一种改良植物组培的快繁方法与流程

本发明涉及农业技术领域，具体涉及一种改良植物组培的快繁方法。

背景技术：

菊花[dendranthemamorifolium(ramat.)tzvel.]为菊科多年生宿根草本植物，是我国的传统名花，也是世界四大切花之一，是一种被广泛栽培的重要花卉。菊花目前主要用于园林的绿化和观赏，如制作花束、花环、观赏盆花、秋季花坛、花台、盆花群等，深受人们喜爱。菊花传统的繁殖方法主要是扦插和嫁接，但存植株病毒逐代积累加重、品质退化、繁殖速度不快、易受季节变化和外界环境条件的影响、病虫害发生频率高等缺点，为解决这些问题，目前最有效的技术措施之一是采用组织培养技术。

植物组织培养技术从20世纪初的探索至今的迅速发展，在农、林业和园艺花卉植物优良品种的快速繁育、脱毒苗工厂化生产等方面发挥了巨大作用，给一些大型组培苗术生产经营公司带来了可观的经济效益和社会效益，成为当代生物科学中最有生命力的学科之一。常规的植物组培技术需要在十分苛刻的无菌环境进行，始终存在着对设备条件要求高，且操作程序复杂、技术精细、能源消耗大、培养成本高、污染率高、外植体无菌系获取难、移栽成活率低等诸多问题，影响和制约着植物组培技术的普及应用。并且针对菊花的组织培养技术主要涉及激素、菊花增殖量、生根量的关系，且生根量并不理想，至于种苗综合素质更是几乎没有涉及。因此，建立完善的菊花组织培养的快繁技术体系，对菊花脱毒复壮、工厂化快繁育苗、种质资源保存等，具有重要意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种改良植物组培的快繁方法，通过本发明方法繁殖的菊花组培苗污染率低，移栽后生根率、成活率均得到了提高，且根系健壮。

为了解决上述问题，发明人对组培操作程序进行了改进，简化了组培繁育程序和设备条件，具体地，本发明提供的技术方案是：

一种改良植物组培的快繁方法，包括如下步骤：

快繁阶段：采用抗菌培养基、分化培养基、壮苗培养基依次进行组培苗培育；

生根阶段：将在培养基中培育好的组培苗栽植到基质中后用消毒生根混合液喷施；

其中，所述抗菌培养基中用到的抗菌剂包括如下重量份组分：链霉素1.8mg/l～2.5mg/l、庆大霉素2.5mg/l～4mg/l、青霉素0.8mg/l～1.5mg/l、蒜素4.5mg/l～6mg/l；

所述消毒生根混合液包括如下重量份组分：悪霉灵2000倍液100～150mg/lml/l、邻苯二酚3mg/l～8mg/l、吲哚乙酸7～12mg/l。

进一步地，所述抗菌培养基中用到的抗菌剂包括如下重量份组分：链霉素2mg/l、庆大霉素3mg/l、青霉素1mg/l、蒜素5mg/l；

所述消毒生根混合液包括如下重量份组分：悪霉灵2000倍液100ml/l、邻苯二酚5mg/l、吲哚乙酸10mg/l。

所述消毒生根混合液在促进生根上呈现明显增效作用，悪霉灵与邻苯二酚能有效抑制体内吲哚乙酸氧化酶的生物活性，从而使外源处理的吲哚乙酸能充分发挥其诱导生根的作用，效果显著。

进一步地，所述分化培养基为：ms培养基+6-ba0.8～1.2mg/l+naa0.08～0.1mg/l+琼脂4.5～5.5g/l+糖24～28g/l，优选为ms培养基+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l+琼脂5g/l+糖26g/l。

进一步地，所述壮苗培养基为：ms培养基+琼脂5g/l+糖26g/l。

进一步地，所述抗菌培养基中还包括植物生长调节剂。

更进一步地，所述植物生长调节剂为0.5～1.5mg/l6-ba、0.08～0.12mg/lnaa，6-ba、naa纯度均为99.0％。

在本发明具体实施方式中，所述ms培养基包括大量元素、微量元素、铁盐10～20mg/l、有机物5～10mg/l；

所述有机物包括包括如下重量份组分：烟酸0.5～1.0mg/l、盐酸吡哆醇0.2～0.5mg/l、叶酸0.1～0.3mg/l、肌醇100～150mg/l、谷氨酸2～5mg/l，将上述有机物各个组分溶解后混合或者混合后溶解，配制成浓度为5～10mg/l的溶液；

所述大量元素包括硝酸氨1200～1500mg/l、硝酸钾1600～1800mg/l、二水氯化钙400～420mg/l、七水硫酸镁350～365mg/l、磷酸二氢钾160～175mg/l；

