苦木苦味素类化合物在防治植物真菌病害中的应用的制作方法

本发明属于农药技术领域，具体涉及苦木苦味素类化合物在防治植物真菌病害中的应用。

背景技术：

植物侵染性病害可分为细菌性病害、真菌性病害、病毒性病害和线虫性病害等，其中真菌性病害是农作物病害中最普遍、最常见的病害类型，几乎80％左右的植物侵染性病害都是由真菌引起的。该病害种类繁多，表现症状也千变万化，导致农作物减产、降低农产品品质，有的真菌病害甚至会使农产品产生毒素，危及人、畜健康。因此，防治植物真菌病害是长期以来科学家们一直在努力攻克的难题。虽然培育抗性品种是防控该类病害最为经济、环保的方法，但在缺少抗性品种或抗性不完整的情况下,使用化学药剂仍将是防控作物真菌病害的主要手段。随着杀菌剂的广泛使用，许多问题也随之出现，其中最为主要的是抗药性和残留问题。目前，许多地区的作物对病原菌的耐药性增加，致使化学防治效果下降或失败，为此，农户们普遍采用盲目加大杀菌剂的用量或将多种药剂混合使用的方式以提高防治的效果，这样一来就更加剧了残留问题的严重性，这也是引起我国农药残留和环境污染的主要根源。可见，随着化学农药的副作用日益凸显以及人们对环保、绿色食品需求的逐步提高，研发符合环保、健康和可持续发展理念的生物农药已成为当务之急。

苦木科(simaroubaceae)植物为落叶或常绿的灌木或乔木，主要分布在非洲、美洲和东南亚等热带和亚热带地区。苦木科植物现约有20属120余种，我国原产5属11种，主要分布在长江以南各省区，包括苦树属(picrasma)、臭椿属(ailanthus)、鸦胆子属(brucea)、牛筋果属(harrisonia)和海人树属(suriana)。苦木科植物的树皮常有苦味，并因此得名。苦木苦味素(quassinoids)是一类具有苦味的化合物，多为高度氧化的降三萜类物质，是苦木科植物的特征性化学成分，也是其主要的活性成分。目前，已从苦木科的不同种植物中分离鉴定了400余个苦木苦味素类成分，根据其骨架中所含有碳原子数目的不同，可分为c25、c22、c20、c19和c18五种亚型。该类化合物骨架类型多样，在医学上具有抗疟疾、抗肿瘤、抗炎、抗病毒的药理作用，在农业上对昆虫有拒食和毒杀等多种生物活性，一直是天然产物化学家和药理学家的研究热点之一。但目前尚无苦木苦味素类化合物在抗植物病害真菌方面的相关研究。因此，植物源的苦木苦味素在抗植物真菌方面是新型的重要研究方向。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了苦木苦味素类化合物在防治植物真菌病害中的应用，本发明经研究发现，苦木苦味素类化合物对植物病原真菌具有较好的抑制活性，可应用于防治植物真菌病害。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明的第一个目的是提供苦木苦味素类化合物在防治植物真菌病害中的应用。

本发明的第二个目的是提供苦木苦味素类化合物在制备防治植物真菌病害的药剂中的应用。

本发明经研究发现，从苦木科植物东革阿里(eurycomalongifolia)中分离得到的苦木苦味素类化合物对多种植物真菌有优良的抑菌活性，还发现该类化合物具有内吸性、能够在植物中输导，相比在植物表面施用的药剂其抑菌作用更好，且使用更方便。

优选地，在本发明的上述两个应用中，所述苦木苦味素类化合物选自如以下结构式所示的c19型苦木苦味素类化合物和c20型苦木苦味素类化合物中的至少一种：

更优选地，所述c19型苦木苦味素类化合物选自以下结构式中的至少一种：

所述c20型苦木苦味素类化合物选自以下结构式中的至少一种：

具体的，在上述结构式中，结构式2对应化合物2(eurycomalideb)、结构式3对应化合物3(eurycomalactone)、结构式5对应化合物5(eurylactoneb)、结构式7对应化合物7(13,21-dihydroeurycomanone)、结构式8对应化合物8(eurycomanone)、结构式9对应化合物9(longifolactonee)。

优选地，在本发明的上述两个应用中，所述植物真菌病害包括但不限于香蕉枯萎病、木瓜炭疽病、番石榴叶枯病、马铃薯干腐病、苹果腐烂病和番茄早疫病。

本发明的第三个目的是提供一种能在植物体内输导的杀真菌剂，该杀真菌剂的活性成分包括苦木苦味素类化合物。

优选地，在本发明的杀真菌剂中，所述苦木苦味素类化合物选自如以下结构式所示的c19型苦木苦味素类化合物和c20型苦木苦味素类化合物中的至少一种：

更优选地，所述c19型苦木苦味素类化合物选自以下结构式中的至少一种：

所述c20型苦木苦味素类化合物选自以下结构式中的至少一种：

具体的，在上述结构式中，结构式2对应化合物2(eurycomalideb)、结构式3对应化合物3(eurycomalactone)、结构式5对应化合物5(eurylactoneb)、结构式7对应化合物7(13,21-dihydroeurycomanone)、结构式8对应化合物8(eurycomanone)、结构式9对应化合物9(longifolactonee)。

