一种改善高血压病人肠道菌群的胶囊的制作方法

本发明属于益生菌制剂领域，特别涉及一种由含有罗望子胶的肠溶胶囊壳的真空冻干益生菌胶囊及其制备技术。

背景技术：

肠道菌群是人体一大重要免疫器官，是抵御外来毒素、尤其食源性有害物质的重要屏障。肠道菌群随着人类生长发育过程逐步建立完善，婴幼儿的肠道菌群未发育健全，尤其容易受到外来致病菌的感染；抗生素滥用的现象在中国乃至世界普遍存在，2013年中国抗生素使用量高达16.2万吨，约占世界用量的一半。抗生素滥用直接破坏肠道菌群的平衡，诱导耐药菌的产生。各类益生菌制剂应运而生，大多添加在乳粉或发酵乳制品中，少数产品是冲剂或微胶囊的形态。益生菌和乳制品结合的模式固然能提高和改善益生菌服用体验，但对于乳糖不耐或乳蛋白过敏的人群则不适宜；此外，乳制品营养丰富，对于大多数细菌增殖都有促进作用，并不能选择性地提高益生菌的存活率。冲剂和微胶囊形态的益生菌制剂，益生菌效价高，但可能在胃液的酸性条件下大量失活，实际进入肠道并成功定植的益生菌数量无法预知，有必要建立某种益生菌存活率更高的益生菌制剂。此外，近年研究发现，高血压病人肠道菌群与正常人群存在差异，屏障保护能力更弱，更易发生致病菌感染引起的腹泻等症状。鉴于此，有必要建立某种能改善高血压病人肠道菌群的益生菌制剂。

胶囊是一种常见的填装载体，可以遮掩内容物的的不良气味和口感，易于吞服；此外，肠溶胶囊的囊衣能保护内容物不被胃酸破坏，使送服的内容物高效地被肠道利用。目前常见的肠溶材料包括纤维素及其衍生物、聚醋酸乙烯苯二甲酸酯和丙烯酸类树脂等，也有将褐藻胶、改性淀粉、甘露聚糖等用于肠溶胶囊制备的先例，如专利cn104922087b采用羟丙基淀粉、植物胶、双醛淀粉和增塑剂制备肠溶胶囊，制备过程中需要加入氢氧化钠调整ph。专利cn102078311b采用钙化的海藻酸钠制备肠溶胶囊。褐藻酸钙胶囊肠溶性良好，但主要原料之一海藻酸钠价格较高，增加了生产成本，对产业化和市场推广形成阻力。目前市面上已有的益生菌胶囊大多采用普通明胶胶囊为囊衣，没有开发针对益生菌特定肠溶需求的胶囊壳，如专利cn104719889a和专利cn105287649a公布的两种益生菌胶囊，而明胶胶囊存在朊病毒传染隐患，对某些宗教清真食品要求的抵触，也影响了此类益生菌胶囊的消费接受度。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对益生菌提供一种特定的肠溶胶囊制剂。本发明提供的益生菌胶囊由含有罗望子胶、海藻酸钠的胶囊壳和含有益生菌菌种的胶囊内容物制备形成。胶囊壳中添加海藻酸钠能增加肠溶性能，旨在提高益生菌肠道定植，将膳食纤维摄入与益生菌摄入合二为一，更高效地改善肠道菌群紊乱的症状。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种真空冻干益生菌胶囊，胶囊壳以罗望子胶和海藻酸钠为主材，胶囊壳中添加eudragit(l30d-55)。

在本发明提供的胶囊壳中，(1)罗望子胶质量百分比3～20％；(2)海藻酸钠质量百分比3～15％；(3)eudragit(l30d-55)质量百分比0.5～10％。优选地，罗望子胶质量百分比10～20％，海藻酸钠质量百分比8～12％，eudragit(l30d-55)质量百分比2～8％作为胶囊制备辅材，胶囊壳还含有聚乙二醇6000质量百分比0.5～2％，促凝剂质量百分比1～3％，凝胶剂质量百分比1～10％，色素质量百分比1～3％。

其中，促凝剂包括氯化钾、氯化钙、柠檬酸钾、山梨酸钾、醋酸钾、碳酸钾、磷酸三钾、碳酸氢钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钙、磷酸氢钙、乳酸钙、焦亚磷酸钾、酒石酸氢钾、硫酸铝钾、磷酸氢二钾、柠檬酸钙、葡萄糖酸钙、生物碳酸钙、乙酸钙、丙酸钙、氯化镁中的一种或多种。

