知母皂苷酶解产物及其主要组分知母皂苷AⅢ的医药用途的制作方法
本发明属于医药及中药技术领域,涉及知母皂苷(中药有效成分)酶解产物及其主要组分知母皂苷aⅲ的一种医药用途,特别涉及知母皂苷的酶解产物及其主要组分知母皂苷aⅲ在制备防治非酒精性脂肪肝病的药物中的应用。
背景技术:
知母为百合科植物知母(anemarrhenaasphodeloidesbge.)的干燥根茎,味苦,性寒,归肺、胃、肾经,具有清热泻火、滋阴润燥、止渴除烦等功效。知母皂苷是知母药材中的主要化学成分,其中以知母皂苷bⅱ(timosaponinbⅱ,tbⅱ)含量较高。《中国药典》一部(2015版)规定知母药材中含tbⅱ不少于3.0%,研究发现,部分知母药材中tbⅱ含量高达10%以上,而知母皂苷aⅲ(timosaponinaⅲ,taⅲ)在知母药材中含量非常低,仅为知母皂苷bⅱ的1/20。因此很难从知母药材中直接分离制备taⅲ。tbⅱ体内药物代谢研究表明tbⅱ可经过肠道菌群作用下转化成taⅲ和知母皂苷元(sarsasapogenin,sar),其中taⅲ为主要代谢物。目前文献主要报道了taⅲ具有抗血小板聚集、改善学习能力和记忆力、降血糖和抗肿瘤等作用,对肝癌、乳腺癌、宫颈癌等肿瘤细胞的增殖具有抑制作用,如授权发明专利zl201610637699.1提供了一种用于抑制肝癌、黑色素瘤和乳腺癌等多种恶性肿瘤的taⅲ脂质体。
非酒精性脂肪肝(non-alcoholicfattyliverdisease,nafld)已成为世界范围内日益严重的公共卫生问题,目前nafld全球发病率已达到25.3%,我国患病率在15%~30%,并且患病状况呈现逐年增加及年轻化趋势。nafld包含一系列肝脏病变,可由简单的脂肪变性到非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis,nash),甚至到肝硬化、肝癌,最后可能导致肝脏相关疾病的死亡。同时nafld参与肥胖、2型糖尿病(type2diabetesmellitus,t2dm)、动脉粥样硬化、代谢综合征等疾病的发展,严重危害人体健康,有损人们正常的生活状态和工作质量,任由其发展最终将给患者造成巨大经济负担。
肥胖是nafld的主要危险因素,nafld患者几乎普遍表现为肝脏胰岛素抵抗,大大增加了发展为t2dm的概率,并促进其持续发展。鉴于nafld和t2dm具有部分相同的病理生理特征,因此,t2dm的治疗方法也应用在nafld的治疗,采用减轻体重和增加体育活动,可改善脂肪肝和nash症状。治疗t2dm的临床药物对nafld未能取得良好疗效,吡格列酮不能很好地改善t2dm早期患者的nash;二甲双胍减少nafld肝细胞甘油三酯的积累,但并不能改善肝纤维化组织学病变情况。研究表明,虽然通过减肥可治疗nafld的肝脏脂肪变性及其疾病的发展,但是还没有确定的专门针对nafld疾病恶化的理想治疗药物。因此,研制防治nafld的药物能在较短时间内产生较显著的社会效益和经济效益。尽管近年来对taⅲ对癌症的治疗作用报道较多,但是未见taⅲ用于防治nafld方面的应用。
技术实现要素:
本发明的目的在于提供一种知母皂苷的酶解产物及其主要组分知母皂苷aⅲ(taⅲ)的新医药用途,具体为知母皂苷的酶解产物及其主要组分知母皂苷aⅲ(taⅲ)在制备防治非酒精性脂肪肝病的药物中的应用。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
知母皂苷酶解产物在制备防治非酒精性脂肪肝病的药物中的应用,所述非酒精性脂肪肝病为伴有肝脏脂肪积累及损伤的非酒精性脂肪肝病,知母皂苷酶解产物及其主要组分知母皂苷aⅲ至少具有以下一种功效:1)降低肝脏组织脂质合成;2)增加肝脏组织肝细胞中脂肪酸氧化;3)增加肝脏组织肝细胞中线粒体功能。其中的防治非酒精性脂肪肝病的药物不仅可作为药物,还可作为肝脏组织脂质合成的抑制剂或肝脏组织肝细胞中脂肪酸氧化的促进剂。