优选地，在本发明的杀真菌剂中，所述苦木苦味素类化合物在杀真菌剂中的重量百分比含量为1％-70％。

优选地，在本发明的杀真菌剂中，所述杀真菌剂的剂型包括但不限于水乳剂、微乳剂、干悬浮剂。

研究表明，将苦木苦味素类化合物制备成水乳剂、微乳剂或干悬浮剂，对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病均具有较好的田间防治效果。其中，以化合物8(eurycomanone)的防治效果最为显著。

具体的，本发明还提供了几种具体剂型的植物杀真菌剂，具体情况如下：

(1)一种能在植物体内输导的杀真菌水乳剂，具体由如下重量百分比的成分构成：

苦木苦味素类化合物1％～20％，溶剂1％～5％，乳化剂1％～5％，共乳化剂1％～5％，防冻剂1％～2％，密度调节剂0.4％～0.6％，ph值调节剂0.05％～0.15％，消泡剂0.05％～0.15％，水62.1％～94.5％。

优选地，所述杀真菌水乳剂由如下重量百分比的成分构成：

苦木苦味素类化合物1％，溶剂2％，乳化剂2％，共乳化剂2％，防冻剂1％，密度调节剂0.5％，ph值调节剂0.1％，消泡剂0.1％，水91.3％。

优选地，在上述杀真菌水乳剂中，所述溶剂包括但不限于甲醇；所述乳化剂包括但不限于农乳600号、农乳500号、宁乳130、吐温80；所述共乳化剂包括但不限于丁醇、异丁醇、1-十二烷醇、1-十四烷醇；所述防冻剂包括但不限于丙三醇；所述密度调节剂包括但不限于氯化钠、氯化钙；所述ph值调节剂包括但不限于磷酸，所述消泡剂包括但不限于十八烷基三甲基氯化铵，所述水为去离子水。

(2)一种能在植物体内输导的杀真菌微乳剂，具体由如下重量百分比的成分构成：

苦木苦味素类化合物30％～50％，溶剂8％～10％，乳化剂8％～10％，稳定剂2％～3％，防冻剂5％～10％，水17％～47％。

优选地，所述杀真菌微乳剂由如下重量百分比的成分构成：

苦木苦味素类化合物40％，溶剂10％，乳化剂10％，稳定剂3％，防冻剂8％，水29％。

优选地，在上述杀真菌微乳剂中，所述溶剂包括但不限于甲醇；所述乳化剂包括但不限于农乳700号、农乳300号、琥珀酸二异辛酯磺酸钠；所述稳定剂包括但不限于邻甲苯基缩水甘油醚、正丁基缩水甘油醚；所述防冻剂包括但不限于丙二醇、乙二醇、丙三醇，所述水为去离子水。

(3)一种能在植物体内输导的杀真菌干悬浮剂，具体由如下重量百分比的成分构成：

苦木苦味素类化合物60％～80％，分散剂10％～35％，乳化剂5％～10％。

优选地，所述杀真菌干悬浮剂具体由如下重量百分比的成分构成：

苦木苦味素类化合物70％，分散剂25％，乳化剂5％。

优选地，在上述杀真菌干悬浮剂中，所述分散剂为棉籽饼蛋白水解物，所述棉籽饼蛋白水解物的固体物的含量为40％；所述乳化剂包括但不限于吐温80。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明从苦木科植物东革阿里中分离得到的苦木苦味素类化合物，经研究发现，苦木苦味素化合物对多种植物真菌具有抑制活性，而且能在植物体内输导，抑制作用更优越于在植物表面施用的杀菌剂，可以应用于防治植物真菌病害，制备成防治植物真菌病害的药剂(特别是制备成内吸性植物抗真菌杀菌剂)的形式，不仅使用更加方便(如加入到植物浇灌水中，即可在对植物浇水的同时，即完成了施药)，而且防效不受外界环境的干扰，具有很好的应用前景。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1：苦木科植物东革阿里中苦木苦味素类化合物的提取分离和结构鉴定

东革阿里根10kg，粉碎成粗粉，用95％乙醇冷浸提取，合并提取液，减压浓缩得总浸膏270g。总浸膏加水混悬，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，分别减压回收溶剂，得石油醚部位(40g)、乙酸乙酯部位(99g)、正丁醇部位(85g)和水部位(26g)。

取石油醚部位经硅胶柱层析，氯仿-甲醇系统梯度洗脱(100:0→0:100,v/v)，经tlc分析合并，得到7个主流分(fr.a-fr.g)。

fr.e经ods柱层析，甲醇-水梯度洗脱(20:80→100:0,v/v)，经tlc分析合并，得到fr.e1-fr.e5。其中，fr.e3和fr.e4经分别经反复的ods柱层析、sephadexlh-20和高效液相色谱等方法分离纯化，得到化合物1(120.7mg)、化合物2(200.0mg)、化合物3(103.5mg)、化合物4(14.0mg)、化合物5(415.8mg)、化合物6(1.5g)、化合物7(105.4mg)、化合物8(85.6mg)、化合物9(52.0mg)。

