一种乳化化学交联法制备复合载药微球及应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，更具体地，涉及乳化化学交联法制备复合载药微球及应用，尤其涉及一种改进的s/w/o乳化化学交联法制备复合载药微球用于良性前列腺增生栓塞治疗的药物缓释制剂。

背景技术：

良性前列腺增生(bph)是一种老年男性常见的多发病。虽然经尿道前列腺切除术被认为是治疗bph的“金标准”，但仍然会给患者带来不同程度的损伤。非那雄胺(fns)是一种5α-还原酶抑制剂，能够抑制雄性激素睾酮(t)转化为活性更高的二氢睾酮(dht)，因而能够有效减小前列腺体积的大小，增加尿流量。但是口服fns会产生全身性副作用，比如男性女乳症、性欲减退、勃起功能障碍和射精障碍等。在过去的几年中，载药微球(如dcbead，hepasphere)已经用于肝癌的化疗栓塞，能够将化疗药物靶向缓慢递送到病患部位，增加局部药物浓度，提高药物的生物利用率，并能有效减少副作用(xiang,h.；long,l.；yao,y，etal.cancerres.2019,18,1-12；lee,y.k.；jung,k.s.；kim,d.y,etal.j.gastroenterol.hepatol.2017,32(2),487–496.)。然而，用于bph治疗的载药栓塞材料却很少有研究报道。

聚乙烯醇(pva)已经广泛地用于生物医学，如人工器官、药物载体和伤口敷料。特别地，pva微球也广泛应用于bph的前列腺动脉栓塞(pae)治疗。然而，pva微球负载fns的药物载体却尚未见报道。主要原因是水不溶性的fns很难在亲水性pva基质中相溶。有研究报道减小药物晶体的尺寸可以增加药物在水不相溶性基质中的溶解度(brunaugh,a.；smyth,h.d.c.drugdeliv.andtransl.res.2018,8(6),1740–1750.)。此外，研究表明通过少量表面活性剂的加入可以增加疏水性药物的润湿性，从而提高药物的负载率(chaudhari,s.p.；dugar,r.p.j.drugdeliv.sci.technol.2017,41,68–77.)。

迄今为止，国内外文献和专利检索结果表明，尚没有pva微球包覆fns的药物载体的制备及相关应用研究报道。

技术实现要素：

本发明解决了现有技术中疏水性药物晶体难以在亲水基质中相溶，药物的载药率和包封率较低的技术问题。本发明通过将疏水性药物晶体加入到亲水性表面活性剂中，增加疏水性药物的润湿性，然后进行高压均质，疏水性药物晶体剪切形成分散均匀的药物晶体混悬液；将混悬液加入到亲水性聚合物的水相中，形成混合相加入到乳化剂预乳化的油相中，再加入交联剂，从而形成负载疏水性药物的微球。本发明制备的微球表面光滑圆整，均一性高，微球分散度好且无粘连。此外，微球包封率高，具有良好的药物缓释效果。

按照本发明的第一方面，提供了一种乳化化学交联法制备复合载药微球的方法，包括以下步骤：

(1)制备亲水性聚合物与壳聚糖的混合水溶液，或者制备亲水性聚合物与海藻酸钠的混合水溶液；将疏水性药物加入到亲水性表面活性剂中，所述亲水性表面活性剂用于增加疏水性药物的润湿性，然后进行高压均质，使所述疏水性药物剪切形成分散均匀的药物混悬液；将所述药物混悬液加入到所述混合水溶液中，形成固相与水相的混合相；

(2)将步骤(1)得到的固相与水相的混合相加入到乳化剂预乳化的油相中，形成固相、水相和油相的三相乳液；再加入交联剂，所述交联剂与亲水性聚合物和壳聚糖发生交联反应，或者所述交联剂与亲水性聚合物和海藻酸钠发生交联反应，从而形成负载疏水性药物的微球。

优选地，所述疏水性药物为非那雄胺、度他雄胺、特拉唑嗪或四喃唑嗪。

优选地，所述亲水性聚合物为pva124或明胶。

优选地，所述亲水性表面活性剂为pva1788、pva1750±50和tween80中的至少一种。

优选地，所述乳化剂为span80、span60、span40和tween85中的至少一种；所述油相为正庚烷、石油醚和正己烷中的至少一种。

优选地，所述高压均质的时间为3min-6min，转速为5000rpm-15000rpm。

优选地，所述交联剂为戊二醛、甲醛或香草醛；所述交联反应的温度为50℃-65℃，交联反应的时间为3h-6h。

按照本发明的另一方面，提供了任一所述方法制备得到的复合载药微球。

优选地，所述复合载药微球的直径为100μm-300μm。

按照本发明的另一方面，提供了所述的复合载药微球用于制备良性前列腺增生栓塞药物缓释制剂的应用。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：