作为优选的技术方案:
如上所述的应用,所述知母皂苷酶解产物是通过木聚糖酶、纤维素酶复合酶或β-葡萄糖苷酶酶解知母提取物获得的。
如上所述的应用,在酶解知母提取物后分离纯化后即得知母皂苷酶解产物。
如上所述的应用,所述知母皂苷酶解产物中知母皂苷aⅲ的含量为60~98wt%。
本发明还提供知母皂苷aⅲ在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用。
如上所述的应用,所述防治非酒精性脂肪肝病的药物的形式包括:口服的片剂、颗粒剂、胶囊、混悬剂;注射给药的注射剂、粉针剂、脂质体、微乳等临床常用剂型。本发明的防治非酒精性脂肪肝病的药物可与药学上可以接受的任意载体(固体、半固体或液体)配合,制成药学上可以接受的任意剂型(片剂、注射剂、胶囊、口服液)。本发明的保护范围并不仅限于此,此处仅列举部分可行的技术方案,其可采用本领域公知的常规生产方法制成各种剂型,采取口服或注射(包括静脉注射、静脉滴注、腹腔注射、肌肉注射等中的一种或多种)进行nafld及其相关疾病的预防、保护、治疗或科学研究。
本发明同时提供一种防治非酒精性脂肪肝病的药物,所述药物含有有效量的有效组分,所述有效组分包括知母皂苷酶解产物和知母皂苷aⅲ中的至少一种。
有益效果:
本发明提供了知母皂苷酶解产物及其主要组分知母皂苷aⅲ的新用途,具体为其在制备防治非酒精性脂肪肝病的药物中的应用,本发明研究发现,采用知母皂苷酶解产物或其主要组分知母皂苷aⅲ干预高脂饮食饲喂的小鼠后,非酒精性脂肪肝小鼠体重和肝脏组织重量减少,肝脏组织形态改善及脂滴含量降低,降低脂质合成基因水平,增加脂肪酸氧化及线粒体功能基因水平。而在未干预前,小鼠体重和肝脏重量增加,肝脏组织和血清甘油三酯含量增加,病理切片显示脂滴增多,肝脏组织脂质合成基因表达增加,脂肪酸氧化及线粒体功能基因表达降低。即说明了知母皂苷酶解产物或其主要组分知母皂苷aⅲ能够有效治疗nafld,同时其效果良好,在nafld治疗领域具有较为广阔的应用前景。
附图说明
图1为知母皂苷酶解产物及知母皂苷aⅲ对小鼠体重影响的示意图;
图2为知母皂苷酶解产物及知母皂苷aⅲ对小鼠肝脏重量影响的示意图;
图3为知母皂苷酶解产物及知母皂苷aⅲ对小鼠肝脏组织h&e染色结果示意图;
图4为知母皂苷酶解产物及知母皂苷aⅲ对小鼠肝脏组织油红o染色结果示意图;
图5为知母皂苷酶解产物及知母皂苷aⅲ对小鼠肝脏组织中甘油三酯含量影响的示意图;
图6为知母皂苷酶解产物及知母皂苷aⅲ对小鼠血清中甘油三酯含量影响的示意图;
图7、8和9分别为知母皂苷酶解产物及知母皂苷aⅲ对小鼠肝脏组织脂质合成、脂肪酸氧化和线粒体功能基因水平影响的示意图。
具体实施方式
下面结合附图,对本发明的具体实施方式做进一步阐述。
实施例1
一种知母皂苷酶解产物(主要组分为知母皂苷aⅲ)的制备方法,其具体步骤如下:
(1)知母乙醇提取物的制备:
知母20kg,加入6倍量50%乙醇,加热回流提取2次,每次2小时,过滤,合并两次药液,减压旋转蒸发,回收乙醇,减压浓缩至约10l,得知母皂苷提取物,称重。
(2)知母皂苷酶解转化物的制备:
木聚糖酶和纤维素酶酶解:取上述知母皂苷提取物,加入至400l醋酸-醋酸钠缓冲液(ph=4.5)中,加入9.6kg木聚糖酶和纤维素酶复合酶,55摄氏度控温搅拌反应3小时。
搅拌除杂:加入35l10%氢氧化钠溶液,搅拌3小时混匀,静置,弃去上清液,取沉淀。在沉淀中加入640l95%乙醇搅拌1小时溶解。静置,弃去沉淀。
回收乙醇:取上清液回收乙醇至无醇味,于60℃减压干燥,即得知母皂苷酶解转化物。经hplc测定提取液酶解前后知母皂苷bⅱ和知母皂苷aⅲ的含量,计算发现,知母皂苷在木聚糖酶和纤维素酶复合酶(2:1)中酶解转化率最高,为77.3±1.7%。知母皂苷酶解转化物中aⅲ的含量为60%。
