含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物的制备方法与流程

本发明属于药物制备技术领域，尤其涉及一种含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物的制备方法。

背景技术：

癌症是恶性肿瘤中最常见的一类，癌症已经严重威胁着民众的生活质量和生命安全。癌症具有细胞分化和增殖异常、生长失去控制、浸润性和转移性等生物学特征，其发生是一个多因子、多步骤的复杂过程，分为致癌、促癌、演进三个过程，与吸烟、感染、职业暴露、环境污染、不合理膳食、遗传因素密切相关。

目前为止，手术、放射疗法及利用抑制细胞增殖的化疗剂的抗癌剂治疗为主要方法。但是，目前治疗癌症的药物多为靶向药物，需要做基因检测后进行口服，其使用人群有限制，无法适用于绝大多数癌症患者；由于疗效个体的差异、耐药性、复发率等难治性，现有药物疗效并不理想。同时，现有的治疗癌症的药物副作用大，增加患者患其他病症的风险。

最近，间变性淋巴瘤激酶(alk，anaplasticlymphomakinase)在人体多种肿瘤中被发现，从而作为靶向治疗的目标研究。间变性淋巴瘤激酶的致癌过程主要为在间变性大细胞淋巴瘤观察出的alk-npm(nucleophosmin，核仁磷酸蛋白)的融合基因。若通过基因融合使间变性淋巴瘤激酶活性化，则使具有间变性淋巴瘤激酶的酪氨酸激酶发生异常行，从而引发癌症。即被非正常地活性化的间变性淋巴瘤激酶诱导细胞的增殖，并通过妨碍细胞凋亡来繁殖细胞凋亡，并且通过重新排列细胞骨架来改变细胞形态。间变性淋巴瘤激酶的癌基因化通过与作为间变性淋巴瘤激酶的目标物质的下游分子(downstreammolecule)的相互作用来实现，下游分子为介导细胞内的信号传递的物质。间变性淋巴瘤激酶与正常或癌基因化的其它酪氨酸激酶相连接，从而进行相互作用或是多种种类的其它路径活性化。

尤其，在肺癌细胞的内部，间变性淋巴瘤激酶基因与棘皮动物微管相关蛋白样4(eml4，echinodermmicrotubule-associatedprotein-like4)基因相融合，从而生成作为活性形酪氨酸激酶(tyrosinekinase)的eml4-alk，此时，已知eml4-间变性淋巴瘤激酶的癌化能力依赖于酶活性，并且，mosse等公开了在491个神经母细胞瘤试料中与约26％的间变性淋巴瘤激酶基因扩增相关的内容。而且，已确认间变性淋巴瘤激酶基因表达于大型b细胞淋巴瘤、全身性组织细胞瘤、炎性肌纤维母细胞瘤、食管鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、横纹肌肉瘤、肌纤维母细胞瘤、乳房癌及黑瘤细胞株等许多非造血细胞肿瘤，在称为炎症性肌纤维母细胞瘤的罕见疾病的情况下，常常发现多种种类的间变性淋巴瘤激酶融合蛋白，从而认为这些融合蛋白与肿瘤的产生密切相关。

本发明者在开发具有抗癌作用的药物的过程中，了解到特定结构的嘧啶-2，4-二胺衍生物具有非常优秀的间变性淋巴瘤激酶的活性抑制效果，从而可适用于癌症预防或治疗剂。同时，纳米凝胶载体的粒径小、载药率高，其能够在发挥药物作用的同时，减少抗癌药物带来的副作用。因此，将含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物与纳米凝胶载体相结合，是有前景的新抗癌疗法。

综上所述，现有技术存在的问题是：目前治疗癌症的药物多为靶向药物，需要做基因检测后进行口服，其使用人群有限制，无法适用于绝大多数癌症患者；由于疗效个体的差异、耐药性、复发率等难治性，现有药物疗效并不理想。同时，现有的治疗癌症的药物副作用大，增加患者患其他病症的风险。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物的制备方法。