采用波谱学方法鉴定各化合物的结构，各理化数据和波谱数据如下：

化合物1

无色针状晶体(甲醇)，mp195-196℃，(c0.65,甲醇)；uv(乙腈)λmax(logε)：235(3.99)nm；ir(kbr)vmax：3442,1774,1660,1458,1333,1261,1178,1114,1053,964,932,875,750,600cm^-1；hr-esi-ms：m/z373.1621[m+na]⁺(calcdforc19h26o6na,373.1622)；¹hnmr(300mhz,c5d5n)δ5.91(s,1h),4.16(m,1h),5.76(q,j＝5.0hz,1h),4.48(dd,j＝5.0,1.3hz,1h),3.54(d,j＝8.6hz,1h),3.36(brs,1h),3.30(q,j＝7.0hz,1h),2.53(dt,j＝12.4,4.5hz,1h),2.45(m,1h),2.12(dt,j＝12.4,4.5hz,1h),1.91(s,3h),1.67(s,3h),1.22(q,j＝12.4hz,1h),1.04(d,j＝6.9hz,3h),0.93(d,j＝6.4hz,3h)；¹³cnmr(75mhz,c5d5n)δ199.9,177.7,171.4,120.9,85.6,85.2,70.8,69.7,53.4,48.8,48.2,46.9,41.1,32.6,32.1,23.1,18.6,17.8,17.2。

化合物2

无色针状晶体(甲醇)，mp215-216℃，(c0.58,甲醇)；uv(乙腈)λmax(logε)：282(4.03)nm；ir(kbr)vmax：3481,1766,1711,1655,1581,1458,1384,1327,1262,1174,1054,958,932,882,715,621cm^-1；hr-esi-ms：m/z371.1460[m+na]⁺(calcdforc19h24o6na,371.1465)；¹hnmr(400mhz,c5d5n)δ6.24(brs,1h),6.11(s,1h),6.02(m,1h),4.73(brs,1h),4.54(m,1h),3.97(d,j＝7.3hz,1h),3.44(d,j＝1.2hz,1h),3.35(q,j＝6.9hz,1h),2.63(d,j＝3.2hz,1h),1.92(s,3h),1.82(s,3h),1.80(s,3h),1.08(d,j＝6.9hz,3h)；¹³cnmr(100mhz,c5d5n)δ200.0,177.8,163.6,138.1,131.5,121.7,85.4,83.6,72.1,70.1,53.9,48.3,47.3,46.1,32.8,24.1,20.3,17.3,16.8。

化合物3

无色针状晶体(甲醇)，mp251-252℃，(c0.29,甲醇)；uv(乙腈)λmax(logε)：240(3.97)nm；ir(kbr)vmax：3459,2952,1734,1667,1436,1381,1261,1122,961,818,631cm^-1；hr-esi-ms：m/z371.1461[m+na]⁺(calcdforc19h24o6na,371.1465)；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ6.09(s,1h),4.77(m,1h),4.35(d,j＝4.7hz,1h),4.03(s,1h),2.92(brs,1h),2.91(m,1h),2.87(m,1h),2.78(overlapped,2h),1.93(s,3h),1.86(d,j＝3.6hz,1h),1.54(s,3h),1.23(s,3h),1.14(d,j＝7.0hz,3h)；¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ205.6,197.5,176.3,162.3,124.5,83.2,81.3,69.9,53.0,51.2,49.4,49.1,47.0,36.3,32.4,23.7,22.0,16.7,12.2。

化合物4

无色针状晶体(甲醇)，mp270-271℃，(c0.25,甲醇)；uv(乙腈)λmax(logε)：240(4.08)nm；ir(kbr)vmax：3527,3434,3392,1737,1668,1389,1226,1136,1120,1049,990cm^-1；hr-esi-msm/z419.1309[m+na]⁺(calcdforc19h24o9na,419.1313)；¹hnmr(400mhz,c5d5n)δ5.10(s,1h),5.09(m,1h),5.54(brs,1h),4.15(t,j＝4.4hz,1h),4.74(d,j＝9.1hz,1h)和3.93(d,j＝9.1hz,1h),2.51(s,3h),1.75(d,j＝7.2hz,3h)和1.57(s,3h)；¹³cnmr(100mhz,c5d5n)δ174.8,173.0,170.5,119.4,111.3,92.5,82.5,81.8,75.7,71.4,69.0,63.6,47.5,47.3,46.4,43.8,18.7,16.5,13.4。

化合物5

无色柱状晶体(甲醇)，mp245-246℃，(c0.89,甲醇)；uv(乙腈)λmax(logε)：212(3.65)nm；ir(kbr)vmax：3427,1736,1632,1440,1386,1315,1193,1120,1076,1042,987,889,847,817,733cm^-1；hr-esi-msm/z417.1154[m+na]⁺(calcdforc19h22o9na,417.1156)；¹hnmr(300mhz,c5d5n)δ6.09(d,j＝1.4hz,1h),5.60(d,j＝1.4hz,1h),6.00(s,1h),5.71(s,1h),5.19(s,1h),5.14(d,j＝4.8hz,1h),4.83(s,1h),3.93(s,1h)2.58(s,3h),1.60(s,3h)；¹³cnmr(75mhz,c5d5n)δ174.0,173.0,170.5,149.6,119.7,119.4,110.6,92.5,83.1,83.1,78.3,72.3,69.0,63.4,48.3,47.8,46.5,18.7,16.6)

化合物6

无色柱状晶体(甲醇)，mp267-268℃，(c0.51,甲醇)；uv(乙腈)λmax(logε)：241(4.05)nm；ir(kbr)vmax：3425,2945,1726,1660,1435,1381,1344,1262,1122,1064,998,964,902,818,773,698,565,525cm^-1；hr-esi-msm/z419.1674[m+na]⁺(calcdforc20h28o8na,419.1676)；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ6.09(s,1h),5.36(s,1h),4.90(t,j＝2.8hz,1h),4.63(t,j＝3.0hz,1h),4.03(s,1h),3.90(t,j＝2.6hz,1h),2.88(d,j＝13.7hz,1h),2.43(qd,j＝7.3,3.2hz,1h),2.29(dt,j＝14.4,2.9hz,1h),2.11(overlapped,1h),2.10(m,1h),1.97(s,3h),1.52(s,3h),1.23(d,j＝7.3hz,3h),1.18(s,3h)；¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ198.2,175.9,164.5,124.4,82.7,81.5,77.0,75.9,73.7,71.2,48.2,45.0,43.6,43.1,35.9,26.1,22.8,17.4,12.5,12.4。

