农业生产技术领域，具体而言，涉及一种应用外源naa缓解番茄镉胁迫和/或降低番茄植株镉含量的方法以及外源naa的应用。

背景技术：

土壤重金属污染关系到农业生产和产品安全，是目前亟待解决的问题，尤其因不合理采矿所导致的矿区污染(zhangetal.，2015)。镉(cd)作为非必需元素，被作物吸收和在体内富集，影响植株正常生理生化过程，对其生长发育具有毒害作用，因此在土壤中污染危害较为严重。近年来，相关学者对植物耐镉机理和调控途径进行了研究(nakamuraetal.，2013；nakamuraetal.，2013)。cd也是蔬菜的主要重金属污染物之一。番茄是园艺生产的主栽果菜，大量证据表明，其生长发育极易受cd影响，而这种影响是多方面的。已发现番茄在cd胁迫后会受到毒害，细胞结构遭到破坏，致使植物生长缓慢，同时番茄根部的asa-gsh循环系统中apx、gr活性明显降低(zhangetal.，2002)。对番茄不同部位营养元素分配的研究表明，cd处理能够降低根系和叶片中锌(zn)的含量，过量施用则会导致根系铁(fe)含量下降以及植株整体锰(mn)含量的下降，说明cd影响植物生长所需部分元素的吸收和转运(dongetal.，2006)。因此，探讨镉胁迫影响番茄生长发育机制，摸索切实可行的调控措施，能够为番茄抗性育种研究提供理论依据。

目前，关于番茄耐镉机制的研究有很多，热点多集中于胁迫耐受性表现评价以及胁迫缓解方面(borgesetal.，2018；piottoetal.，2018)。nogueirol等(2018)证明不同铵硝营养对缓解番茄cd胁迫有不同表现：不同no^3-/nh⁴⁺比例下cd在芽和根中的积累不同；no3-/nh4+比例为100/0时，spad值最小，且果实中cd积累最少；抗氧化系统能够被较高比例的no3-/nh4+所激活。wang等(2016)综合分析cd和cu共同胁迫过程中金属硫蛋白以及gsh-pcs代谢等途径，结合其根系代谢组学检测，证实了一氧化氮(no)在番茄耐重金属过程中的作用以及参与植株非生物胁迫抗逆机理；研究者利用5mmgsh处理cd胁迫下番茄植株，发现其通过增加植株no和sno含量，调节氧化还原状态，调控相关转录因子和应激反应基因表达，进而提高植株胁迫耐受性(hasanetal.，2016)。综上，利用外源物质提高植物镉胁迫抗性是目前研究的热点，然而关于生长素缓解番茄镉胁迫的研究知之甚少。最新研究通过观察生长素和乙烯突变体在cd胁迫下的表型，检测包括mda、h2o2以及可溶性蛋白含量等指标，分析突变体中元素积累与分配规律，揭示了胁迫条件下生长素和乙烯在番茄植株体内各部位的协调作用(alvesetal.，2017)。关于生长素介导镉胁迫影响番茄生长发育机制未见报道。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的问题，提供一种利用生长素缓解镉胁迫的技术。

本发明的目的之一是提供应用外源naa缓解番茄镉胁迫和/或降低番茄植株镉含量的方法，用naa溶液对番茄幼苗的叶面及叶背进行喷施，全面湿透至液滴落下。

进一步，喷施时机为番茄幼苗第3片真叶展开时至第7片真叶出现后。

进一步，所述naa溶液的浓度为0.5～1μmol·l^-1。

优选的，所述naa溶液的浓度为0.5μmol·l^-1。

本发明的目的之二是提供外源naa在缓解镉胁迫对番茄幼苗的毒害作用中的应用。

进一步，缓解镉胁迫对番茄幼苗的毒害作用包括减少镉胁迫下活性氧和过氧化氢积累、降低丙二醛和脯氨酸含量、抑制胁迫导致的细胞膜渗漏破坏以及缓解镉毒害对植物根系生长发育的抑制。

