诺卡酮在制备治疗腹泻药物以及iNOS、COX-2、MCP-1抑制剂中的应用的制作方法

本发明涉及中医药技术领域，特别诺卡酮在制备治疗腹泻药物以及inos、cox-2、mcp-1抑制剂中的应用。

背景技术：

伊立替康是半合成的喜树碱衍生物，通过抑制dna拓扑异构酶ⅰ干扰dna的结构和功能，抑制肿瘤细胞增殖。临床广泛应用于胃肠道癌症、小细胞肺癌、绒毛膜上皮癌、膀胱癌等癌症，是临床一线化疗药物。腹泻是伊立替康导致的主要不良反应，发生率可达90％，3-4度较严重的腹泻发生率在10％作用，最严重腹泻不良反应的可危及生命。发生该不良反应的机制可能包括以下方面：1.伊立替康静脉注射入血后，其原型化合物及经肝脏转化的代谢物经过胆汁排泄进入肠道，在肠道内的伊立替康经羧酸酯酶代谢为7-乙基-10-羟基喜树碱(sn-38)，高浓度的sn-38对肠道上皮细胞有直接损伤作用，导致肠道上皮细胞坏死、凋亡，使小肠功能紊乱，小肠液分泌过多，水、电解质吸收障碍。2.伊立替康可引起肠道上皮细胞环氧酶2(cox-2)表达增加，cox-2催化合成的致炎因子前列腺素e2(pge2)增加，诱发肠道分泌水、电解质，最终导致腹泻。3.肠道内的伊立替康代谢产物sn-38可经肝脏的尿苷二磷酸葡萄糖转移酶(ugt1a1)转化为无毒性的葡萄糖醛酸化sn-38(sn-38g)，经胆汁排泄入肠道后随粪便排出体外。ugt1a1对sn-38的转化能力决定了其在肠道内的浓度，对腹泻不良反应的发生有关键作用。同时，sn-38g也可以被肠道菌群分解为sn-38，肠道菌群失调与伊立替康导致腹泻有相互促进作用。

预防或治疗伊立替康导致的腹泻，目前可用的方法有限。洛哌丁胺是目前治疗伊立替康腹泻的标准治疗药物。洛哌丁胺激动肠道内的阿片受体，减少肠蠕动和分泌，增加肛门括约肌张力，抑制伊立替康导致的腹泻，同时具有一定的抑制炎症因子作用。然而，洛哌丁胺可能导致麻痹性肠梗阻，连续用药不可超过48小时。因此，本发明人致力从中药材中获取一种更为安全的有效减轻腹泻不良反应的活性成分。

益智仁来源于姜科山姜属植物益智(alpiniaoxyphyllamiq.)，主要分布于海南岛。益智仁中药，功能主治温脾，暖肾，固气，涩精。治冷气腹痛，中寒吐泻，多唾，遗精，小便余沥，夜多小便。诺卡酮是一种倍半萜类化合物，是中药益智仁的活性成分之一，在去皮的干燥益智仁中含量可达到1.898～3.692mg/g。相关研究表明，诺卡酮具有抗炎、抗菌、神经保护、抗老年痴呆等药理作用。

技术实现要素：

鉴于此，本发明提出诺卡酮在制备治疗腹泻药物以及inos、cox-2、mcp-1抑制剂中的应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

诺卡酮在制备治疗伊立替康引起腹泻不良反应的药物中的应用。

诺卡酮在制备inos抑制剂中的应用。

诺卡酮在制备cox-2抑制剂中的应用。

诺卡酮在制备mcp-1抑制剂中的应用。

益智仁乙醇提取物在制备治疗伊立替康引起腹泻不良反应的药物中的应用，其特征在于，所述益智仁乙醇提取物含有诺卡酮。

进一步的，所述益智仁乙醇提取物的提取溶剂为90-95v/v％乙醇溶液。优选95v/v％乙醇溶液。

益智仁乙醇提取物在制备cox-2抑制剂中的应用，所述益智仁乙醇提取物含有诺卡酮。

益智仁乙醇提取物在制备mcp-1抑制剂中的应用，所述益智仁乙醇提取物含有诺卡酮。

益智仁乙醇提取物在制备inos抑制剂中的应用，所述益智仁乙醇提取物含有诺卡酮。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明诺卡酮以及含诺卡酮的益智仁乙醇提取物，能够有效减轻伊立替康导致的腹泻不良反应，缩短腹泻日程，减轻结肠黏膜损伤。通过动物实验证明诺卡酮以及含诺卡酮的益智仁乙醇提取物能有效减轻静脉注射伊立替康后大鼠的腹泻症状，降低结肠组织中cox-2、mcp-1、inos等炎症相关蛋白的表达，可应用于制备cox-2、mcp-1、inos抑制剂，可应用于制备治疗伊立替康引起腹泻不良反应的药物中。本发明诺卡酮分离自中药益智仁乙醇提取物，原料为中药益智仁，安全可靠，可更好应用于制备化疗药物伊立替康导致的腹泻不良的药物，有效提高化疗患者的舒适性。