化合物7

无色针状晶体(甲醇)，mp289-290℃，(c0.61,甲醇)；uv(乙腈)λmax(logε)：241(4.07)nm；ir(kbr)vmax：3466,2952,2906,2717,1733,1653,1496,1389,1313,1227,1126,1056,1014,966,817,766cm^-1；hr-esi-msm/z433.1463[m+na]⁺(calcdforc20h26o9na,433.1469)；¹hnmr(300mhz,c5d5n)δ6.13(s,1h),5.64(s,1h),5.22(d,j＝2.9hz,1h),4.66(d,j＝9.1hz,1h),4.40(s,1h),4.15(brs,1h),4.06(d,j＝9.0hz,1h),3.53(s,1h),3.18(d,j＝12.6hz,1h),2.86(m,1h),2.28(dt,j＝14.7,3.0hz,1h),2.04(td,j＝15.0,12.8,2.4hz,1h),1.87(d,j＝6.6hz,3h),1.77(s,3h),1.63(s,3h)；¹³cnmr(75mhz,c5d5n)δ197.9,175.2,163.1,126.4,110.7,84.9,80.0,76.9,75.4,72.3,67.7,53.1,47.3,46.0,42.6,42.5,26.1,22.8,14.5,11.0。

化合物8

无色针状晶体(甲醇)，mp285-286℃，(c0.65,甲醇)；uv(乙腈)λmax(logε)：241(3.46)nm；ir(kbr)vmax：3410,1737,1673,1622,1504,1435,1385,1357,1313,1261,1230,1156,1121,943,915,866,826,765,697cm^-1；hr-esi-msm/z431.1314[m+na]⁺(calcdforc20h24o9na,431.1313)；¹hnmr(300mhz,c5d5n)δ6.16(brs,1h),6.12(d,j＝1.8hz,1h),5.67(s,1h),5.65(d,j＝1.7hz,1h),5.26(t,j＝2.9hz,1h),4.81(s,1h),4.55(d,j＝8.6hz,1h),4.52(s,1h),4.02(d,j＝8.6hz,1h),3.82(s,1h),3.26(d,j＝12.5hz,1h),2.33(dt,j＝14.9,2.8hz,1h),2.02(td,j＝15.1,12.9,2.5hz,1h),1.78(s,3h),1.62(s,3h)；¹³cnmr(75mhz,c5d5n)δ197.9,174.3,162.9,148.4,126.4,119.7,109.9,84.9,81.3,79.8,76.2,72.1,68.0,52.9,48.1,46.3,42.5,26.0,22.8,10.8。

化合物9

无色针状晶体(甲醇)，mp260-261℃，(c0.19,甲醇)；uv(乙腈)λmax(logε)：200(3.60)nm；ir(kbr)vmax：3508,3304,1727,1629,1390,1308,1246,1213,1116,1041,993,890,850,816,735,709,661cm^-1；hr-esi-msm/z449.1420[m+na]⁺(calcdforc20h26o10na,449.1418)；¹hnmr(400mhz,c5d5n)δ5.81(s,1h),5.70(s,1h),5.11(brs,1h),4.65(brs,1h),4.08(overlapped,1h),4.05(s,1h),4.88(d,j＝8.9hz,1h),4.11(d,j＝8.9hz,1h),1.76(s,3h)和1.64(s,3h)；¹³cnmr(100mhz,c5d5n)δ174.3,135.4,127.4,110.2,84.0,82.2,76.6,75.9,73.1,72.0,67.5,59.9,54.1,49.0,47.0,42.7,42.0,25.8,21.7,11.4。

经结构鉴定得出，化合物1-9分别具有如下面所示的结构式：

其中，结构式1对应化合物1，为eurycomalidea；结构式2对应化合物2，为eurycomalideb；结构式3对应化合物3，为eurycomalactone；结构式4对应化合物4，为13,21-dihydroeurylactoneb；结构式5对应化合物5，为eurylactoneb；结构式6对应化合物6，为14,15β-dihydroxyklaineanone；结构式7对应化合物7，为13,21-dihydroeurycomanone；结构式8对应化合物8，为eurycomanone；结构式9对应化合物9，为longifolactonee。

实施例2：苦木苦味素类化合物对植物病原真菌的抑制作用

(1)受试药物

苦木苦味素类化合物(化合物1-9)，咪鲜胺(阳性对照化合物，商业农药)。

(2)供试真菌菌种

供试真菌菌种有6个，分别为引起香蕉枯萎病的镰刀菌、木瓜炭疽病的胶孢炭疽菌、番石榴叶枯病的小新壳梭孢菌、马铃薯干腐病的茄病镰抱菌、苹果腐烂病的苹果黑腐皮壳菌和番茄早疫病的灰葡萄胞菌。

