一种新型纳米银抗菌材料及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种新型纳米银抗菌材料制备方法和应用。

背景技术：

细菌的多药耐药性(mdr)对人类健康构成了越来越严重的威胁，这导致使用传统抗生素的主要治疗方式失去效力。最危险的病原体的一个典型例子是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(mrsa)，这种细菌对大多数传统抗生素不敏感，严重威胁公众健康。开发新的抗生素是解决这种严重状况的最有效策略。然而不幸的是，新抗生素的开发步伐远远落后于细菌耐药性的发展。目前，由于费时费力且成本高昂，新抗生素的发现已大大减少，甚至基本上处于停滞状态。因此，研发对耐药菌具有高效率的非抗生素药物具有重要意义。

迄今为止，已经探索了许多无机纳米颗粒(nps)作为抗菌剂，例如金纳米(aunps)、银纳米(agnps)和铜纳米(cunps)等。其中，agnps引起了人们极大的关注，并且目前已经普遍用于医学领域。许多研究表明，agnps通过多种杀伤机制发挥广谱抗菌特性，包括穿透细菌细胞膜，破坏dna以及通过大量产生活性氧(ros)破坏细胞代谢，这与抗生素不同，引起细菌耐药性的可能性较小。此类特性使agnps成为对抗多药耐药细菌的极有希望的抗生素替代品。然而，由于高的比表面积和反应性，导致裸露的agnps容易聚集和氧化，这一趋势会严重损害其抗菌能力，进而导致需要大量的agnps才能完全根除耐多药细菌，而在高剂量的agnps下很容易引起细胞和组织毒性。为了克服这些缺点，已经尝试了对agnps进行不同修饰，包括将它们锚定在基质的表面上，并用涂层包裹它们，以改善其抗菌活性。

值得注意的是，由于碳纳米材料的可再生性和低成本以及其物理抗菌性能，碳纳米材料最常用于构建基于ag的纳米杂化物，以提高agnps的分散性和抗菌活性。许多研究表明，在石墨烯片、氧化石墨烯(go)、还原型氧化石墨烯(rgo)和碳纳米管(cnts)上负载载agnps均可以实现协同抗菌作用。不幸的是，由于增强的氧化应激和物理损伤，这些被认为是致癌物质的碳纳米材料会导致哺乳动物细胞凋亡。而且，在这些碳基质表面上生长的agnps主要降低了agnps的聚集趋势；然而，在提高agnps的抗氧化能力方面仍然不能令人满意。因此，迫切需要开发一种具有高效抗菌性能且具有良好的生物相容性的纳米银复合材料。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种新型纳米银抗菌材料制备方法和应用，该方法操作简单、绿色环保且易于大规模化生产，制得的新型纳米银抗菌材料产率高、分散性优良、生物相容性高，用作抗菌剂可被细菌摄取并且释放出银离子，高效抑制和杀死耐药性细菌。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种新型纳米银抗菌材料的制备方法，包括以下步骤：

将银源、表面活性剂和石墨烯量子点加入到去离子水中混合均匀，然后加入还原剂，搅拌进行反应，反应完成后得到新型纳米银抗菌材料。

上述的制备方法，优选的，所述表面活性剂为柠檬酸三钠、聚乙烯吡咯烷酮、十二烷基硫酸钠、壳聚糖中的至少一种。

上述的制备方法，优选的，所述还原剂为硼氢化钠、多酚、葡萄糖中的至少一种。

上述的制备方法，优选的，所述银源为硝酸银和/或银氨。

上述的制备方法，优选的，所述银源、表面活性剂和石墨烯量子点的质量比为1:(1～10):(12～20)。更优选的，所述银源、表面活性剂和石墨烯量子点的质量比为1:(1～3):(12～15)。

上述的制备方法，优选的，所述还原剂与银源的质量比为(0.01～0.1)：6。更优选的，所述还原剂与银源的质量比为(0.01～0.02)：6。

上述的制备方法，优选的，搅拌反应0.5～1h。

上述的制备方法，优选的，所述石墨烯量子点为天然高分子聚合物水热反应得到或由石墨烯裂解得到，尺寸为5～20nm。

上述的制备方法，优选的，所述天然高分子聚合物为淀粉，具体为马铃薯淀粉、玉米淀粉、红薯淀粉、木薯淀粉中的一种或多种。

上述的制备方法，优选的，所述水热反应的温度为160～200℃，时间为2～12h。

作为一个总的发明构思，本发明还提供一种根据上述的制备方法制备得到的新型纳米银抗菌材料。

上述的新型纳米银抗菌材料，优选的，所述新型纳米银抗菌材料中，含有的石墨烯量子点/纳米银复合体相互连结，且石墨烯量子点/纳米银复合体中石墨烯量子点均匀、完整地包裹在纳米银的表面，石墨烯量子点/纳米银复合体的尺寸为20～50nm。更优选的，所述石墨烯量子点/纳米银复合体的尺寸为20～30nm。