β-葡萄糖苷酶酶解:称取4g知母乙醇提取物,β-葡萄糖苷酶4g,置于具塞锥形瓶中,加入200ml醋酸-醋酸钠缓冲液(ph=4.5),置于气浴恒温振荡器中于50℃下振摇2h,用等体积的水饱和正丁醇萃取提取物3次,氨试液洗涤3次,合并正丁醇萃取液,减压旋转蒸发,回收正丁醇,置真空干燥箱中,于60℃减压干燥,获得知母皂苷酶解物。经hplc测定提取液酶解前后知母皂苷bⅱ和知母皂苷aⅲ的含量,计算发现,知母皂苷在β-葡萄糖苷酶中酶解转化率最高,为81.5%±1.9%。知母皂苷酶解转化物中aⅲ的含量为63.2%。
(3)ab-8大孔树脂分离纯化知母皂苷aⅲ
取酶解后的样品0.9g,加100ml95%乙醇溶解,拌入50g(抽滤去水分后的重量)处理好的ab-8大孔树脂,减压回收乙醇,加样于处理好的ab-8大孔树脂柱,柱床体积200ml,依次以4bv水、20%乙醇、50%乙醇、80%乙醇洗脱,流速2ml/min,收集80%乙醇洗脱液,回收乙醇,干燥。精密称定10mg,置25ml容量瓶中,甲醇定容,超声30min,0.45μm微孔滤膜过滤,进行含量测定,计算taⅲ的得率。经过ab-8大孔树脂纯化后,可得到纯度在70%以上的taⅲ样品,得率在70%以上。
(4)半制备液相分离制备知母皂苷aⅲ
称取0.5g经大孔树脂纯化后的taⅲ样品,与1.5g硅胶混匀,将混合物装入固体样品加载器。检测器:蒸发光散射检测器;色谱柱:c18玻璃柱(30×2.1cm,50g);流动相:水-甲醇(a/b,v/v),梯度洗脱0–15min,70%–77%b;15–20min,77%–80%b;20–35min,80%b;35–75min,85%b。流速:20ml/min。根据色谱图接收流分。得到的taⅲ样品含量为91.2±0.6%,回收率为56.4±5.5%。
(5)知母皂苷aⅲ重结晶
称取适量taⅲ制备样品(100mg),逐步滴加95%乙醇,80℃水浴,至其完全溶解,继续滴加适量乙醚至有晶体析出,室温静置,析出大量晶体,滤过后进行干燥,得白色结晶性粉末。taⅲ制备样品经重结晶技术,其纯度可以达到98.4±0.55%,得率为60.6±5.85%。
实施例2
知母皂苷酶解产物及其主要成分知母皂苷aⅲ治疗小鼠非酒精性脂肪肝的作用:
一、试剂和材料
c57bl/6j小鼠,6-7周龄,雄性,spf级,购于上海斯莱克实验动物有限中心,许可证号为scxk(沪)2017-0005,饲养于上海中医药大学动物实验中心,使用许可证号为scxk(沪)2014-0008。
知母皂苷aⅲ(timosaponinaⅲ,taⅲ):自制,批号:20190925,纯度≥98%(hplc);知母皂苷酶解产物:自制,批号:20190922,纯度为63.2%(hplc)。
小鼠饲料为正常维持饲料和高脂饲料,均购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司,其中高脂饲料含60%脂肪,20%蛋白质,20%碳水化合物。
二、实验方法
c57bl/6j小鼠购买后于上海中医药大学动物实验中心适应性饲养一周,按体重随机分组,组别:对照饮食组(cd,对应附图中controldiet),高脂饮食组(hfd),知母皂苷aⅲ低剂量组(taⅲ-l,2mg/kg),知母皂苷aⅲ中剂量组(taⅲ-m,5mg/kg),知母皂苷aⅲ高剂量组(taⅲ-h,10mg/kg),知母皂苷酶解产物(e-taⅲ,15.8mg/kg,相当于taⅲ10mg/kg)(以上各组标号与附图中组别编号一一对应)。每组8只,对照组给予正常维持饲料,高脂饮食组给予高脂饲料,知母皂苷aⅲ组小鼠在高脂饮食12周后,高脂饮食同时灌胃给予相应剂量的知母皂苷aⅲ6周。
药物配制:0.5%cmc-na溶解,按小鼠体重0.1ml/10g剂量灌胃。
喂养结束,小鼠经麻醉后取血,4℃放置过夜后,3000rpm离心15min,取上清,即血清,-20℃储存用于生化检测。脱颈椎处死小鼠,取肝脏组织,进行称重并记录,部分组织4%多聚甲醛浸泡用于组织切片,部分组织提取rna用于检测基因表达,其余组织-80℃保存备用。