(3)抗植物真菌活性测定

供试菌平板的制备：在无菌条件下，将纯种供试菌以密波线划法分别接种至无菌pda培养基平板上，27℃培养一周左右，平板上长满菌苔，待用。

培养基的制备及其灭菌：培养基为pda固体培养基，配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、自来水1000ml。具体配制过程为：将去皮马铃薯切至5mm见方大小片状，加入自来水，煮沸20min，8层纱布过滤，在滤液中加入相应量的葡萄糖和琼脂粉，加热搅拌使其溶解，最后加自来水定容至相应量，分装在250ml的三角瓶中并加塞封口(每瓶装100ml培养基)，用高压灭菌锅115℃灭菌30min。

药液的配制：称取化合物咪鲜胺、苦木苦味素类化合物(化合物1-9)各1.00mg于1.5ml无菌离心管中，分别加入1ml丙酮将其溶解。

带药培养基的制备：将灭好菌的三角瓶内的培养基加热溶化并冷却至50℃左右，在超净工作台上经无菌操作分别加入上述准备好的药液，轻轻摇动三角瓶使药液均匀分布于培养基中，苦木苦味素类化合物配成终浓度为50ug/ml的带药培养基，随即趁热倒入5个无菌培养皿(每个培养皿20ml培养基)中制成薄厚均匀的平板，并做好标记，其中咪鲜胺为阳性对照；以相同操作，制备阴性对照丙酮(iml直接加入100ml无菌培养基中)的平板，做标记。

抑菌率测试：在无菌条件下，将供试菌平板用无菌打孔器打出一定数量的菌饼，用接种环托取菌饼置于准备好的带药培养基上，菌丝一面向下，每皿1个菌饼(做三个重复)，做好标记，置于27℃恒温箱中培养72h后取出培养物，用卡尺测量菌落直径(须十字交叉量取两次，三个重复平板都测量，取其平均数)，按照公式(1)计算抑菌率，在50ug/ml的浓度下，各苦木苦味素类化合物抗植物真菌活性的计算结果见表1。

抑菌率＝(阴性对照生长直径-处理生长直径)/(阴性对照生长直径-5)×100％…(1)。

由表1可见，本发明的9个苦木苦味素类化合物均对镰刀菌、胶孢炭疽菌、小新壳梭孢菌、茄病镰孢菌、黑腐皮壳菌及灰葡萄胞菌有较好的防治效果，其中化合物8(eurycomanone)和化合物3(eurycomalactone)的抑菌率均在80％以上活性较好。

表1苦木苦味素类化合物和咪鲜胺对植物真菌的抑菌率

实施例3：化合物8(eurycomanone)能够从香蕉的生长环境中经根部内吸到香蕉根内部，并向上输导从而抑制香蕉枯萎病

将eurycomanone用甲醇溶解，配成10000μg/ml的母液，再用0.5mmcacl2水溶液将母液稀释成100μg/ml的培养液。将事先培育好的香蕉幼苗(6叶期，此前未经eurycomanone处理)放在0.5mmcacl2水溶液中预培养2小时后移入上述已准备好的eurycomanone培养液中，24小时后取香蕉茎及叶片0.5克，捣碎后溶于2ml甲醇中，用高效液相色谱仪可检测到此提取液中含有eurycomanone，经计算，eurycomanone在香蕉茎和顶端叶片(鲜叶片)中的含量分别为67μg/g和53μg/g。将这种内吸了eurycomanone的叶片按实施例2的方法进行接菌(香蕉枯萎病病菌4号小种)做抑菌活性实验，重复3次。

实验结果表明，经内吸了eurycomanone的香蕉叶片处理后7天，对香蕉枯萎病病菌的抑菌率为87.56％。

实施例4：化合物8(eurycomanone)能够从木瓜的生长环境中经根部内吸到木瓜根内部，并向上输导至叶片从而抑制木瓜炭疽病

将eurycomanone用甲醇溶解，配成10000μg/ml的母液，再用0.5mmcacl2水溶液将母液稀释成100μg/ml的培养液。将事先培育的木瓜幼苗(6叶期，此前未经eurycomanone处理)放在0.5mmcacl2水溶液中预培养2小时后移入上述已准备好的eurycomanone培养液中，24小时后取木瓜叶片0.5克，捣碎后溶于2ml甲醇中，用高效液相色谱仪可检测到此提取液中含有eurycomanone，经计算，eurycomanone在木瓜顶端叶片(鲜叶片)中的含量为47μg/g。将这种内吸了eurycomanone的叶片按实施例2的方法进行接菌(木瓜炭疽病菌)做抑菌活性实验，重复3次。

实验结果表明，经内吸了eurycomanone的木瓜叶片处理后7天，对木瓜炭疽病菌的抑菌率为91.71％。

实施例5：化合物8(eurycomanone)能够从番石榴的生长环境中经根部内吸到番石榴根内部，并向上输导至叶片从而抑制番石榴叶枯病

将eurycomanone用甲醇溶解，配成10000μg/ml的母液，再用0.5mmcacl2水溶液将母液稀释成100μg/ml的培养液。将事先培育的番石榴幼苗(6叶期，此前未经eurycomanone处理)放在0.5mmcacl2水溶液中预培养2小时后移入上述已准备好的eurycomanone培养液中，24小时后取番石榴叶片0.5克，捣碎后溶于2ml甲醇中，用高效液相色谱仪可检测到此提取液中含有eurycomanone，经计算，eurycomanone在番石榴顶端叶片(鲜叶片)中的含量为61μg/g。将这种内吸了eurycomanone的叶片按实施例2的方法进行接菌(小新壳梭孢菌)做抑菌活性实验，重复3次。