作为一个总的发明构思，本发明还提供一种根据上述的制备方法制备得到的新型纳米银抗菌材料或者如上述的新型纳米银抗菌材料在抗菌领域的应用。本发明的新型纳米银抗菌材料具有优越的抗细菌和抗真菌能力，其中细菌包括耐药金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、布鲁克氏杆菌、痤疮丙酸杆菌等致病细菌；真菌包括红色毛癣菌、念球菌等，在抗菌领域具有较好的应用前景。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明的制备方法，采用的石墨烯量子点尺寸小于20nm，不仅具有石墨烯的共同特征，而且具有低细胞毒性和高生物相容性，是agnps生长的理想基质。通过加入银源使石墨烯量子点和纳米银原位复合，单个agnp可以被众多gqd均匀地修饰，形成的gqd层实际上起着保护涂层的作用，得到粒径较小的单个的石墨烯量子点/纳米银复合体，有效地避免了agnps的聚集和氧化，并且通过特别选择表面活性剂的种类及添加量进一步修饰了复合物的形貌，使得石墨烯量子点能够均匀、完整地包裹在纳米银的表面，且促使多个单独的石墨烯量子点/纳米银复合体相互连结形成更加稳定的复合结构，大幅提高抗菌材料的稳定性和生物利用度，从而提高了其抗菌能力。

(2)本发明的制备方法，采用天然高分子聚合物作为石墨烯量子点的合成前体，通过高温水热处理得到石墨烯量子点，与在苛刻条件下先经化学氧化处理、再经水热处理或溶剂热处理将碳前体(例如石墨烯、氧化石墨烯和碳纤维等)切割成较小的碎片来合成石墨烯量子点的传统工艺相比，操作简单，绿色环保，原料来源广泛，且无需使用硫酸、硝酸或其他强氧化剂，避免了潜在的安全风险和环境污染。

(3)本发明的新型纳米银抗菌材料产率高、分散性优良，具有较高的生物相容性和稳定性，将其用作抗菌剂，能持续缓慢地释放出小尺寸的银粒子，实现抑菌杀菌效果，对耐药细菌引起的伤口感染亦有较好治疗效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中的石墨烯量子点、纳米银及新型纳米银抗菌材料的透射电镜图；

图2为本发明实施例1中新型纳米银抗菌材料的x射线衍射图(xrd)；

图3为本发明实施例1中新型纳米银抗菌材料的紫外可见分光光谱图；

图4为本发明实施例1中的石墨烯量子点、纳米银及新型纳米银抗菌材料的处理大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)的抑菌圈图；

图5为本发明实施例1中不同浓度的石墨烯量子点、纳米银及新型纳米银抗菌材料处理大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)的od600图；

图6为本发明实施例1中新型纳米银抗菌材料处理的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)的扫描电镜图；

图7为本发明实施例1中新型纳米银抗菌材料的细胞毒性结果；

图8为本发明实施例1中新型纳米银抗菌材料处理细菌引起的外伤感染的治疗效果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本文发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：

一种新型纳米银抗菌材料的制备方法的制备方法，包括以下步骤：

将10mg硝酸银、17mg柠檬酸三钠、120mg石墨烯量子点混合加入到10ml去离子水中，在室温下搅拌30min使混合均匀，再加入240μlnabh4溶液(浓度为0.19mg/ml)，在室温下继续搅拌反应30min，即得到新型纳米银抗菌材料。其中，石墨烯量子点为马铃薯淀粉通过水热反应得到，水热反应的温度为190℃，时间为2h，石墨烯量子点的尺寸为1～10nm。该新型纳米银抗菌材料中，含有的石墨烯量子点/纳米银复合体相互连结，且石墨烯量子点/纳米银复合体中石墨烯量子点均匀、完整地包裹在纳米银的表面，石墨烯量子点/纳米银复合体的尺寸为20～50nm。

采用透射电镜、xrd、红外光谱、紫外可见分光光谱对本实施例中制备新型纳米银抗菌材料进行表征。新型纳米银抗菌材料与石墨烯量子点、普通纳米银的透射电镜图如图1所示(从左至右分别是石墨烯量子点(gqds)、纳米银(agnps)和新型纳米银抗菌材料(gqds@ag)的透射电镜图)，由图可知，石墨烯量子点为尺寸小于10nm的量子点，纳米银的尺寸为20-30nm，新型纳米银抗菌材料中单个石墨烯量子点/纳米银复合体的尺寸为20-50nm。图2和图3分别是新型纳米银抗菌材料(gqds@ag)的x射线衍射图(xrd)和紫外可见分光光谱图，表明石墨烯量子点与纳米银得到较好的复合。