本发明是这样实现的，一种含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物的制备方法，所述含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物的制备方法包括以下步骤：

步骤一，将嘧啶-2,4-二胺衍生物溶于乙醇中，搅拌均匀后加入酸，通过减压蒸馏装置进行减压蒸馏得到混合溶剂。

步骤二，室温条件下，在混合溶剂中加入丙酮，过滤后得到衍生物结晶，将衍生物结晶进行充分研磨得到结晶粉末。

步骤三，升高反应温度至80℃，将结晶粉末溶于二氯甲烷后，雾化到聚山梨醇酯溶液中，溶出结晶微粒。

步骤四，将带正电的壳聚糖与带负电的三聚磷酸盐交联，得到壳聚糖链交联的纳米载药凝胶。

步骤五，在纳米载药凝胶上装载结晶微粒，得到含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物。

进一步，步骤一中，所述嘧啶-2,4-二胺衍生物的化学式为：

其中，a为c、o、n或是s；

a为c、o、n或是s；

a为0-4的整数；

b为0-4的整数；

r¹为-h、-oh、卤素或者未取代或一个以上卤素被取代的c1-10的直链或侧链烷基；

r²、r³、r⁴、r⁵为-h、-oh、卤素或者未取代或一个以上卤素被取代的c1-10的直链或侧链烷基、未取代或一个以上羟基被取代的c1-10的直链或侧链烷基、c1-10的直链或侧链烷基、包含一个以上的选自由n、o以及s组成的组中的环杂原子的未取代或取代的3-10原子环杂烷基、未取代的c6-10的芳基被取代的直链或侧链的烷基；

r⁶为-h、卤素或者未取代或一个以上卤素被取代的c1-10的直链或侧链烷基；

r⁷为c1-10的直链或侧链烷基；

r⁸为卤素。

进一步，步骤一中，所述酸为有机酸或是无机酸，具体包括：

无机酸为盐酸、硝酸、磷酸、硫酸中的一种；

有机酸为柠檬酸、乳酸、葡萄糖酸、酒石酸、羟基链羧酸、羟基链烷二酸酯中的一种。

进一步，步骤二中，所述丙酮为二羟基丙酮。

进一步，步骤三中，所述聚山梨醇酯溶液的制备方法如下：

(1)以山梨醇为原料，在脱水催化剂namor的作用下，山梨醇进行脱水反应生成异山梨醇。

(2)加入苯甲酸和酯化催化剂naoh，使原位生成的异山梨醇和一元羧酸进行酯化反应，经减压蒸馏得到聚山梨醇酯产品。

进一步，步骤四中，所述三聚磷酸盐为三聚磷酸钠、三聚磷酸钾或三聚磷酸钙中的一种。

进一步，步骤四中，所述带正电的壳聚糖与带负电的三聚磷酸盐交联时，带正电的壳聚糖的pka值为6.5。

进一步，步骤五中，所述在纳米载药凝胶上装载结晶微粒的方法为：

1)将纳米载药凝胶与结晶微粒混合，加入去离子水得到混合液。

2)对混合液进行120℃加热，加热持续10min。

3)加入中性盐并搅拌，得到析出物质后固化，得到装载结晶微粒的纳米球。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述的含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物的制备方法制备得到的含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物。

本发明的另一目的在于提供一种含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物在神经系统肿瘤、消化系统肿瘤、生殖系统肿瘤、泌尿系统肿瘤、皮肤肿瘤、骨肿瘤、关节系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、血液及腺体肿瘤治疗中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明使用嘧啶-2,4-二胺衍生物作为有效成分进行药物制备，得到的药物能够有效抑制间变性淋巴瘤激酶的活性，从而可以广泛适用于癌症治疗；无需做基因检测后进行口服，使用方便，使用人群限制性小，适用于绝大多数癌症患者；药物副作用小，不会产生耐受性；同时，纳米载体的粒径小、载药率高，其使用能够在杀死癌细胞的同时，减少抗癌药物带来的副作用。实验表明，本发明提供的含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物疗效明显，特别是对淋巴瘤、神经母细胞癌、肺癌、白血病、甲状腺瘤等癌症作用更加突出。