(1)本发明采用改进的s/w/o乳化化学交联法制备的复合载药微球，其制备方法简便，微球表面光滑圆整，球形度高，分散性好，粒径均一且载药率和包封率较高，载药率和包封率分别达到12.5％和62.5％。

(2)本发明在亲水性聚合物中加入少量的壳聚糖cs或者海藻酸钠，使得微球在制备过程中因为静电斥力互相排斥，从而防止了微球的团聚。

(3)本发明提供的新方法将水不溶性药物包封于亲水性聚合物基质中，提高了药物的包封率，同时为其它新型载药栓塞剂的开发提供了新思路。

(4)本发明提供的载药栓塞微球能有效地将物理栓塞治疗和药物治疗结合在一起，有助于提高bph栓塞治疗的效果和减轻药物的副作用，具有良好的细胞相容性、血液相容性和组织相容性。

(5)本发明优选地，将水不溶性药物fns直接包封于亲水性复合基质pva/chitosan(pva/cs)中得到载药微球(fns@pva/cs)。制备的微球表面光滑圆整，均一性高，微球分散度好且无粘连。此外，微球包封率高，具有良好的缓释效果，在初始阶段有较高的药物释放速率，之后药物呈线性释放达到45天。

附图说明

图1是本发明实施例1所负载的药物fns的场发射扫描电镜(fesem)图。

图2是本发明实施例1所负载的药物fns的fesem放大图。

图3是本发明实施例1所制备的pva/cs微球的光镜图。

图4是本发明实施例1所制备的pva/cs微球的整体fesem图。

图5是本发明实施例1所制备的单个pva/cs微球的fesem图。

图6是本发明实施例1所制备的单个pva/cs微球的截面fesem图。

图7是本发明实施例1所制备的fns@pva/cs微球的光镜图。

图8是本发明实施例1所制备的fns@pva/cs微球的整体fesem图。

图9是本发明实施例1所制备的单个fns@pva/cs微球的fesem图。

图10是本发明实施例1所制备的单个fns@pva/cs微球的截面fesem图。

图11是本发明实施例1所制备的pva/cs微球的粒径分布直方图。

图12是本发明实施例1所制备的fns@pva/cs微球的粒径分布直方图。

图13是本发明实施例1负载的药物fns，pva/cs微球和fns@pva/cs微球的xrd图谱。

图14是本发明实施例1负载的药物fns，pva/cs微球和fns@pva/cs微球的ftir图谱。

图15是本发明实施例1负载的药物fns，pva/cs微球和fns@pva/cs微球的tga曲线。

图16是本发明实施例1负载的药物fns和fns@pva/cs微球的药物累积释放曲线。

图17是本发明实施例1fns@pva/cs微球药物释放45天时微球表面fesem图。

图18是本发明实施例1制备的微球浸提液与人血管平滑肌细胞(hvsmcs)共培养的细胞相对存活率。

图19是本发明实施例1制备的微球与hvsmcs共培养的死活细胞染色图。

图20是本发明实施例1制备的微球与hvsmcs共培养1天和3天后细胞-在微球表面粘附fesem图。

图21是本发明实施例1制备的微球与稀释兔血在37℃共孵育1h的溶血率。

图22是本发明实施例1制备的微球与稀释兔血在37℃共孵育1h的溶血实验数码照片。

图23是分别用甘油，实施例1制备的pva/cs微球和fns@pva/cs微球进行兔耳中央动脉栓塞0天，7天和15天的兔耳形态变化的数码照片。

图24是分别用甘油、实施例1制备的pva/cs微球和fns@pva/cs微球进行兔耳中央动脉栓塞7天和15天的苏木素-伊红染色实验结果。

图25是分别用甘油、实施例1制备的pva/cs微球和fns@pva/cs微球进行兔耳中央动脉栓塞7天和15天的马松-三色染色实验结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