实验结果表明，经内吸了eurycomanone的番石榴叶片处理后7天，对小新壳梭孢菌的抑菌率为82.38％。

实施例6：化合物8(eurycomanone)能够从圆茄的生长环境中经根部内吸到根内部，并向上输导至叶片从而抑制圆茄镰孢菌病

将eurycomanone用甲醇溶解，配成10000μg/ml的母液，再用0.5mmcacl2水溶液将母液稀释成100μg/ml的培养液。将事先培育的圆茄幼苗(6叶期，此前未经eurycomanone处理)放在0.5mmcacl2水溶液中预培养2小时后移入上述已准备好的eurycomanone培养液中，24小时后取圆茄叶片0.5克，捣碎后溶于2ml甲醇中，用高效液相色谱仪可检测到此提取液中含有eurycomanone，经计算，eurycomanone在圆茄茎和顶端叶片(鲜叶片)中的含量为44μg/g。将这种内吸了eurycomanone的叶片按实施例2的方法进行接菌(圆茄镰孢菌)做抑菌活性实验，重复3次。

实验结果表明，经内吸了eurycomanone的圆茄叶片处理后7天，对圆茄镰孢菌的抑菌率为79.62％。

实施例7：化合物8(eurycomanone)能够从苹果的生长环境中经根部内吸到苹果根内部，并向上输导从而抑制苹果黑腐皮壳菌病

将eurycomanone用甲醇溶解，配成10000μg/ml的母液，再用0.5mmcacl2水溶液将母液稀释成100μg/ml的培养液。将事先培育的苹果幼苗(6叶期，此前未经eurycomanone处理)放在0.5mmcacl2水溶液中预培养2小时后移入上述已准备好的eurycomanone培养液中，24小时后取苹果叶片0.5克，捣碎后溶于2ml甲醇中，用高效液相色谱仪可检测到此提取液中含有eurycomanone，经计算，eurycomanone在苹果顶端叶片(鲜叶片)中的含量为51μg/g。将这种内吸了eurycomanone的叶片按实施例2的方法进行接菌(苹果黑腐皮壳菌)做抑菌活性实验，重复3次。

实验结果表明，经内吸了eurycomanone的苹果叶片处理后7天，对苹果黑腐皮壳菌的抑菌率为79.88％。

实施例8：化合物8(eurycomanone)能够从葡萄的生长环境中经根部内吸到葡萄根内部，并向上输导从而抑制灰葡萄胞菌病

将eurycomanone用甲醇溶解，配成10000μg/ml的母液，再用0.5mmcacl2水溶液将母液稀释成100μg/ml的培养液。将事先培育的葡萄幼苗(6叶期，此前未经eurycomanone处理)放在0.5mmcacl2水溶液中预培养2小时后移入上述已准备好的eurycomanone培养液中，24小时后取葡萄茎及叶片0.5克，捣碎后溶于2ml甲醇中，用高效液相色谱仪可检测到此提取液中含有eurycomanone，经计算，eurycomanone在葡萄顶端叶片(鲜叶片)中的含量为71μg/g。将这种内吸了eurycomanone的叶片按实施例2的方法进行接菌(灰葡萄胞菌)做抑菌活性实验，重复3次。

实验结果表明，经内吸了eurycomanone的葡萄叶片处理后7天，对灰葡萄胞菌的抑菌率为90.21％。

实施例9：1％化合物8(eurycomanone)水乳剂的配制及其在田间防治香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的效果

1、将eurycomanone配成水乳剂，组分及各组分的重量百分比如下：

(1)有效成分(eurycomanone)：1％；

(2)溶剂(甲醇)：2％；

(3)乳化剂(农乳500号)：2％；

(4)共乳化剂(异丁醇)：2％；

(5)防冻剂(丙三醇)：1％；

(6)密度调节剂(氯化钠)：0.5％；

(7)ph值调节剂(磷酸)：0.1％；

(8)消泡剂(十八烷基三甲基氯化铵)：0.1％；

(9)水(去离子水)：91.3％。

制备方法为：将上述组分中的有效成分、溶剂、乳化剂、共乳化剂混合，溶解成均匀油相，然后将其余组份混合成均匀水相，在高速搅拌下将水相加入油相中，即成分散良好的1％eurycomanone水乳剂。

2、用上述制备的1％eurycomanone水乳剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病进行田间试验，共设6个处理，每个处理重复3次，小区面积24m²(4m*6m)，共18个小区，随机区组排列，四周设保护行。试验在广东省农业科学院果树研究所试验基地内进行，试验地土壤、肥力、水分条件一致，田间管理同大田生产基本一致。分别在香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病发生初期开始施第1次药，间隔7d施第2次药，共施药2次。试验分为灌根施药和喷雾施药两种方式，用药液量为每颗100mg。田间调查方法采用小区以对角线5点取样，每点固定调查3株，调查全部叶片数，每小区共查15株。第1次施药前调查病情基数，第1次施药后7d、第2次施药后10d调查病情指数，水乳剂稀释倍数分别为10、20和40倍。根据发病症状，按照表2的格式记载病情级别，按照公式(2)计算出病情指数，后根据公式(3)计算田间防效。苗期病情级别及其相对应的症状描述见表2。

表2病情分级标准

di＝∑(s×n)/(n×9)×100……………………………………………(2)。

di——病情指数；

s——各病情指数级别的级数；

n——各病情指数级别的叶片数；

n——调查总叶片数。

防治效果＝(对照区病指数-处理区病指数)/对照区病指数x100％………(3)。

3、结果

由表3和表4的田间防治效果可以看出，1％eurycomanone水乳剂通过灌根和叶面喷施的方式均对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的具有较好的防治效果，但喷雾的方式效果更好。