实施例2：

一种新型纳米银抗菌材料的制备方法的制备方法，包括以下步骤：

将10mg硝酸银、34mg柠檬酸三钠、170mg石墨烯量子点混合加入到10ml去离子水中，在室温下搅拌30min使混合均匀，再加入200μlnabh4溶液(浓度为0.19mg/ml)，在室温下继续搅拌反应50min，即得到新型纳米银抗菌材料。其中，石墨烯量子点为马铃薯淀粉通过水热反应得到，水热反应的温度为180℃，时间为5h，石墨烯量子点的尺寸为1～10nm。该新型纳米银抗菌材料中，含有的石墨烯量子点/纳米银复合体相互连结，且石墨烯量子点/纳米银复合体中石墨烯量子点均匀、完整地包裹在纳米银的表面，石墨烯量子点/纳米银复合体的尺寸为20～50nm。

实施例3：

一种新型纳米银抗菌材料的制备方法的制备方法，包括以下步骤：

将10mg硝酸银、51mg柠檬酸三钠、140mg石墨烯量子点混合加入到10ml去离子水中，在室温下搅拌30min使混合均匀，再加入400μlnabh4溶液(浓度为0.19mg/ml)，在室温下继续搅拌反应30min，即得到新型纳米银抗菌材料。其中，石墨烯量子点为马铃薯淀粉通过水热反应得到，水热反应的温度为190℃，时间为2h，石墨烯量子点的尺寸为1～5nm。该新型纳米银抗菌材料中，含有的石墨烯量子点/纳米银复合体相互连结，且石墨烯量子点/纳米银复合体中石墨烯量子点均匀、完整地包裹在纳米银的表面，石墨烯量子点/纳米银复合体的尺寸为20～50nm。

测试本发明的新型纳米银抗菌材料的抗细菌性能：

以实施例1制得的新型纳米银抗菌材料为样品，采用平板法和溶液法考察新型纳米银抗菌材料抗三种细菌(大肠杆菌e.coli、普通金黄色普通球菌s.aureus和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mrsa)的效果，结果分别如图4和图5。由图4可知，平板法结果显示新型纳米银抗菌材料对三种细菌的抗菌效果显著强于普通纳米银和石墨烯量子点，表明新型纳米银抗菌材料的片球错杂复合结构提高了纳米银的抗菌效果；由图5可知，溶液法结果显示，新型纳米银抗菌材料对三种细菌的最低抑菌浓度得到显著降低，新型纳米银抗菌材料在10μg/ml左右即可完全杀死细菌，而同等浓度下普通纳米银和石墨烯量子点仅实现60％左右抑菌，表明新型纳米银抗菌材料具有超强的抑菌效果。

对新型纳米银抗菌材料的抗菌表现进行考察。采用扫描电镜观察新型纳米银抗菌材料处理mrsa前后细菌的形貌变化，扫描电镜图如图6所示。由图可知，处理前细菌形态规则、表面光滑，而处理后，细菌皱缩，膜出现明显破裂，说明新型纳米银抗菌材料通过促进细菌膜破裂而杀死细菌，达到抑菌效果。

对新型纳米银抗菌材料的生物安全性进行考察。采用细胞活力实验考察新型纳米银抗菌材料处理正常细胞前后生长情况，结果如图7所示。由图可知，当材料浓度达到20μg/ml(高于材料作用浓度)时，细胞仍然有90％以上存活，表明新型纳米银抗菌材料具有较好的生物安全性。

对新型纳米银抗菌材料在细菌感染伤口的治疗效果进行考察。采用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引起的外伤感染balb/c小鼠模型考察新型纳米银抗菌材料对细菌感染伤口的治疗效果，在治疗后第1、3、5、8、10天的照片如图8所示。由图可知，对于无处理组，新型纳米银抗菌材料组在5-8天就有明显治疗效果，伤口化脓现象得到显著改善，10天后伤口完全愈合，表明新型纳米银抗菌材料具有优越的抗菌促伤口愈合效果。

测试本发明的新型纳米银抗菌材料的抗真菌性能：

以实施例1制得的新型纳米银抗菌材料为样品，采用平板法和溶液法考察制备新型纳米银抗菌材料抗脚气真菌红色毛癣真菌效果，分别采用不同浓度(10～100μg/ml)的新型纳米银抗菌材料分散液(均用去离子水分散)处理红色毛癣真菌10min～1h，结果如表1所示。由表1可知，当浓度提高到60μg/ml以上时，新型纳米银抗菌材料能杀死99％以上的红色毛癣真菌。

表1新型纳米银抗菌材料抗红色毛癣真菌效果

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

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