高赖氨酸玉米育种材料创制方法与流程

本发明涉及农业育种
技术领域：
，具体涉及一种高赖氨酸玉米育种材料创制方法。
背景技术：
：玉米是第一大高产粮食作物，又是饲料作物，人类日常摄入的植物蛋白质中四分之一由玉米供给。因此玉米产量的高低关系着全球的粮食问题，而营养品质的好坏决定能否充分有效的被吸收利用。但由于玉米蛋白质中猪和家禽不能合成的限制氨基酸赖氨酸和色氨酸的含量很低，导致人和其它单胃动物不能很好地吸收和利用，大大降低了其营养品质以及蛋白利用率。普通玉米中赖氨酸的含量只有0.25%左右，而畜禽通常需要的赖氨酸含量在0.6%～0.8%。目前不足部分需要通过添加较多的合成赖氨酸、豆饼和鱼粉等给予补充，这样极大地增加了饲料成本。而采用高赖氨酸玉米作为饲料，可以提高饲料的利用率，畜禽生长明显加快。因此，增加玉米赖氨酸含量，改良玉米蛋白品质，对于提高粮食和饲料的利用率以及节约成本具有重要的意义。自从1964年mertz等人发现opaque-2基因能够显著提高玉米籽粒中的赖氨酸和色氨酸含量以来，开发优质蛋白玉米育种材料成为重要的研究方向。但是，优质蛋白玉米种质资源相对贫乏，很难直接组配单交种，育种家们大多是运用自然界高赖氨酸的种质，通过回交转育的手段将普通玉米自交系转化成高赖氨酸的近等基因系。然而，由普通玉米转化而来的这些近等基因系发生了一系列的变化，如出现了容重降低，胚乳粉质程度增加，出苗速度慢，容易感染病虫害等。导致多年来并未出现大批的优质高赖氨酸玉米育种材料运用到生产育种实践中。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种高赖氨酸玉米育种材料创制方法。以期解决现有技术中优质高赖氨酸玉米育种材料缺乏的技术问题。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：设计一种高赖氨酸玉米育种材料创制方法，包括以下步骤：（1）以高赖氨酸供体亲本ca042为目标基因供体，优良普通玉米自交系郑c09为轮回亲本，得到bc1f1；（2）种植bc1f1，挑选遗传背景接近相应轮回亲本的单株，取样提取ｄｎａ，用ssr分子标记选择o2o2杂合单株，继续回交得到bc2f1种子；（3）种植bc2f1，继续挑选遗传背景接近相应轮回亲本单株提取ｄｎａ，用ssr分子标记选择o2o2杂合单株进入下一次回交，直到获得bc5f1种子。（4）在bc5f1世代，用ssr分子标记选择基因型为o2o2的单株，自交获得bc5f2，用ssr标记选择o2o2的单株的单株自交，自交多代直至稳定。在所述bc1f1、bc2f1、bc3f1、bc4f1、bc5f1、bc5f2和bc5f3分离世代利用o2基因内标记umc1066对回交和自交单株进行选择，其ssr分子标记引物为：f：5′-atggagcacgtcatctcaatgg-3；r：5′-agcagcagcaacgtctatgacact-3′。在所述bc1f1、bc2f1、bc3f1、bc4f1、bc5f1、bc5f2和bc5f3分离世代利用o2基因内标记phi057对回交和自交单株进行选择，其ssr分子标记引物为：f：5′-ctcatcagtgccgtcgtccat-3′；r：5′-cagtcgcaagaaaccgttgcc-3′。在所述bc1f1、bc2f1、bc3f1、bc4f1、bc5f1、bc5f2和bc5f3分离世代利用o2基因内标记phi112对回交和自交单株进行选择，其ssr分子标记引物为：f：5′-tgccctgcaggttcacattgagt-3′；r：5′-aggagtacgcttggatgctcttc-3′。本发明具有积极有益的技术效果：1.本发明基于分子标记辅助选择与田间回交相结合的手段，筛选到适宜的高赖氨酸分子标记及相匹配的目标基因供体和轮回亲本，得到与高赖氨酸供体亲本相一致的o2o2基因型隐性纯合体，大大提高了育种的效率。2.本发明为探索创制高赖氨酸玉米材料提供了新途径，为优良籽粒蛋白品质玉米品种的选育提供了材料基础，为利用基因工程技术提高籽粒赖氨酸含量提供了技术支撑。附图说明图1为分子标记的筛选及umc1066标记利用的电泳照片，其中，p1为轮回亲本郑c09；p2为高赖氨酸供体亲本cao42；编号1-4代表部分回交群体单株。