在一些实施例中，本发明是通过以下技术方案实现的，本发明将固体药物晶体fns分散于表面活性剂pva1788中，在高压均质机中均质使药物颗粒剪切形成分散均匀的药物晶体混悬液，然后将混悬液滴加到pva/cs混合溶液中，机械搅拌并超声分散，之后滴加到外油相中，形成固体-水相-油相(s/w/o)乳液，进一步交联固化得到载药微球，离心收集微球，清洗后干燥保存备用。

在一些实施例中，本发明通过改进的s/w/o乳化交联法制备fns@pva/cs载药微球，包括以下步骤：

(1)内水相的制备：在80℃-90℃下溶解pva124制备pva水溶液，同时用1％的稀醋酸溶解一定量的cs，将两种溶液按照一定比例混合制备成pva/cs混合液；

(2)高压均质：称取一定量的fns加入到pva1788水溶液中，然后在高压均质中均质3min-6min；

(3)将s2中高压均质的fns悬浮液加入到s1中的pva/cs溶液中，搅拌并超声分散，形成s/w混合相；

(4)将s3中所得的s/w混合相加入到span80预乳化的油相中，搅拌形成s/w/o乳液，加入乙醚饱和的戊二醛(w/w，25％)，搅拌数分钟后加入1m盐酸溶液，将反应体系的温度升温至50℃-65℃进行化学交联3h-6h；

(5)离心收集并清洗微球，用甘氨酸或者l-赖氨酸溶液去除残留的戊二醛，清洗后冷冻干燥备用。

在一些实施例中，所述步骤(1)中，所述的pva124的质量体积百分比为10％-16％，pva/cs混合溶液中cs所占的质量百分比为3％-8％。

在一些实施例中，所述步骤(2)中，所述的fns与pva1788的质量体积比为3-8％，pva1788的质量体积比为0.2％-1％，均质搅拌的转速为5000rpm-15000rpm。

在一些实施例中，所述步骤(3)中fns与pva/cs的质量体积比为1：(2.3-9)，超声分散的时间为15min-45min。

在一些实施例中，所述步骤s4中油相为正庚烷，石油醚或正己烷中的一种或几种，戊二醛占体系的体积比为(0.02-0.06)：1，盐酸占体系的体积比为(0.01-0.05)：1。

在一些实施例中，所述步骤s5中甘氨酸或者l-赖氨酸溶液的质量体积比为2-6％。

本发明另一方面提供了上述的载药复合微球在bph栓塞治疗中的应用。

实施例1

称取1.71gpva124固体颗粒水浴加热溶解于12.5ml，85℃的热水中，同时称取0.117gcs粉末溶解于15ml的1％醋酸溶液中，将两者以一定体积比混合得到7.2％(w/v)的pva/cs混合溶液，其中cs所占的质量百分比为5％。将200mgfns加入到3ml，0.5％(w/v)的pva1788溶液中，在高压均质机下以10000rpm均质4min，得到白色的fns悬浮液。将fns加入到上述制备的pva/cs溶液中进行机械搅拌并超声30min，得到s/w混合相，其中fns与pva/cs的质量百分比为20：80。将s/w混合相加入到span80预乳化的正庚烷(o)中，其中s/w相与o相的体积比为1：6.5。以500rpm机械搅拌30min后，得到s/w/o乳液，加入2.6ml戊二醛溶液(w/w,25％)，搅拌5min后加入1.8ml，1m盐酸。之后将体系的温度升高至55℃，进行化学交联5h。离心收集微球，分别用石油醚、无水乙醇和去离子水清洗三次，然后用4％(w/v)的甘氨酸溶液浸泡微球24h以去除残留的戊二醛。最后用去离子水进一步清洗后冷冻干燥，用60和150目的标准筛进行筛分得到100-300μm的微球。未负载fns的pva/cs微球作为实验对照。通过场发射扫描电镜(fesem)和光学显微镜对fns药物晶体和微球形貌进行观察并计算微球粒径。由附图1和图2可知，fns药物晶体呈多面体和棒状结构，尺寸在5-200μm，且表面有小颗粒物附着。光学显微镜(附图3和图7)和fesem(附图4和图8)的观察结果表明，pva/cs和fns@pva/cs微球分布均匀、分散度高。在高倍观察下，pva/cs微球具有连续的光滑表面(附图5)，而fns@pva/cs微球呈现粗糙的表面结构(附图9)。从截面图可以看出，pva/cs微球结实紧凑(附图6)，而fns@pva/cs微球的截面有很多多孔结构，且多孔结构中有fns药物晶体(附图10，如箭头所示)。附图11和图12分别是pva/cs和fns/pva/cs微球的粒径分布直方图，其平均粒径分别为188.9μm和191.5μm。