附图说明

图1是本发明实施例提供的含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物的制备方法的流程图。

图2是本发明实施例提供的聚山梨醇酯溶液的制备方法流程图。

图3是本发明实施例提供的在纳米载药凝胶上装载结晶微粒的方法流程图。

图4-5是本发明实施例提供的含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物对肿瘤细胞增殖的影响示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物的制备方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物的制备方法包括以下步骤：

s101，将嘧啶-2,4-二胺衍生物溶于乙醇中，搅拌均匀后加入酸，通过减压蒸馏装置进行减压蒸馏得到混合溶剂。

s102，室温条件下，在混合溶剂中加入丙酮，过滤后得到衍生物结晶，将衍生物结晶进行充分研磨得到结晶粉末。

s103，升高反应温度至80℃，将结晶粉末溶于二氯甲烷后，雾化到聚山梨醇酯溶液中，溶出结晶微粒。

s104，将带正电的壳聚糖与带负电的三聚磷酸盐交联，得到壳聚糖链交联的纳米载药凝胶。

s105，在纳米载药凝胶上装载结晶微粒，得到含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物。

本发明实施例提供的步骤s101中，所述嘧啶-2,4-二胺衍生物的化学式为：

其中，a为c、o、n或是s；

a为c、o、n或是s；

a为0-4的整数；

b为0-4的整数；

r¹为-h、-oh、卤素或者未取代或一个以上卤素被取代的c1-10的直链或侧链烷基；

r²、r³、r⁴、r⁵为-h、-oh、卤素或者未取代或一个以上卤素被取代的c1-10的直链或侧链烷基、未取代或一个以上羟基被取代的c1-10的直链或侧链烷基、c1-10的直链或侧链烷基、包含一个以上的选自由n、o以及s组成的组中的环杂原子的未取代或取代的3-10原子环杂烷基、未取代的c6-10的芳基被取代的直链或侧链的烷基；

r⁶为-h、卤素或者未取代或一个以上卤素被取代的c1-10的直链或侧链烷基；

r⁷为c1-10的直链或侧链烷基；

r⁸为卤素。

本发明实施例提供的步骤s101中，所述酸为有机酸或是无机酸，具体包括：

无机酸为盐酸、硝酸、磷酸、硫酸中的一种；

有机酸为柠檬酸、乳酸、葡萄糖酸、酒石酸、羟基链羧酸、羟基链烷二酸酯中的一种。

本发明实施例提供的步骤s102中，所述丙酮为二羟基丙酮。

如图2所示，本发明实施例提供的步骤s103中，所述聚山梨醇酯溶液的制备方法如下：

s201，以山梨醇为原料，在脱水催化剂namor的作用下，山梨醇进行脱水反应生成异山梨醇。

s202，加入苯甲酸和酯化催化剂naoh，使原位生成的异山梨醇和一元羧酸进行酯化反应，经减压蒸馏得到聚山梨醇酯产品。

本发明实施例提供的步骤s104中，所述三聚磷酸盐为三聚磷酸钠、三聚磷酸钾或三聚磷酸钙中的一种。

本发明实施例提供的步骤s104中，所述带正电的壳聚糖与带负电的三聚磷酸盐交联时，带正电的壳聚糖的pka值为6.5。

如图3所示，本发明实施例提供的步骤s105中，所述在纳米载药凝胶上装载结晶微粒的方法为：

s301，将纳米载药凝胶与结晶微粒混合，加入去离子水得到混合液。

s302，对混合液进行120℃加热，加热持续10min。

s303，加入中性盐并搅拌，得到析出物质后固化，得到装载结晶微粒的纳米球。

本发明实施例提供的所述的含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物可应用在神经系统肿瘤、消化系统肿瘤、生殖系统肿瘤、泌尿系统肿瘤、皮肤肿瘤、骨肿瘤、关节系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、血液及腺体肿瘤的治疗之中。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1：对间变性淋巴瘤激酶的抑制活性评价