所述微量元素包括碘化钾7.5～8.5mg/l、硼酸50～60mg/l、四水硫酸锰200～250mg/l、七水硫酸锌75～85mg/l、二水钼酸钠2.0～2.5mg/l、五水硫酸铜0.2～0.25mg/l、六水氯化钴0.2～0.25mg/l。

进一步地，所述基质为1:1的珍珠岩、蛭石。

进一步地，所述消毒生根混合液喷施的频率为2～3天/次。

在本发明具体实施方式中，所述快繁阶段的组培苗接种时在开放式工作台进行。

本发明具有如下有益效果：

(1)本发明操作过程仅需在消毒后的工作台面上就可进行，操作便捷，接种100个外植体，只需4～5h，提高了50％工作效率。

(2)本发明不需紫外照射、高压灭菌，且利用自然光培养替代无菌室内人工灯光培养，降低了植物组织培养技术的门槛和生产成本，有利于普及推广应用。

(3)本发明将生根与炼苗结合起来，简化了瓶内试管苗生根培养环节，省工省时，节约生根培养时间20天，生根率平均高出20％，根系生长多而粗壮，移栽成活率高出28％。

(4)本发明抗菌剂中各个组分协同增效，对多种细菌、病毒、真菌等病原微生物都有不同程度的抑制和杀灭作用，杀菌效果显著，能够降低组培苗污染率。

具体实施方式

下面对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1

一、准备工作

1、抗菌培养基配制

称琼脂5g、蔗糖26g，加水熬煮，融化后依次倒入由1450mg/l硝酸氨、硝1700mg/l酸钾、400mg/l二水氯化钙、350mg/l七水硫酸镁、170mg/l磷酸二氢钾配制的大量元素溶液，由0.85mg/l碘化钾、5.5mg/l硼酸、25mg/l4水硫酸锰、8.0mg/l七水硫酸锌、0.2.5mg/l二水钼酸钠、0.025mg/l五水硫酸铜、0.025mg/l六水氯化钴配制的微量元素溶液，10mg/l铁盐、8.0mg/l有机物(有机物成分由烟酸0.8mg/l、盐酸吡哆醇0.3mg/l、叶酸0.2mg/l、肌醇125mg/l、谷氨酸4mg/l组成，溶解后混合)，植物生长调节剂1.0mg/l6-ba、0.1mg/lnaa混合煮沸后定容，调整ph值为5.8～6.0，加入链霉素2mg/l、庆大霉素3mg/l、青霉素1mg/l、蒜素5mg/l，煮沸2分钟，分装后，凝固。

2、分化培养基、壮苗培养基的配方与配制

按照下列配方进行配制：

分化培养基：ms+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l+琼脂5g/l+糖26g/l

壮苗培养基：ms+琼脂5g/l+糖26g/l

3、培养瓶、接种用具浸泡消毒

拧开培养瓶和盖，剪刀、镊子等工具，放入含有2％新洁尔灭的水溶液中浸泡10分钟，放到10％奥克泰士消毒杀菌液中浸泡30分钟，取出培养瓶倒立在消毒后的工作台面上备用，剪刀、镊子放入75％酒精瓶中备用。

4、房间消毒

关好门窗密闭房间，按每平方米20～25ml用高猛酸钾1％克+甲醛15ml进行熏蒸两小时，打开门窗，通风换气，用75％酒精喷雾降尘。

二、外植体表面清洗与消毒

1、外植体选择

选择生长健壮无病虫害感染的当年生菊花嫩茎干，剪去叶片，再剪成带两个叶节的茎段。

2、表面清洗与消毒

滴加几滴洗洁精进水中，水的用量能够淹没材料，振荡洗涤5～6分钟后用自来水冲洗20分钟，冲洗干净后用70％酒精浸泡8秒，0.1％氯化汞浸泡10分钟，最后用无菌水振荡洗涤5次，每次5分钟。

三、接种与培养

1、接种方法

用肥皂洗干净双手—用75％酒精擦拭工作台和双手—打开瓶盖—从75％酒精瓶中取出工具—将消毒灭菌的外植体接种到抗菌培养基中，盖紧瓶口。

2、室内培养

将在抗菌培养基中培养3天，将无污染的外植体转接至分化培养基上，选择光照条件好，东面和西面有窗户的房间，把接种后的组培苗摆放在培养架上，调控室内温度在25±2℃，利用室外光源，在自然光下培养，一周后外植体基部形成愈伤组织，叶节处长出腋芽，10天后开始分化出丛生芽，每个外植体能分化出10～20个从生芽。