图2为利用umc1066标记电泳照片，结合籽粒表现型，鉴定出o2o2基因型隐性纯合个体。图3为郑qc09高赖氨酸系列材料穗部表型照片。图4为郑qc09高赖氨酸系列材料籽粒表型照片，其中，左图为郑qc09软质不透明籽粒；中图为胚乳半硬质郑qc09籽粒；右图为完全硬质的郑qc09籽粒。具体实施方式下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1：一种高赖氨酸玉米育种材料创制方法（1）高赖氨酸玉米育种材料创制具体流程以高赖氨酸供体亲本ca042（河南省农业科学院粮食作物保存的玉米种质）为目标基因供体，优良普通玉米自交系郑c09(河南省农业科学院粮食作物研究所选育的国审玉米品种郑单2265的父本)为轮回亲本，得到bc1f1；按穗行种下bc1f1，挑选农艺性状较好，遗传背景接近相应轮回亲本的100个单株挂牌取样，提取ｄｎａ，用ssr分子标记选择o2o2杂合单株，继续回交得到bc2f1种子；按穗行种下bc2f1，继续挑选农艺性状较好，遗传背景接近相应轮回亲本的100个单株挂牌取样，提取ｄｎａ，用ssr分子标记选择o2o2杂合单株进入下一次回交，直到获得bc5f1种子。在bc5f1世代，用ssr分子标记选择基因型为o2o2的单株，自交获得bc5f2，用ssr标记选择o2o2的单株的单株自交，自交多代直至稳定。所得试验材料的系谱及相应基因型见表1。表1试验材料的系谱及相应基因型。（2）ssr标记多态性分析利用o2基因内3个ssr标记phi112、phi057、umc1066（见表2）对高赖氨酸材料供体材料cao42和普通玉米自交系郑c09进行多态性检测。结果表明（见图1），o2基因内标记umc1066在郑c09和ca042之间也有很好的多态性，而且带型都十分清晰。本试验选择o2基因内标记umc1066对目标基因在bc1f1、bc2f1、bc3f1、bc4f1、bc5f1、bc5f2和bc5f3分离世代对回交和自交单株进行选择。表2引物序列。（3）回交和自交世代目标基因标记选择试验2011年冬季，在海南以ca042为高赖氨酸材料供体材料，普通玉米自交系郑c09为轮回亲本，构建杂交f1，2012年在河南原阳种植f1世代，与轮回亲本郑58回交获得bc1f1。2013年在河南原阳按穗行种下bc1f1世代分离群体，共212个单株，挑选农艺性状较好，遗传背景接近相应轮回亲本的120个单株挂牌取样，提取ｄｎａ，利用分子标记选择基因型为o2o2杂合单株，结果选择出来57个杂合单株，回交群体单株中o2o2：o2o2两种基因型的比例，经卡方测验证明符合1：1的分离比例。用选择的杂合单株与轮回亲本继续回交，获得bc2f1种子。2013年冬季在海南按穗行种下bc2f1世代分离群体，继续选择回交群体单株中农艺性状较好，遗传背景接近相应轮回亲本的基因型为o2o2的单株与轮回亲本郑58继续回交，直到获得bc5f1种子。2015年在河南郑州按穗行种下bc5f1世代分离群体，选择回交群体单株中农艺性状较好，遗传背景接近相应轮回亲本的基因型为o2o2的单株自交获得bc5f2种子，用ssr标记选择o2o2的单株的单株自交，自交多代直至稳定，利用分子标记选择基因型为o2o2的郑qc09高赖氨酸系列材料（图2）。用高赖氨酸分子标记辅助选择与田间回交相结合的手段，提高了育种效率，提高经过5代回交，再自交3代，得到材料基因型与高赖氨酸供体亲本一样，是双隐性纯合体。说明经过2代的回交基因已经在o2位点纯合。表明采用ssr标记umc1066辅助选择o2基因是有效的；这与实际表现型相一致。基于创制的昌7-2改良系高赖氨酸优异种质郑qc09，并结合杂种优势群属性分类，组配系列优质蛋白（高赖氨酸）玉米品种，可以提高玉米蛋白（高赖氨酸）供给，缓解对大豆进口的依赖。（4）郑c09高赖氨酸系列材料籽粒表型观察及容重分析自然光下观察获得的郑qc09高赖氨酸系列材料及其对照郑c09果穗和籽粒表型，见图3、图4。结果表明，郑qc09高赖氨酸系列材料果穗性状和轮回亲本郑c09基本一致，穗行数为12-14行，果穗为桶型，籽粒不通透，为蜡质胚乳，籽粒胚乳结构发生不同变化，而轮回亲本籽粒种皮光滑有光泽，籽粒饱满，透明，为角质胚乳。硬粒型的郑c09转化后出现不同程度的硬质胚乳，有完全软质不透明的，也有规则的顶部胚乳是半硬质的，还有完全硬质的优质蛋白高赖氨酸郑qc09。