表31％eurycomanone水乳剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的防治效果(灌根)

表41％eurycomanone水乳剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的防治效果(喷雾)

实施例10：5％化合物8(eurycomanone)水乳剂的配制及其在田间防治香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的效果

1、将eurycomanone配成水乳剂，组分及各组分的重量百分比如下：

(1)有效成分(eurycomanone)：5％；

(2)溶剂(甲醇)：2％；

(3)乳化剂(宁乳130)：2％；

(4)共乳化剂(1-十二烷醇)：1％；

(5)防冻剂(丙三醇)：1％；

(6)密度调节剂(氯化钙)：0.5％；

(7)ph值调节剂(磷酸)：0.1％；

(8)消泡剂(十八烷基三甲基氯化铵：0.1％；

(9)水(去离子水)：88.3％。

制备方法为：将上述组分中的有效成分、溶剂、乳化剂、共乳化剂混合，溶解成均匀油相，然后将其余组份混合成均匀水相，在高速搅拌下将水相加入油相，即成分散良好的5％eurycomanone水乳剂。

2、用以上制备的5％eurycomanone水乳剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病进行田间试验，试验设计和计算公式同实施例9，不同之处在于水乳剂稀释倍数分别为50、100和200倍。

3、结果

由表5和表6的田间防治效果可以看出，5％eurycomanone水乳剂通过灌根和叶面喷施的方式均对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的具有较好的防治效果，但喷雾的方式效果更好。

表55％eurycomanone水乳剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的防治效果(灌根)

表65％eurycomanone水乳剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的防治效果(喷雾)

实施例11：10％化合物8(eurycomanone)水乳剂的配制及其在田间防治香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的效果

1、将eurycomanone配成水乳剂，组分及各组分的重量百分比如下：

(1)有效成分(eurycomanone)：10％；

(2)溶剂(甲醇)：5％；

(3)乳化剂(吐温80)：5％；

(4)共乳化剂(1-十四烷醇)：5％；

(5)防冻剂(丙三醇)：2％；

(6)密度调节剂(氯化钙)：0.5％；

(7)ph值调节剂(磷酸)：0.1％；

(8)消泡剂(十八烷基三甲基氯化铵)：0.1％；

(9)水(去离子水)：72.3％。

制备方法为：将上述组分中的有效成分、溶剂、乳化剂、共乳化剂混合，溶解成均匀油相，然后将其余组份混合成均匀水相，在高速搅拌下将水相加入油相，即成分散良好的10％eurycomanone水乳剂。

2、用以上制备的10％eurycomanone水乳剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病进行田间试验，试验设计和计算公式同实施例9，不同之处在于水乳剂稀释倍数分别为100、200和400倍。

3、结果

由表7和表8的田间防治效果可以看出，5％eurycomanone水乳剂通过灌根和叶面喷施的方式均对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的具有较好的防治效果，但喷雾的方式效果更好。

表710％eurycomanone水乳剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的防治效果(灌根)

表810％eurycomanone水乳剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的防治效果(喷雾)

实施例12：20％化合物8(eurycomanone)水乳剂的配制及其在田间防治香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的效果

1、将eurycomanone配成水乳剂，组分及各组分的重量百分比如下：

(1)有效成分(eurycomanone)：20％；

(2)溶剂(甲醇)：5％；

(3)乳化剂(吐温80)：5％；

(4)共乳化剂(1-十四烷醇)：5％；

(5)防冻剂(丙三醇)：2％；

(6)密度调节剂(氯化钙)：0.5％；

(7)ph值调节剂(磷酸)：0.1％；

(8)消泡剂(十八烷基三甲基氯化铵)：0.1％；

(9)水(去离子水)：62.3％。

制备方法为：将上述组分中的有效成分、溶剂、乳化剂、共乳化剂混合，溶解成均匀油相，然后将其余组份混合成均匀水相，在高速搅拌下将水相加入油相，即成分散良好的20％eurycomanone水乳剂。

2、用以上制备的20％eurycomanone水乳剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病进行田间试验，试验设计和计算公式同实施例9，不同之处在于水乳剂稀释倍数分别为200、400和800倍。

3、结果

由表9和表10的田间防治效果可以看出，5％eurycomanone水乳剂通过灌根和叶面喷施的方式均对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的具有较好的防治效果，但喷雾的方式效果更好。

表920％eurycomanone水乳剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的防治效果(灌根)

表1020％eurycomanone水乳剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的防治效果(喷雾)

实施例13：30％化合物8(eurycomanone)微乳剂的配制及其在田间防治香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的效果

1、将eurycomanone配成微乳剂，组分及各组分的重量百分比如下：

(1)有效成分(eurycomanone)：30％；

(2)溶剂(甲醇)：10％；

(3)乳化剂(农乳300号)：10％；

(4)稳定剂(正丁基缩水甘油醚)：3％；

(5)防冻剂(乙二醇)：5％；

(6)水(去离子水)：42％。

制备方法为：将上述组分中的有效成分、溶剂、乳化剂、稳定剂、防冻剂混合成均匀油相，然后在搅拌下慢慢加入去离子水，即形成油包水型乳状液，再经搅拌加热，使之迅速转相形成水包油型，冷至室温使之达到平衡，经过滤可得稳定的30％水包油型eurycomanone微乳剂。