进一步，用naa溶液对番茄幼苗的叶面进行喷施；所述番茄幼苗为4片真叶展开时，所述naa溶液的浓度为0.5～1μmol·l^-1。

本发明的工作原理及有益效果：外源生长素类物质处理降低了镉的向上转运作用，通过根系积累，恢复地上部分生长，在本发明中，通过外源naa及其抑制剂的施加，证实生长素能够缓解番茄镉胁迫，促进植株和根系的生长以及地上和地下部生物量的积累，激活抗氧化系统的作用，在一定程度上减轻胁迫损害，naa对正调控番茄幼苗镉胁迫抗性，此作用主要通过降低cd²⁺向上转运以及诱导一些抗氧化酶的活性实现；另外，外源naa能够减少镉胁迫下活性氧和过氧化氢积累，降低丙二醛和脯氨酸含量，在一定程度上抑制胁迫导致的细胞膜渗漏破坏。改变生长素内稳态，激活生长素信号通路，进而减缓镉毒害及其对植物根系生长发育的抑制。同时，研究发现，cd胁迫下，0.5μmol·l^-1的naa处理能够下调植株对镉的吸收作用，有效减少番茄植株对镉的向上运输，减轻镉对番茄植株地上部的毒害，而1μmol·l的naa处理效果不尽理想，可能与高浓度下其对番茄植株根系生长的抑制作用有关。

附图说明

图1为不同处理对镉胁迫下番茄幼苗生长发育的影响示意图；

图2为不同处理对镉胁迫下番茄幼苗mda和脯氨酸含量的影响示意图；

图3为不同处理对镉胁迫下o2·^-产生速率和h2o2含量的影响示意图；

图4为不同处理对镉胁迫下番茄幼苗抗氧化酶活性的影响示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

1材料与方法

1.1供试材料与试验设计

试验于2019年在遵义师范学院生物与农业科技学院人工气候室进行，供试番茄(solanumlycopersicuml.)品种为‘中蔬6号’，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供；2,3,5-三碘苯甲酸(tiba)、α-萘乙酸(α-naa)等分析纯购自麦克林化学试剂有限公司。由于naa具有植物生长素的活性，性质稳定，不怕光和热，在常温下可以贮存多年，属低毒植物生长调节剂，因此选择naa为最佳施用剂；tiba为生长素极性运输抑制剂，其施用是为了从反面验证外源naa的作用。设定光周期12/12h(昼/夜)，培养温度28/25℃(昼/夜)。种子经温汤浸种消毒后催芽，露白后播种；出苗后浇1/4hoagland营养液；第3片真叶展开时挑选生长一致的植株洗净根部后用1/2hoagland营养液移栽；预培养一周后换成完全营养液。连续通气，定期更换营养液。至第4片真叶展开时，设置ck(喷施清水)对照，以及cd(50μmol·l^-1)、cd+n1(50μmol·l^-1cd+0.5μmol·l^-1naa)、cd+n2(50μmol·l^-1cd+1μmol·l^-1naa)、cd+t1(50μmol·l^-1cd+50mg·l^-1tiba)和cd+t2(50μmol·l^-1cd+100mg·l^-1tiba)五个处理，镉胁迫处理采用营养液施用方式，naa和tiba处理采用叶面喷施方式进行；于第6片真叶出现后采样测定相关指标。

1.2测定方法

1.2.1生长指标与生物量测定

用离子水冲洗干净后用滤纸吸干水分，使用直尺和游标卡尺测量株高、茎粗、主根长；将地上和地下部分离，分别测定鲜重；于恒温干燥箱105℃杀青0.5h，80℃下烘干至恒重，分别称其干重；采用spad-502叶绿素含量测定仪测定叶片spad值。

1.2.2丙二醛和脯氨酸含量测定

丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法测定；脯氨酸含量采用茚三酮显色法测定。

1.2.3活性氧和抗氧化酶活性测定

超氧阴离子产生速率采用羟胺氧化法测定；h2o2采用南京建成生物工程研究所过氧化氢试剂盒测定；sod活性采用nbt法测定；cat活性采用过氧化氢法测定；pod活性采用愈创木酚法测定。

1.2.4镉含量和转运系数测定

将收获的植株样品地上和地下部分离，于105℃烘至恒重，然后经硝酸-高氯酸消化后，用原子吸收分光光度计测定。转运系数translocationfactor(tf)＝植物地上部分cd²⁺含量/植物根部cd²⁺含量。

1.3数据分析

采用运用duncan’s检验法进行差异显著性检验(p<0.05和p<0.01)，利用excel2007和spssstatistics19软件对所有试验数据进行统计分析作图。