附图13为制备微球和药物的表征结果，根据xrd图谱可以看出，纯的药物fns为典型的高结晶态，pva/cs微球在19.5°出现较宽阔的特征峰，表明该微球为半结晶结构。当负载fns后，fns@/pva/cs微球的xrd图谱分别在12.3°，14.7°，和19.6°出现了fns的结晶峰，表明fns以结晶态包封于pva/cs微球基质中。

从ftir图谱(附图14)看出，纯的fns在1666和1598cm^-1出现了两个氨基的特征峰，在1385/1365cm^-1出现了叔丁基特征峰。在pva/cs微球中，在3450cm^-1出现了oh的伸缩振动吸收峰。1141cm^-1出现了c-o的伸缩振动吸收峰，在1713和1659cm^-1分别出现了c＝o和c＝c的伸缩振动吸收峰。此外，在2935和2898cm^-1出现了ch2伸缩振动吸收峰。而cs的特征峰(比如，nh2)在fns@pva/cs微球中没有出现，可能与cs含量太少和ftir的检测灵敏度有关。与pva/cs微球相比，在fns@pva/cs微球中出现了fns的药物特征峰，并且没有发生峰的消失或偏移，进一步表明fns成功负载到pva/cs微球中并没有发生与微球基质的相互作用。

tga(附图15)的结果表明，fns在250-372℃出现单一的失重曲线，主要表现为药物的热分解。在pva/cs微球的tga曲线中，表现出两步失重，第一步在30-200℃，与物理结合水相关，第二步在200-480℃，主要是由pva/cs的热分解引起的。fns@pva/cs微球在30-200℃与pva/cs微球表现出同样的失重曲线，在200-345℃表现为fns的热分解，在345-480℃的失重曲线主要为pva/cs链的热分解。由tga结果可以看出，pva/cs和fns@pva/cs微球均具有优良的热稳定性，能够用于栓塞治疗领域。

实施例2

称取1.12gpva124固体颗粒水浴加热溶解于10.4ml，80℃的热水中，同时称取0.2gcs粉末溶解于10ml的1％醋酸溶液中，将两者以一定体积比混合得到5.6％(w/v)的pva/cs混合溶液，其中cs所占的质量百分比为3％。将150mg度他雄胺加入到4ml，1％(w/v)的pva1750±50溶液中，在高压均质机下以15000rpm均质5min，得到白色的度他雄胺悬浮液。将度他雄胺加入到上述制备的pva/cs溶液中进行机械搅拌并超声20min，得到s/w混合相，其中度他雄胺与pva/cs的质量百分比为15：85。将s/w混合相加入到span80预乳化的石油醚(o)中，其中s/w相与o相的体积比为1：5.2。以600rpm机械搅拌30min后，得到s/w/o乳液，加入3.0ml戊二醛溶液(w/w,25％)，搅拌5min后加入1ml，1m盐酸。之后将体系的温度升高至65℃，进行化学交联3h。离心收集微球，分别用石油醚、无水乙醇和去离子水清洗三次，然后用5％(w/v)的l-赖氨酸溶液浸泡微球24h以去除残留的甲醛。最后用去离子水进一步清洗后冷冻干燥，用60和150目的标准筛进行筛分得到100-300μm的微球。所得微球在光镜和显微镜下球形度高，微球之间分散无粘连。化学结构的测试结果证实了度他雄胺在微球中成功负载，其载药率和包封率达到了9.77％和65.1％，在体外具有较好的药物缓释效果。且细胞相容性和血液相容性均良好。