2、用以上制备的30％eurycomanone微乳剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病进行田间试验，试验设计和计算公式同实施例9，不同之处在于微乳剂稀释倍数分别为300、600和1200倍。

3、结果

由表11和表12的田间防治效果可以看出，30％eurycomanone微乳剂通过灌根和叶面喷施的方式均对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的具有较好的防治效果，但喷雾的方式效果更好。

表1130％eurycomanone微乳剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的防治效果(灌根)

表1230％eurycomanone微乳剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的防治效果(喷雾)

实施例14：40％化合物8(eurycomanone)微乳剂的配制及其在田间防治香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的效果

1、将eurycomanone配成微乳剂，组分及各组分的重量百分比如下：

(1)有效成分(eurycomanone)：40％；

(2)溶剂(甲醇)：10％；

(3)乳化剂(琥珀酸二异辛酯磺酸钠)：10％；

(4)稳定剂(邻甲苯基缩水甘油醚)：3％；

(5)防冻剂(乙二醇)：8％；

(6)水(去离子水)：29％。

制备方法为：将上述组分中的有效成分、溶剂、乳化剂、稳定剂、防冻剂混合成均匀油相，然后在搅拌下慢慢加入去离子水，即形成油包水型乳状液，再经搅拌加热，使之迅速转相形成水包油型，冷至室温使之达到平衡，经过滤可得稳定的40％水包油型eurycomanone微乳剂。

2、用以上制备的40％eurycomanone微乳剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病进行田间试验，试验设计和计算公式同实施例9，不同之处在于微乳剂稀释倍数分别为400、800和1600倍。

3、结果

由表13和表14的田间防治效果可以看出，40％eurycomanone微乳剂通过灌根和叶面喷施的方式均对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的具有较好的防治效果，但喷雾的方式效果更好。

表1340％eurycomanone微乳剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的防治效果(灌根)

表1440％eurycomanone微乳剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的防治效果(喷雾)

实施例15：50％化合物8(eurycomanone)微乳剂的配制及其在田间防治香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的效果

1、将eurycomanone配成微乳剂，组分及各组分的重量百分比如下：

(1)有效成分(eurycomanone)：50％；

(2)溶剂(甲醇)：10％；

(3)乳化剂(琥珀酸二异辛酯磺酸钠)：10％；

(4)稳定剂(邻甲苯基缩水甘油醚)：3％；

(5)防冻剂(丙三醇)：10％；

(6)水(去离子水)：17％。

制备方法为：将上述组分中的有效成分、溶剂、乳化剂、稳定剂、防冻剂混合成均匀油相，然后在搅拌下慢慢加入去离子水，即形成油包水型乳状液，再经搅拌加热，使之迅速转相形成水包油型，冷至室温使之达到平衡，经过滤可得稳定的50％水包油型eurycomanone微乳剂。

2、用以上制备的50％eurycomanone微乳剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病进行田间试验，试验设计和计算公式同实施例9，不同之处在于微乳剂稀释倍数分别为500、1000和2000倍。

3、结果

由表15和表16的田间防治效果可以看出，50％eurycomanone微乳剂通过灌根和叶面喷施的方式均对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的具有较好的防治效果，但喷雾的方式效果更好。

表1550％eurycomanone微乳剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的防治效果(灌根)

表1650％eurycomanone微乳剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的防治效果(喷雾)

实施例16：70％化合物8(eurycomanone)干悬浮剂的配制及其在田间防治香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的效果

1、将eurycomanone配成干悬浮剂，组分及各组分的重量百分比如下

(1)有效成分(eurycomanone)：70％；

(2)分散剂(棉籽饼蛋白水解物，其中固体物的含量为40％)：25％；

(3)乳化剂(吐温80)：5％。

上述组分中的棉籽饼蛋白水解物的制备过程是：将棉籽饼、石灰和水的重量比定为1:0.2:5，先用少量的水将石灰配成石灰乳，再在反应锅中加入剩余的水和石灰乳，加热至沸腾，然后投入棉籽饼并进行搅拌，在保持沸腾状态下水解2小时，在水解过程中随时补充由于蒸发失去的水量。水解结束后稍冷却，再用盐酸中和到ph＝8、搅拌、加热至沸腾，过滤得到棕红色透明液，再将过滤好的水解液放入浓缩锅中加热浓缩5小时，可得到固体物含量为40％的棉籽饼蛋白水解物。

将上述棉籽饼蛋白水解物加热至沸腾，在沸腾状态下加入eurycomanone和吐温80，同时搅拌使充分分散，将此调制好的物料在90℃干燥2分钟，即可得到70％eurycomanone干悬浮剂。

2、用以上制备的70％eurycomanone干悬浮剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病进行田间试验，试验设计和计算公式同实施例9，不同之处在于干悬浮剂稀释倍数分别为700、1400和2800倍。

3、结果

由表17和表18的田间防治效果可以看出，70％eurycomanone干悬浮剂通过灌根和叶面喷施的方式均对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的具有较好的防治效果，但喷雾的方式效果更好。

表1770％eurycomanone干悬浮剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的防治效果(灌根)

表1870％eurycomanone干悬浮剂对香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病的防治效果(喷雾)

由实施例9-16可以看出，可以将化合物8(eurycomanone)制备成水乳剂、微乳剂和干悬浮剂的形式用于防治香蕉枯萎病、木瓜炭疽病和番石榴叶枯病，其中，采用1％eurycomanone水乳剂10倍稀释液以喷雾的方式获得的防治效果最佳。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除