2结果与分析

2.1不同处理对镉胁迫下番茄幼苗生长发育的影响

观察不同处理下番茄植株和根系生长情况，镉处理下植株和根系均出现包括叶片卷曲黄化、根系稀少细弱等生长不良特征，而cd+n1和cd+n2处理均在一定程度上缓解了地上和地下部生长；同时cd+t1和cd+t2处理下，植株主茎发生弯曲，且抽生新叶呈现细弱钩状生长，根系更加稀少，大大加剧了镉胁迫对植株生长的不良影响(图1)。由表1可知，cd胁迫处理下，番茄植株的株高、茎粗、叶片spad值以及主根长均显著降低，除主根长以外，均达极显著水平，降幅分别为17.3％、26.5％、27％和11.7％；cd+n1和cd+n2处理均显著提高了镉胁迫下番茄植株的株高和spad值；cd+n1处理显著提高了镉胁迫下番茄植株的主根长，cd+n2处理极显著增加了镉胁迫下植株的茎粗，增加幅度达到35.3％，两者在茎粗和主根长上存在极显著差异。另一方面，cd+t1和cd+t2处理均显著降低了镉胁迫下番茄植株的主根长、叶片spad值以及地下部鲜重；cd+t2处理显著抑制了镉胁迫下番茄植株的伸长生长，降幅分别达到15.4％。

表1不同处理对镉胁迫下番茄幼苗生长指标的影响

由表2可知，番茄幼苗地上与地下部的鲜重和干重在cd胁迫处理使下均呈现大幅下降；同时，cd+n1和cd+n2处理均显著增加了地上部生物量，cd+n1处理显著上调了地下部鲜重和干重，增幅分别达到18.5％和19.9％。cd+t1和cd+t2处理均显著降低了镉胁迫下番茄植株地下部鲜重，cd+t2处理显著降低了植株地上和地下部干重积累，降幅分别为14％和17.1％。结果表明，镉胁迫对番茄植株生长具有抑制作用，0.5μmol·l^-1naa处理能够更有效缓解这种作用，并在一定程度上恢复生长势，其中cd+n1处理的调控作用较为明显；而作为生长素极性运输抑制剂，tiba的施用能够加剧镉胁迫的抑制作用，并随浓度增加而增强，尤其对地下部影响较大；证明生长素信号参与镉胁迫下番茄植株的生长调控。

表2不同处理对镉胁迫下番茄幼苗生物量积累的影响

2.2不同处理对镉胁迫下番茄幼苗mda和脯氨酸含量的影响

mda作为膜脂过氧化最重要的产物之一，是细胞膜系统受损的标志。由图2可知，mda含量在cd胁迫处理下显著提高了54.5％，cd+n1处理显著减低了镉胁迫下番茄mda含量，下降幅度达到28.4％；cd+t2处理则很大幅度显著提高了mda含量。脯氨酸是一种重要的渗透调节物质，极易受逆境胁迫诱导大量积累。脯氨酸含量在cd胁迫处理下显著提高，cd+n1和cd+n2处理显著减低了镉胁迫下番茄脯氨酸含量，下降幅度分别达到24％和43.4％；相反，cd+t2处理显著提高了镉胁迫下番茄脯氨酸含量。结果表明，镉胁迫在一定程度上破坏了番茄植株体内细胞膜结构，使之发生渗漏，0.5μmol·l^-1naa处理能够维持相对完好的膜结构，缓解膜脂过氧化过程，而作为生长素极性运输抑制剂，tiba处理则促进这一过程，并随浓度增加而加剧。综合结果说明生长素信号参与镉胁迫下番茄细胞膜结构的调节作用。

2.3不同处理对镉胁迫下番茄幼苗o2^-产生速率和h2o2含量的影响

多方面不利环境条件会导致植物体内产生大量的活性氧与自由基，o2^-·和h2o2是植物体内最主要的活性氧，会导致膜脂过氧化,间接反映胁迫程度。由图3可知，cd胁迫处理显著提高了超氧阴离子产生速率以及h2o2含量，cd+n1和cd+n2处理显著降低了镉胁迫下超氧阴离子产生速率，下降幅度分别为21.2％和47.7％，而cd+t2处理则显著提高；与cd相比，cd+n1处理下h2o2含量显著下降了24.4％。结果表明，镉胁迫在一定程度上促进了超氧阴离子产生和过氧化氢的积累，不利于细胞维持稳定结构，而0.5μmol·l^-1naa处理能够有效抑制此类物质的产生和积累，有利于恢复细胞正常结构状态。