四、壮苗培养

从生芽生长到苗高1.5～2㎝左右，切下侧芽，转接到壮苗培养基上，调控室内温度在25±2℃，10～15天苗高5～7㎝。

五、瓶外生根与移栽结合

用1：1的珍珠岩、蛭石配制栽植基质，清水浇淋基质后装入50穴的育苗穴盘，从培养瓶中取出无根组培苗，用清水洗掉附着在苗上的培养基，栽入练苗栽植穴盘压力紧基质，用悪霉灵2000倍液100mg/l、邻苯二酚5mg/l、吲哚乙酸10mg/l配制的消毒生根混合液喷施，2～3天/次。

对比例1

与实施例1相比，抗菌剂不同，在配制抗菌培养基时，将链霉素1mg/l、庆大霉素2mg/l、青霉素3mg/l加入到培养基中。

对比例2

与实施例1相比，抗菌剂不同，在配制抗菌培养基时，将链霉素3mg/l、庆大霉素1mg/l、青霉素2mg/l加入到培养基中。

对比例3

与实施例1相比，进行常规组培操作。

一、配制培养基

1、培养基配方

按照配方配制初代培养基、继代培养基、生根培养基。

初代培养基：ms+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l+琼脂7g/l+糖30g/l

继代培养基：ms+6-ba1.5mg/l+naa0.1mg/l+琼脂7g/l+糖30g/l

生根培养基：1/2ms+naa0.5mg/l+琼脂7g/l+糖30g/l

2、培养基高压灭菌

将分装好的培养瓶、接种工具放入高压灭菌器，在0.105mpa、温度121℃、灭菌21min，取出备用。

二、外植体表面清洗与消毒

与实施例1中对外植体表面清洗与消毒的步骤相同。

三、无菌接种与培养

1、无菌接种，在无菌室内，提前20分钟开启紫外线灯和超净工作台，在超净工作上，点燃酒精灯，接种工具放入75％酒精瓶，取出接种工具在酒精灯灼浇30～50秒后，冷却后，按常规无菌操作程序，把外植体接种到经高压灭菌后的培养基上。

2、无菌培养，把己接种菊花材料的培养瓶，放在无菌培养室内培养架上，控制室内温度25±2℃、光照强度2000ix、光照时间每天12～14小时，25天后长出1～3个侧芽。

四、继代培养

侧芽长到1～2㎝，切下侧芽，转接到新鲜分化培养基上，25天后每个茎段分化出2～5个侧芽，侧芽长到5㎝再剪下侧芽接于继代代培养基上继代增殖培养，25～28天为一个继代周期。

五、生根培养与练苗移栽

1、生根培养：将无根苗转入生根培养基(1/2ms+naa0.5mg/l)，调控室内温度25±2℃、光照强度2000～2500ix、光照时间每天12～14小时，15天开始根生。

2、练苗与移栽：移栽前一周，将试管瓶苗从培养室移出，放在室内自然温度、光照条件下，打开瓶盖，将试管苗暴露于空气中5～7天。将珍珠岩、蛭石按照1：1的比例混合配制栽植基质，清水冲淋后取出组培苗，用清水洗掉附着在苗上的培养基，栽插在基质中适当压紧基质，完毕后用喷雾器雾化喷湿小苗，搭小拱棚，棚内保持基质湿润，使空气相对湿度90％。

对实施例1、对比例1、2中抗菌组合物的筛选实验进行结果统计。

表1不同抗菌组合物筛选实验结果统计

由表1可知，与对比例1、2相比，采用实施例1中的抗菌剂，组培苗污染率较低。

对实施例1(改良组培)、对比例3(常规组培)中的组培苗及生根移栽情况进行对比。

表2组培苗瓶外生根情况

由表2可知，与对比例3相比，实施例1的组培苗移栽后，7天后生根率就达到了50％，在第15天时，生根率达到了100％，移栽后缓根时间短、根系短而粗壮、生长快，成活率高，苗生长壮，而对比例3采用常规方式进行接种培养殖、瓶内生根、炼苗移栽，在瓶内进行了20天的生根培养，炼苗移栽后，第15天时，生根率只有20％，生根迟、慢、根细长，缓根时间长，苗生长慢。

表3改良组培与常规组培对比情况

由表3可知，与对比例3相比，实施例1接种的组培苗污染率为0，组培苗瓶外生根只需15天，且生根率为100％，成活率达到98％，而对比例3瓶内生根后再进行炼苗移栽，总共需要35天，时间长，且移栽后生根率仅为80％，成活率仅为70％。

因此，由表1～3可知，采用本发明的抗菌剂、消毒生根混合液，能够节约生根培养时间20天，生根率平均高出20％，根系生长多而粗壮，移栽成活率高出28％。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解为在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

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