其中，凝胶剂包括甘油、黄原胶、卡拉胶、角叉胶、果胶、β-环状糊精、瓜尔胶、琼脂、羟甲基纤维素、羟甲基丙基纤维素、田菁胶、结冷胶、亚麻籽胶中的一种或多种。

其中，食用色素包括焦糖色、栀子黄、姜黄色素、叶绿素铜钠盐、辣椒橙、辣椒红、葡萄皮红、胭脂红及其铝色淀、日落黄及其铝色淀、亮蓝及其铝色淀、靛蓝及其铝色淀、甜菜红、天然苋菜红、栀子蓝、植物炭黑、氧化铁黑、氧化铁红、黑豆红、喹啉黄、番茄红素、红曲红、黄氧化铁、可可壳色、红花黄、红曲黄色素等的一种或几种。

在本发明提供的益生菌胶囊中，益生菌采用真空冻干干燥的益生菌菌粉。益生菌选自动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌乳亚种、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌中的一种或多种。

在本发明中，益生菌真空冻干过程中使用冻干保护剂，冻干保护剂由冻干保护剂a液和b液组成，a液为蔗糖、葡聚糖、海藻糖、脱脂乳粉、菊粉、谷氨酸钠、氯化钠配制成的无菌溶液，b液为l-半胱氨酸、氯化钠配制成的无菌溶液。其中，a液中各组分采用如下质量份数：蔗糖的质量百分比为10～20％，葡聚糖的质量百分比为4～14％，海藻糖的质量百分比为2～6％，脱脂乳粉的质量百分比为10～30％，菊粉的质量百分比为4～36％，谷氨酸钠的质量百分比为8～14％，b液中l-半胱氨酸的质量百分比为0.1～0.3％。其中，菊粉的质量百分比优选为10～30％实验中发现，冻干保护剂中菊粉的质量百分比在10～30范围内，益生菌复苏后存活率随菊粉含量上升而显著增加，在25％时达到最大，此后继续增加菊粉含量益生菌存活率无显著增加。而考虑到成本效益，实际中可以25％为最终生产用量。

本发明提供胶囊壳的制备方法，具体为：

1)溶胶：取罗望子胶3～20份，海藻酸钠3～15份，eudragit(l30d-55)0～10份，聚乙二醇60000.5～2份，加入100～200份纯水，升温到70～90℃，不断搅拌使之充分吸水膨胀溶解，随后在55～75℃下静置2～4个小时，使胶液澄清。