2.4不同处理对镉胁迫下番茄幼苗抗氧化保护酶系统的影响

抗氧化酶系统在适宜条件下，能够清除由逆境诱导产生的活性氧自由基，在一定程度上缓解逆境造成的伤害。sod首先使活性氧自由基发生歧化，进而转化为能够被cat和pod所清除的h2o2。由表3可知，sod、pod以及cat的活性在cd胁迫处理下出现不同程度的提高，增幅分别达到21.1％、64.4％和35.6％；cd+n1和cd+n2处理均显著提高了镉胁迫下番茄pod活性，增幅分别为40.4％和67.4％，cd+n1处理显著极提高了镉胁迫下番茄sod活性，cd+n2处理极显著增加了sod和cat活性，对pod活性影响不显著。结果表明，镉胁迫使得植株体内抗氧化酶活性提高，以抵御逆境损害，0.5μmol·l^-1以及1μmol·l^-1naa处理均能够在一定程度上进一步提高防御酶活性，促进自身对活性氧的清除，维持相对正常的生理过程；而作为生长素极性运输抑制剂，tiba的施用不利于防御酶作用的发挥。综合结果说明生长素信号参与镉胁迫下番茄抗氧化酶活性的调控作用。

表3不同处理对镉胁迫下番茄幼苗抗氧化酶活性的影响

2.5不同处理对镉胁迫下番茄幼苗镉吸收和转运的影响

由图4可知，cd胁迫处理使整个番茄植株的镉含量均显著增加，而cd+n1处理显著下调了地上和地下部的镉含量，降幅分别为39.1％和20.4％；cd+n2仅使地上部分镉含量显著下调了18.4％，对地下部作用不显著；另一方面，cd+t1和cd+t2处理均显著上调了整个植株镉含量。转运系数是植物转运重金属能力的重要指标，cd胁迫处理显著提高了镉在植株内由地下部向地上部的转运；与单独施用cd处理相比，cd+n1处理下转运系数显著下调了22.8％，减少了地下部向地上部镉的运输，其他处理作用不显著，且均高于ck。结果表明，镉胁迫下，naa能够下调植株对镉的吸收作用，对不同部分的抑制作用与施用浓度有关；0.5μmol·l^-1的naa能够有效减少番茄植株对镉的向上运输，减轻镉对地上部的毒害；而作为生长素极性运输抑制剂，tiba施用在阻碍生长素运输的同时，对镉的转运无明显影响，且加剧植株对镉的吸收。证明生长素信号参与镉胁迫下番茄植株自身对镉的吸收和转运作用。

3讨论

研究者对重金属胁迫下植物激素的作用进行了论述，包括脱落酸、生长素等，揭示了其在植物抗性反应中的相互关联(páletal.，2018)。前人研究发现单独cd处理可以干扰拟南芥幼苗生长素稳态，干扰杨树生长素的生理活动，影响其木质化过程(elobeidetal.，2012；huetal.，2013)。对水稻根系cd和as胁迫下的发育观察发现，生长素在此过程中起相反作用(ronzanetal.，2018)。另外，cd能够通过改变scr基因表达和同时介导生长素-细胞分裂素通路影响拟南芥初生根生长(brunoetal.，2017)。zhan等(2017)发现cd胁迫干扰生长素在植株体内的稳态抑制高粱幼苗初生根的生长。在拟南芥中，cd和as双重毒害在影响胚胎后根系中心的形成和维持的同时，干扰生长素的合成和运输(fattorinietal.，2017)。因此镉毒害可以通过扰乱植物体内生长素内稳态，来影响植物的生长发育。

但是通过申请人研究表明，外源生长素类物质处理降低了镉的向上转运作用，通过根系积累，恢复地上部分生长。同时也发现，cd胁迫下，0.5μmol·l的naa处理能够下调植株对镉的吸收作用，有效减少番茄植株对镉的向上运输，减轻镉对地上部的毒害；而1μmol·l的naa处理效果不尽理想，可能与高浓度下其对根系生长的抑制作用有关；另外通过外源生长素及其抑制剂的施加，证实生长素能够缓解番茄镉胁迫，促进植株和根系的生长以及地上和地下部生物量的积累，激活抗氧化系统的作用，在一定程度上减轻胁迫损害。生长素对正调控番茄幼苗镉胁迫抗性，此作用主要通过降低cd²⁺向上转运以及诱导一些抗氧化酶的活性实现；在本发明中还发现生长素能够减少镉胁迫下活性氧和过氧化氢积累，降低丙二醛和脯氨酸含量，在一定程度上抑制胁迫导致的细胞膜渗漏破坏。改变生长素内稳态，激活生长素信号通路，进而减缓镉毒害及其对植物根系生长发育的抑制，存在可行性，但是相关机理需结合通路调控因子的功能鉴定进行进一步验证。

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