实施例3

称取1.82g明胶固体颗粒水浴加热溶解于15.5ml，80℃的热水中，同时称取0.1g海藻酸钠粉末溶解于10ml的1％醋酸溶液中，将两者以一定体积比混合得到7.6％(w/v)的明胶/海藻酸钠混合溶液，其中海藻酸钠所占的质量百分比为4％。将300mg非那雄胺加入到5ml，1％(w/v)的pva1788溶液中，在高压均质机下以12000rpm均质4min，得到白色的非那雄胺悬浮液。将非那雄胺加入到上述制备的明胶/海藻酸钠溶液中进行机械搅拌并超声15min，得到s/w混合相，其中非那雄胺与明胶/海藻酸钠的质量百分比为25：75。将s/w混合相加入到span80预乳化的石油醚(o)中，其中s/w相与o相的体积比为1：6.5。以500rpm机械搅拌30min后，得到s/w/o乳液，加入2.0ml戊二醛溶液(w/w,25％)，搅拌5min后加入1ml，1m盐酸。之后将体系的温度升高至55℃，进行化学交联5h。离心收集微球，分别用石油醚、无水乙醇和去离子水清洗三次，然后用3％(w/v)的甘氨酸溶液浸泡微球24h以去除残留的戊二醛。最后用去离子水进一步清洗后冷冻干燥，用60和150目的标准筛进行筛分得到100-300μm的微球。所得微球在光镜和显微镜下球形度高，微球之间分散无粘连。化学结构的测试结果证实了非那雄胺在微球中成功负载，其载药率和包封率达到了15.65％和62.6％，在体外具有较好的药物缓释效果。且细胞相容性和血液相容性均良好。

实施例4

将一定量的fns@pva/cs微球置于研钵中研磨成微球粉末，精确称取20mg微球粉末分散于5ml二氯甲烷溶液中，在37℃水浴中加热并加入等体积的甲醇，涡旋振荡5min，然后在3500rpm下离心15min，收集上清液，fns用甲醇以同样方式萃取三次，将三次萃取的fns上清液合并后用高效液相色谱测定药物的浓度，测定的条件为：流动相为乙腈和去离子水(60：40，v/v)，测定波长为210nm，流速为1.0mlmin^-1。载药量和包封率的计算公式如下；

为了测定载药微球体外药物释放曲线，称取10mgfns和负载有相同量fns的fns@pva/cs微球加入到装有5mlpbs(含有0.1％tween80)的透析袋(截留分子量：3.5kda)中，然后将样品加入到装有35mlpbs的50ml离心管中，在37℃的摇床中以150rpm进行振荡。在预设的时间点，取出2ml样品缓释液并加入等体积的新鲜pbs溶液。收集的样品缓释液按照上述条件测定fns的浓度，所有的实验重复三次并绘制药物累积释放曲线。药物释放结束后用fesem观察微球的表面形貌变化。

通过上述实验测得fns@pva/cs微球的载药率和包封率分别为12.5％和62.5％。体外药物释放结果如附图16所示，单纯的药物具有较快的药物释放速率，在24h内释放了47.8％，在释放5天时达到了93.2％。对于fns@pva/cs微球，在初始阶段有较高的药物释放速率，之后药物呈线性释放达到45天。从附图17可以看出，fns@pva/cs微球表面呈粗糙且多孔结构，这些多孔结构可能是药物释放的通道。

实施例5

通过间接接触培养法(cck-8法)检测制备的微球的细胞毒性，将pva/cs和fns@pva/cs微球通过co⁶⁰(9kgy)灭菌24h。用含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的dmem培养基浸泡微球24h制备微球浸提液(10mg/ml)，阳性对照组为含有0.64％苯酚的dmem，阴性对照组为dmem细胞培养基。将人血管平滑肌细胞(hvsmcs)以5×10³/孔接种到96孔板培养24h，然后加入微球浸提液继续培养1，2和3天。在特定的时间点移除培养基，加入150μl含10％cck-8(v/v)的dmem培养基，在37℃的培养箱中培养1h后取出100μl在450nm处测定其吸光度，计算细胞相对增殖率。

进一步通过死/活细胞染色法检测微球的细胞毒性。培养1和3天后，细胞与含钙黄绿素和碘化丙啶的dmem培养基在37℃下孵育15min，随后在488nm激发波长下通过激光共聚焦显微镜观察细胞的死活情况。

细胞在与微球共培养1和3天后，用2.5wt％的戊二醛在4℃下固定细胞12h，之后用pbs反复清洗细胞，用梯度乙醇(30％，50％，70％，80％，90％，95％，和100％)分别对细胞脱水10min，自然风干，喷金后在fesem下观察。

体外细胞存活率测试结果(附图18)表明，pva/cs和fns@pva/cs微球浸提液在培养1天时细胞相对增殖率为99.2％和98.7％，培养2天时细胞相对增殖率为97.3％和96.4％，在第3天时分别达到96.2％和95.3％。与阴性对照组相比，实验组细胞相对增殖率与之无显著性差异，表明无细胞毒性。而阳性对照组在1至3天细胞相对增殖率在10％以下,与微球和阴性对照组具有显著性差异。