2)加热：将澄清胶液加热至80～98℃，添加促凝剂和凝胶剂，溶解搅拌2小时，使各组分充分混合达到均一。

3)蘸胶制胚：胶液温度降低至72℃，稳定除去气泡后，将模杆上端向下浸入胶液中，待胶液全部浸没模杆约6～8秒，即慢慢将模杆提起离开胶液面，再将模杆翻起，翻转数次。

4)干燥：在惰性气氛中干燥，温度20～30℃，湿度40～55％。

5)拔壳切割。

本发明提供益生菌冻干粉的制备方法：

1)菌种活化：将益生菌种接种于适宜培养基内，适宜条件下培养，按3～5％接种量传代，活化直至第三代；

2)菌体收集：第三代益生菌培养至对数期时，离心收集菌体；

3)冻干保护剂重悬：用无菌生理盐水清洗菌体，离心弃去上清，随后用冻干保护剂将菌体配制成5～10×10¹⁰cfu/ml菌悬液；

4)冷冻干燥：将3)所述菌悬液分装于冻干管内进行冻干，得益生菌冻干粉。

作为制备益生菌冻干粉的优选方法，冻干管内装样高度不超过0.5cm，冻干前放入-40℃冰箱预冻24h，真空度设置为10.0～22.0pa，冻干时间24～64小时。

本发明提供益生菌胶囊的制备方法：

1)本发明提供的胶囊壳干燥后拔壳，切割成胶囊帽和胶囊体；

2)常规填充本发明提供的益生菌冻干粉；

3)套合胶囊，整理，制备成益生菌胶囊。

本发明以罗望子胶、海藻酸钠作为胶囊壳主材制备成益生菌胶囊产品。本发明提供的产品中的罗望子胶是非消化性膳食纤维，因不被人体代谢而能刺激双歧杆菌等益生菌增殖，提高益生菌活力和肠道定植率。同时，本发明罗望子胶和海藻酸钠价格较低，降低了胶囊的生产成本。胶囊壳中添加eudragit(l30d-55)赋予肠溶性能，从而保证胶囊内容物特定释放于肠道，更利于益生菌制剂高效定植。本发明提供的产品中，益生菌采用真空冻干技术，在使用的冻干保护剂中添加了l-半胱氨酸、谷氨酸钠和菊粉，前两种氨基酸有利于提高益生菌抗逆性，而菊粉可促进益生菌增殖，有利于益生菌胶囊更好地发挥平衡和改善肠道菌群的功效。

本发明是益生菌和膳食纤维复配模式的一种有益尝试，服用快捷方便，在摄入益生菌(胶囊内容物成分)的同时摄入膳食纤维(胶囊壳和冻干保护剂成分)，一举两得，适合长期高蛋白高能量饮食模式、肠道菌群紊乱、便秘、抵抗力低下的现代人群，更适合于高血压人群。

具体实施方式

以下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。

实施例1：罗望子胶益生菌胶囊肠溶胶囊壳的制备及崩解性能

1)溶胶：取罗望子胶16份，海藻酸钠10份，eudragit(l30d-55)2份，聚乙二醇60000.5份，加入250份水，升温到70～90℃，不断搅拌使之充分吸水膨胀溶解，随后在55～75℃下静置2～4个小时，使胶液澄清。

2)加热：将澄清胶液加热至80～98℃，添加5份醋酸钾、5份氯化钙、1份甘油，溶解搅拌2小时，使各组分充分混合达到均一。

3)蘸胶制胚：胶液温度降低至72℃，稳定除去气泡后，采用标准1#胶囊摸，将模杆上端向下浸入胶液中，待胶液全部浸没模杆约6～8秒，即慢慢将模杆提起离开胶液面，再将模杆翻起，翻转数次。

4)干燥：在惰性气氛中干燥，温度30℃，湿度50％。

5)拔壳、切割。

得到空心罗望子胶肠溶胶囊壳。

取上述空心胶囊6粒，装满滑石粉，按中国药典2015版第二部附录中相关规定检测其在人工胃液和人工肠液中崩解时间，结果如下表所示：

所述空心胶囊在人工胃液中2小时内无一崩解，在人工肠液中均在20分钟内崩解，符合国家药典标准。

实施例2：罗望子胶益生菌胶囊内容物冻干益生菌粉的制备及存活率

1)菌种活化：以嗜酸乳杆菌和双歧杆菌为例：

乳杆菌：将嗜酸乳杆菌菌种接种于灭菌的mrs液体培养基，37℃培养48h后，按体积比5.0％的比例接种于新的灭菌mrs液体培养基中，相同条件下培养48h得到二级菌种，同等比例和培养条件再进行一次传代，得到用于生产的三级活化菌液；

双歧杆菌：将动物双歧杆菌菌种接种于灭菌的bbl液体培养基，37℃厌氧培养48h后，按体积比5.0％的比例接种于新的灭菌bbl液体培养基中，相同条件下培养48h得到二级菌种，同等比例和培养条件再进行一次传代，得到用于生产的三级活化菌液；

2)菌体收集：将三级活化菌液，5000r/min离心15min，弃去上清，得到菌体；

3)冻干保护剂制备：质量份数0.85％的氯化钠用纯水溶解，121℃灭菌15min，冷却后得到无菌生理盐水，随后以所述无菌生理盐水为溶解介质，按下表配制各组a液及b液后等体积混合，得到冻干保护剂i、冻干保护剂ii、冻干保护剂iii；

4)冻干保护剂重悬：用无菌生理盐水清洗菌体，离心弃去上清，随后用冻干保护剂将菌体配制成5～10×10¹⁰cfu/ml菌悬液，分装于冻干管内，冻干前放入-40℃冰箱预冻24h后，于10.0～15.0pa真空度下冻干48小时得嗜酸乳杆菌冻干粉和动物双歧杆菌冻干粉。