同时，测定了轮回亲本郑c09和郑qc09高赖氨酸系列材料100个穗行的容重，见表3。结果表明，普通郑c09容重达到812g/l，郑qc09软质不透明的郑qc09平均容重为691g/l，胚乳半硬质郑qc09平均容重为716g/l，完全硬质的优质蛋白高赖氨酸材料郑qc09平均容重为748g/l，达到玉米容重国家一等标准（≥720g/l）。表3不同胚乳硬度郑qc09高赖氨酸玉米材料容重含量材料名称郑qc09-软质不透明郑qc09-硬质郑qc09-半硬质郑c09-轮回亲本国家一等标准≥容重含量（g/l）692.67g/l±2.08717.67g/l±1.53746.67g/l±1.15805.67g/l±2.52720g/l（5）玉米籽粒赖氨酸含量测定样品处理：每个样品取3个果穗，取中部1/3籽粒，混合，磨碎过60目筛。取过筛后的样品2～10g，放入扁形称量瓶中，瓶盖斜支于瓶边，置于101～105℃的烘箱中2～4h，取出盖好，置干燥器内冷却0.5h，称量。再重新加热1h，冷却0.5h，称量。重复至前后称重相差不超过2mg，并计算样品含水量。盐酸水解：称取各样品0.2g，加入5ml（6mol/l）hcl，充入氮气，封管，放入110℃的烘箱中过夜水解。取出冷却后，在100ml容量瓶中加入6mol/lnaoh至中性，将水解液过滤到此容量瓶中，用ph2.2的缓冲液（0.02mol/l的稀盐酸）洗涤水解管，过滤，最后定容至100ml。测定：利用日立l-8900型全自动氨基酸分析仪对郑qc09高赖氨酸系列材料及其对照郑c09的氨基酸组分进行检测，18种氨基酸标准液（日本味之素公司）作为蛋白质水解分析标准样品。检测结果如表4所示。赖氨酸测定结果表明：硬粒型的郑c09转化郑qc09后赖氨酸含量为0.42%～0.46%，比轮回亲本郑c09赖氨酸含量增加了55.6%～70.4%。软质不透明的郑qc09平均赖氨酸含量从0.27%提高至0.46%，增长70.4%；胚乳半硬质郑qc09平均赖氨酸含量为0.44%，完全硬质的优质蛋白高赖氨酸材料郑qc09平均赖氨酸含量从0.27%提高至0.42%，比轮回亲本平均赖氨酸含量增加了55.6%。天冬氨酸、苏氨酸、甘氨酸、胱氨酸、赖氨酸和精氨酸的含量显著提高，丙氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸的含量却显著下降；蛋氨酸和脯氨酸含量无变化。表4不同胚乳硬度米郑qc09高赖氨酸玉赖氨酸含量样品名称郑qc09-软质不透明郑qc09-硬质郑qc09-半硬质郑c09-轮回亲本天冬氨酸0.990.840.790.52苏氨酸0.350.340.330.29丝氨酸0.40.370.360.36谷氨酸1.531.451.421.59甘氨酸0.40.350.390.28丙氨酸0.510.460.470.58胱氨酸*0.16*0.17*0.16*0.14缬氨酸0.490.480.460.42蛋氨酸0.140.140.140.15异亮氨酸0.280.260.240.26亮氨酸0.790.720.731.08酪氨酸0.150.140.130.07苯丙氨酸0.430.410.40.44赖氨酸0.410.380.390.24赖氨酸干基0.460.420.440.27组氨酸0.290.30.270.23精氨酸0.480.460.480.3脯氨酸0.710.730.670.76总和8.517.87.837.71蛋白质（干基）10.8710.410.8410.32粗脂肪（干基）4.353.963.083.64淀粉（干基）70.6673.6272.0373.96水分11.3310.5710.410.83上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属
技术领域：
的技术人员能够理解，在不脱离本发明技术构思的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，或者是对相关材料及步骤方法进行等同替代，从而形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。当前第1页1 2 3 

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