在greiner96孔圆形平板中投入制备的含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物(2～8μl)，并混合并使间变性淋巴瘤激酶(1μl)和附着有生物素的肽底物(2μl)发生反应15分钟。此后，添加腺嘌呤核苷三磷酸溶液(5μl)，并在常温下进行30分钟的激酶反应。在反应液中添加溶解于乙二胺四乙酸且附着有链霉亲和素的xl665(5μl)和附着有铕(eu³⁺)的抗磷酸酪氨酸抗体(5μl)，由此终止反应，在培养1小时后，利用均相时间分辨荧光来进行分析。通过wallacenvision2013设备在615/665nm的波长范围内进行解读。

在计算出将间变性淋巴瘤激酶活性及包含间变性淋巴瘤激酶的作为非小细胞肺癌细胞的l1196m的细胞活性降低至50％的上述化合物的ic50的结果，本发明制备的含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物的ic50值均小于1μm，具体见表1。

表1本发明对间变性淋巴瘤激酶的活性抑制效果

上述实验表明，本发明制备的含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物能够有效抑制间变性淋巴瘤激酶的活性。同时，本发明制备的含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物的ic50值均小于0.01μm，最低能够到达0.00020μm，进一步表明了对细胞活性的抑制作用。

实施例2：癌细胞增殖抑制评价

1、细胞培养

取测试肿瘤细胞，分别接种于含有10％胎牛血清的dmem培养基中，置于37℃、5％co2孵箱内培养，细胞呈单层贴壁生长，传代至对数生长期时，备用。

分别取上述对数生长期的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，至细胞变圆、细胞间隙变大时，完全培养基中和，800r/min条件下离心5min，弃去上清，必要时再用pbs重悬细胞，500r/min条件下离心5min，弃去上清，然后用含10％胎牛血清的完全培养液重悬细胞，采用自动细胞计数器计数，加入含10％胎牛血清的完全培养基调整细胞浓度为3×10⁴～5×10⁴个/ml，进行后续实验。

肿瘤细胞样品见表2。

表2肿瘤细胞样品

2、实验验证

2.1细胞接种

在96孔板中，每孔加入细胞浓度为3×10⁴～5×10⁴个/ml的细胞悬液100μl，即每孔含细胞3000～5000个，接种时注意使细胞均匀分布在各孔中。为防止液体蒸发，96孔板周围一圈孔不接种细胞，加入pbs保湿。

2.2细胞给药

将制备的含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物制备成10mm的母液，分别用细胞培养基稀释至比规定浓度高2倍的工作用溶液，待细胞贴壁长出形态后，每孔给药100μl，每个浓度3个重复孔(n＝3)，继续培养72h后使用cck8法检测细胞活力。

根据分子量折算，细胞给药浓度如表3所示。

表3细胞给药浓度

2.3检测方法

分别于药物处理细胞72h后，取出96孔板，弃去药液和培养基，每孔中加入新鲜培养基100μl和cck-8溶液10μl，空白孔加等体积cck8溶液，在细胞培养箱内继续孵育1.5小时后，在全自动酶标仪上450nm处测定每孔吸光度值(a)。不同药物浓度对肿瘤细胞的生长抑制作用按下式计算：

采用spss17.0软件以抑制率为响应频率，药物浓度为因变量，并将浓度做logit转换，观测值汇总为总数100，作probit回归分析，计算ic50值。

含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物对肿瘤细胞增殖的影响如图4-5和表4所示。

表4含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物对肿瘤细胞增殖的影响

从结果可以看出，含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物具有比较广谱的抗肿瘤细胞增殖的作用，实验中所涉及的13种常见的肿瘤细胞株，均可以得出肿瘤抑制浓度值。说明含嘧啶-2,4-二胺衍生物的抗癌用药物对常见肿瘤均有强度不同的抑制作用，特别是对淋巴瘤、神经母细胞癌、肺癌、白血病、甲状腺瘤等作用更加突出。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

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