对采用冻干保护剂i、冻干保护剂ii、冻干保护剂iii的益生菌菌粉分别进行菌种活性鉴定，即用无菌生理盐水分别复溶，适宜条件下分别对嗜酸乳杆菌冻干粉进行mrs固体培养、对动物双歧杆菌冻干粉进行bbl固体培养，测定菌粉活性和菌体存活率如下：

遂采用冻干保护剂iii所制备冻干益生菌粉装填入实施例1所述胶囊壳得到一种罗望子胶益生菌胶囊。

实施例3：罗望子胶益生菌胶囊对高血压犬肠道菌群改善作用

雄性比格犬26只，体重9.5～11.0kg，普通级，单笼饲养，笼具每日清洗。实动物定量喂食，自由饮水。温度16-26℃，日温差≤4℃，相对湿度40-70％，换气次数8-10次/小时，每天光照与黑暗时间各小时12小时。

犬只适应性喂养一周后进行高血压建模，采用改良两肾一夹肾性高血压模型，具体操作为：犬腹腔注射45mg/kg戍巴比妥钠麻醉，右侧俯卧并固定于手术台上，剪去背部右侧肾脏位置皮肤的毛，分别用碘酒及酒精消毒皮肤，铺手术孔巾，用手术刀纵向切开皮肤长约4～6cm。用止血钳从背纵肌与腹斜肌交界处分开肌肉，暴露肾脏后，按无菌操作小心、钝性分离出右肾动脉,然后穿入无菌丝线，把直径1.2mm的无菌铁丝与犬肾动脉与肾动脉血管长轴紧贴平行放置，用无菌丝线扎紧肾动脉和铁丝然后抽出铁丝，结果造成单侧肾动脉狭窄。依次缝合肌肉和皮肤，消毒伤口并在伤口处包上干净的纱布，术后两天内每天腹腔注射青霉素80万单位，以防感染。术后精心饲养，观察犬只状况。应用无创血压测定仪检测犬血压(清醒状态下犬的右股动脉血压，每周2次，每次重复3次，取其均值)。四周后选取收缩压≥180mmhg、无感染或其他异常的18只犬进行后续实验。

18只高血压犬随机分为三组，每组6只：明胶胶囊壳组(空白对照组)、罗望子胶胶囊壳组(阴性对照)、罗望子益生菌胶囊组(实验组)，每组犬3只。明胶胶囊壳组每只每天给予标准1#明胶胶囊壳2粒，罗望子胶胶囊壳组每只每天给予实施例1所述罗望子胶囊壳2粒，罗望子胶益生菌胶囊组每只每天给予实施例2所述罗望子胶益生菌胶囊2粒。给药时先固定实验犬，用镊子将胶囊送至犬舌根部，迅速关闭口腔，将头部抬高，使其吞咽下去。

饲喂第0天、15天、30天时，分别无菌取粪便1g，用磷酸盐缓冲液10倍递比稀释至10^-6，选择合适的稀释度分别接种于各选择性培养基，每个稀释度设3个重复。培养基及培养条件见表1。

表1筛选菌属培养基及培养条件

用spss13.0软件对数据进行统计分析，结果如表2。

表2罗望子益生菌胶囊对beagle犬肠道菌群的影响(1gcfu/g)

a：与空白对照组相比有显著性，p<0.05；b：与阴性对照组相比有显著性，p<0.05。

饲喂第15天时，与空白对照组(明胶组)相比，实验组乳杆菌、双歧杆菌增加，葡萄球菌、大肠杆菌和肠球菌含量降低；与阴性对照组(罗望子胶胶囊壳组)相比，实验组乳杆菌、双歧杆菌增加，大肠杆菌、葡萄球菌、肠球菌降低。饲喂第30天时，与空白对照组(明胶组)及阴性对照组(罗望子胶胶囊壳组)相比，实验组乳杆菌、双歧杆菌均显著增加(p<0.05)；与空白对照组(明胶组)相比，实验组大肠杆菌、葡萄球菌含量显著降低(p<0.05)，肠球菌含量也有减低趋势，但不具显著性。

综上所述，说明所述罗望子益生菌胶囊具有改善高血压犬肠道菌群结构，增加有益菌、减少有害菌的功效，且该功效是罗望子胶胶囊壳和益生菌内容物的协同效应产生的结果。

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