三、检测指标
1、体重测定
每周测定一次小鼠体重
2、组织切片
按常规方法对小鼠肝脏组织进行h&e和油红o染色。
4%多聚甲醛中的脂肪组织经脱水、透明后,进行石蜡包埋、切片。切片经脱蜡复水,置于苏木精中染色20min,自来水洗去多余苏木精,1%的盐酸酒精(1ml浓盐酸加入99ml75%的乙醇中)分色2sec,流动的小流自来水冲洗10min。将切片置于伊红中染色30sec,流动的小流自来水冲洗10min。将切片进行脱水、透明和封片。
油红o染色时采用蔗糖脱水。切片放入37℃温育的油红o工作液,染色10min(避光),自来水冲洗3min,60%异丙醇脱色2sec,自来水冲洗2min。苏木精染色液染色5min,自来水冲洗3min,蓝化,蒸馏水洗10sec后封片。
3、肝脏组织和血清甘油三酯含量检测
按常规方法检测小鼠肝脏组织和血清中甘油三酯(tg)含量。
肝脏组织tg抽提:组织放入1.5ml离心管,每管加入5%np40(ddh2o配制,组织重量mg:np40体积μl=1:20),加入经水、无水乙醇和5%np40清洗的磁珠。放入组织裂解仪中,调整频率为60hz,匀浆45~60sec,研磨均匀,若有大的组织块,则应全部样本重新匀浆。匀浆后的样本放入预热的金属浴中,91℃加热4min,取出待冷却至室温后,再次91℃加热4min,冷却至室温,此时出现较多的絮状沉淀。12000rpm离心2min,吸取上清液100μl至新的1.5ml离心管中,注意不要吸到液面上层的漂浮物和下层的沉淀,吸出的液体应为无色透明液体。
组织和血清tg的测定:取组织抽提液或血清2μl,蒸馏水为空白,标准品为标准孔,加入200μl工作液,37℃孵育10min,于510nm波长处检测tg吸光度。按公式计算,血清tg含量(mmol/l)=(样本od值-空白od值)/(标椎od值-空白od值)ⅹ标准品浓度(2.26mmol/l)。组织tg含量(mmol/gprotein)=测得的组织抽提液的tg含量(mmol/l)/组织抽提液的蛋白量(g/l)。
4、脂肪组织pcr检测
用trizol提取小鼠肝脏组织的总rna,经反转录为cdna,通过realtimepcr方法检测肝脏组织脂质合成、脂肪酸氧化和线粒体功能基因在mrna水平的表达。
5、统计分析
用graphpad作图和统计,所有结果数据以mean±sem,采用单因素方差分析one-wayanova检验方差齐性,并用student's-test进行分析,p<0.05表示具有显著性差异。
四、实验结果
1、知母皂苷酶解产物及其主要组分知母皂苷aⅲ对小鼠体重和肝脏重量的影响(如图1和图2所示)
小鼠高脂饲养至12周,高脂饮食组(模型组)体重相比于对照饮食组体重显著增加了26.85%,提示模型造模成功;此时开始灌胃给予知母皂苷aⅲ6周,与高脂饮食组相比,知母皂苷aⅲ低、中、高剂量各组体重分别降低了2.07%,11.90%(p<0.05),21.43%(p<0.05),知母皂苷酶解转化物给药组体重降低了16.21%(p<0.05),表明知母皂苷酶解转化物及其主要组分知母皂苷aⅲ可以显著降低高脂饮食小鼠的体重。同时发现,知母皂苷酶解转化物及其主要组分知母皂苷aⅲ高剂量组肝脏组织重量相比于高脂饮食组分别降低了20.31%(p<0.05)和22.03%(p<0.05)。
2、知母皂苷酶解产物及其主要组分知母皂苷aⅲ影响小鼠肝脏组织h&e染色结果(如图3所示)
由图3可以看出,高脂饮食小鼠肝脏组织显示不规则的肝细胞排列和空泡积累,肝细胞脂肪病变较为明显,给予知母皂苷酶解转化物及其主要组分知母皂苷aⅲ高剂量作用下,肝细胞脂肪变性明显得到减少。
3、知母皂苷酶解产物及其主要组分知母皂苷aⅲ影响小鼠肝脏组织油红o染色结果(如图4所示)