从激光共聚焦显微镜观察结果(附图19)得出，hvsmcs与pva/cs和fns@pva/cs微球共培养1天时，细胞生长形态较好，呈正常的纺锤状，没有出现死亡的细胞。在培养3天时，细胞数量在微球和阴性对照组明显增加，且无明显差异。而细胞在阳性对照组几乎为红色，并且为非正常的球状，表明细胞已经明显死亡。

从fesem测试结果(附图20)可以看出，细胞与pva/cs和fns@pva/cs微球共培养1天后，hvsmcs在微球表面粘附生长并伸出丝状伪足。在培养3天后，细胞在微球表面形成互相连接形成稠密的单细胞层。表明细胞与微球相容性较好。

实施例6

为了测定微球的溶血率，将10mg/ml的pva/cs和fns@pva/cs微球在37℃的生理盐水中平衡1h。随后，将100μl稀释的新鲜兔血加入到样品中，在37℃的培养箱中继续孵育1h，之后在1500rpm下离心10min。取上清液在545nm处测定其吸光度。生理盐水作为阴性对照，去离子水作为阳性对照。所有溶血实验重复三次，根据公式(3)计算溶血率：

其中，odt，odn和odp分别为测试样品，阴性对照和阳性对照的吸光度。

溶血率测试结果(附图21)表明，pva/cs和fns@pva/cs微球的溶血率分别为0.70％和0.85％，远远小于国家规定的标准(<2％)，表明无明显的溶血现象。从数码照片(附图22)也可看出，去离子水组有明显的血红素的释放，而生理盐水和微球组没有血红素的释放。这些结果表明微球与兔血红细胞具有较好的相容性。

实施例7

通过兔耳中央动脉栓塞实验初步评估其栓塞效果。新西兰大白兔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)后将兔麻醉。剔除兔耳毛发后用碘酒进行消毒，随后切开兔耳皮肤并分离出兔耳中央动脉。将22g的导管穿刺进入兔耳中央动脉并移除穿刺针。将微球悬浮在甘油溶液(20mg/ml)中，缓慢地从近端动脉注射到远端动脉。只注射甘油组作为对照。栓塞完成后，移除导管并在注射部位按压15min阻止血流流出。肌肉注射抗生素后回笼饲养。在栓塞0，7，和15天后，观察兔耳形貌和颜色变化并拍照。

从附图23可以看出，甘油注射入兔耳中央动脉后，兔耳在整个观察阶段为正常形态，而pva/cs和fns@pva/cs微球在刚栓塞完成时，栓塞部位立即出现苍白色，表明微球成功栓塞后堵塞了血流进入血管。在栓塞7天后，兔耳中央动脉周围组织出现深蓝色，表明部分兔耳组织因缺血而开始坏死。在栓塞15天时，兔耳大部分组织变黑并开始干枯，表明兔耳组织出现严重坏死。这些结果表明微球能有效堵塞兔耳血管，促使兔耳组织因缺血而逐步坏死。

实施例8

在栓塞7天和15天后，麻醉处死兔子并切除兔耳，并在4％的多聚甲醛中固定48h。随后，将兔耳组织块包埋在石蜡中并切成5-μm厚的切片，用常规方法对切片进行苏木素-伊红和马松-三色染色。最后在光学显微镜下观察并拍照。

附图24所示为兔耳栓塞7天和15天后纵向血管苏木素-伊红染色结果。在甘油注射组，在7和15天时兔耳血管被血栓填充，兔耳血管周围无明显的炎症细胞浸润。在pva/cs和fns@pva/cs微球组，在栓塞7天时，在血管周围组织出现部分缺血坏死，此外，有一定的炎症细胞浸润(黑色箭头)。栓塞第15天时，炎症反应减弱，兔耳周围出现片状纤维坏死组织(黄色箭头)。这些结果表明栓塞微球能有效阻断兔耳血流并引起兔耳组织缺血性坏死。

附图25所示为兔耳栓塞7天和15天后纵向血管马松-三色染色结果。从图中可以查看出，甘油栓塞组的兔耳组织切片没有出现胶原纤维形成，表明无缺血坏死变化。在pva/cs和fns@pva/cs微球组，栓塞第7天时，兔耳周围组织出现部分胶原纤维沉积，表明兔耳组织出现部分缺血坏死。栓塞第15天时，兔耳周围组织有更致密的胶原纤维沉积，表明兔耳组织出现大面积的缺血坏死。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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