由图4可以看出,高脂饮食小鼠肝脏组织明显显示出红色脂滴积累,给予知母皂苷酶解转化物及其主要组分知母皂苷aⅲ后肝细胞红色脂滴面积减少,表明经过知母皂苷酶解转化物及其主要组分知母皂苷aⅲ治疗后,肝脏脂肪变性得到明显改善。
4、知母皂苷酶解产物及其主要组分知母皂苷aⅲ对肝脏组织和血清中甘油三酯含量的影响(如图5和图6所示)
由图5和6可以看出,相比于对照组小鼠肝脏tg含量(0.19±0.005mmol/gprotein),高脂饮食小鼠肝脏tg含量显著增加至0.25±0.003mmol/gprotein(p<0.001),给予知母皂苷aⅲ后,肝脏组织tg含量呈降低趋势,其中高剂量组显著降低tg含量至0.22±0.008mmol/gprotein(p<0.05),知母皂苷酶解产物组降低肝脏tg含量至0.23±0.007mmol/gprotein(p<0.05)。对照组小鼠血清tg含量为1.14±0.14mmol/l,高脂饮食小鼠血清tg含量显著增加至1.80±0.04mmol/l(p<0.01),给予知母皂苷aⅲ后,血清tg含量呈降低趋势,其中中剂量组和高剂量组显著降低tg含量至1.18±0.21mmol/l(p<0.05)和0.77±0.26mmol/l(p<0.01),知母皂苷酶解产物组降低肝脏血清tg含量至0.98±0.12mmol/l(p<0.001)。表明知母皂苷酶解产物及其主要成分知母皂苷aⅲ可降低肝脏组织和血清甘油三酯含量。
5、知母皂苷酶解产物及其主要组分知母皂苷aⅲ对肝脏组织脂质代谢基因水平的影响(如图7、图8和图9所示)
非酒精性脂肪肝病的发生发展与肝脏中脂质积累和消除的动态失衡有关,检测肝脏组织中脂质合成、脂肪酸氧化与线粒体功能的基因水平(引物序列见表1)。由图7、8和9可以看出,高脂饮食小鼠,肝脏组织脂质合成基因表达增加,脂肪酸氧化基因水平部分出现代偿适应,表达增加,cpt1α表达降低,线粒体功能基因表达降低,给予知母皂苷酶解产物及其主要组分知母皂苷aⅲ高剂量后,显著降低脂质合成的基因表达,增加脂肪酸氧化及线粒体功能的基因表达。说明知母皂苷酶解产物及其主要组分知母皂苷aⅲ可以降低脂质形成,增强脂肪酸氧化与线粒体功能,改善非酒精性脂肪肝病的脂质沉积。
表1相关基因的引物序列
实施例3
一种知母皂苷酶解产物或知母皂苷aⅲ的制剂的制备:
(1)知母皂苷酶解产物健康茶的制备:
取知母皂苷酶解产物粉末与绿茶、红茶或普洱茶提取物或原茶按照质量比1:10进行混合,直接按照0.4g/包和0.8g/包包装,为知母皂苷酶解产物降肝茶,该产品可溶于200毫升热水中,每天服用1-2包。
(2)知母皂苷酶解产物颗粒的制备:
取知母皂苷酶解产物粉末适量,加适量糊精和蔗糖可溶性淀粉(提取物:糊精:可溶性淀粉=1:40:60),用乙醇制软材,16目筛制颗粒,60℃以下干燥,得知母皂苷酶解产物颗粒,8g/包包装,每天服用1包。
(3)知母皂苷aⅲ咀嚼片的制备:
称取知母皂苷aⅲ15g,分别加入微晶纤维素85g、甘露醇40g,搅拌均匀,放入干燥箱内120℃烘干,研磨,细粉过100目筛,加入单晶冰糖细粉30g,搅拌均匀,过筛,在制好的颗粒中加入千分之一的硬脂酸镁,压片,0.8g/片,得到知母皂苷aⅲ咀嚼片。
(4)知母皂苷aⅲ泡腾片的制备:
知母皂苷aⅲ50g、淀粉150g,碳酸氢钠150g,柠檬酸150g,甜蜜素9g,混合后用无水乙醇制粒,干燥后压制成片,0.8g/片,即得知母皂苷aⅲ泡腾片。
(5)知母皂苷酶解产物胶囊的制备:
称取知母皂苷酶解产物粉末适量,与淀粉按照1:10混匀,装入1号空心胶囊,即得胶囊剂,装量为0.4克。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式,但是本领域的技术人员应该理解,这些仅是举例说明,在不违背本发明的原理和实质的前提下,可以对这些实施方式做出多种变更或修改。
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