附图说明

图1为诺卡酮的化学结构式；

图2.为不同组别大鼠结肠组织代表性病理切片图；

图3为益智提取物、诺卡酮对伊立替康导致的腹泻大鼠结肠组织中mcp-1、cox-2、inos蛋白表达的影响(westernblot法)；1.正常对照组2.模型组3.柳氮磺吡啶4.益智提取物5.诺卡酮。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1益智提取物的制备

取干燥后粉碎的益智仁粗粉500g，加入4000毫升95v/v％乙醇加热回流提取2小时，过滤，滤渣再加入3000毫升95v/v％乙醇加热回流提取2小时，再过滤。合并两次滤液，减压回收至无醇味。水浴加热浓缩，得益智提取物流浸膏。得率为12.7％。

实施例2益智提取物中活性成分的分离和鉴定

取干燥益智仁25kg，低温粉碎，粉末加入用95v/v％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，合并两次提取液，减压回收乙醇，加蒸馏水稀释后，用石油醚萃取。减压蒸馏回收石油醚，得石油醚萃取物。将石油醚萃取物上硅胶色谱柱分离，用石油醚-乙酸乙酯(100:0-0:100)梯度洗脱，得到10个部分(fr.1-fr.10)。fr.1经硅胶薄层色谱分析，分为5个流分(fr.1.1-fr.1.5)。其中fr.1.4经硅胶柱色谱分离纯化，得10.0mg化合物3。

结构鉴定如下：化合物3，淡黄色油状物，esi-msm/z219[m+h]⁺；¹h-nmr(cdcl3,500mhz),δ5375(1h,s,h-1),4.71(2h,d,h-12),2.5～2.2(5h,m,h-3,h-6,h-7),2.0～1.9(3h,m,h-13),1.73(3h,s,h-14),1.39-1.30(4h,m,h-4),1.12(4h,m,h-8,h-9),0.96(3h,d,h-15)；¹³c-nmr(cdcl3,125mhz),δ198.7(c-2),169.8(c-10),148.2(c-11),124.0(c-1),108.7(c-2),43.4(c-3),41.4(c-6),39.9(c-7),39.7(c-4),38.3(c-5),32.4(c-9),31.3(c-8),20.3(c-13),16.2(c-14),14.3(c-15).按照¹h-nmr和¹³c-nmr谱解析，比对有关文献，确诊化合物3为诺卡酮，化学结构式如图1所示。

实施例3益智提取物、诺卡酮对伊立替康腹泻不良反应的作用

实施例1制得的益智提取物用1％羧甲基纤维素钠研磨混匀制成混悬液(合0.27g生药/ml)。阳性对照药选用柳氮磺吡啶肠溶片，研磨成细粉，1％羧甲基纤维素钠制备成0.05g/ml的混悬液。实施例2制得诺卡酮用1％羧甲基纤维素钠制备成5.0mg/ml的混悬液。

取200-240g雄性sd大鼠，适应性饲养3天后，每组8只随机分为5组：伊立替康导致腹泻模型组、正常对照组、柳氮磺吡啶肠溶片组、益智提取物组、诺卡酮组。模型组和正常对照组灌胃给予1％羧甲基纤维素钠溶液，其他组分别给予相应药物。连续给药8天，于第2天给药后30min腹腔注射伊立替康250mg/kg(0.01m,ph7.2-7.4的pbs缓冲液配制)。给药期间每天记录大鼠体重变化、腹泻情况。末次给药前禁食不禁水12小时，给药后30min用异氟烷麻醉大鼠，经眼眶静脉丛采血，肝素抗凝，离心取血浆-40℃保存待测。然后脱颈椎处死大鼠，取距盲肠约3cm处结肠，分为3段，每段约1.5cm长。结肠用4℃生理盐水洗净，滤纸吸干后，将其中1段放入4％多聚甲醛中固定，用于病理免疫组织化学检测；另2段分装于离心管中，-80℃保存待测，分别用于westernblot法和elisa法检测mcp-1、cox-2、inos含量。

(1)腹泻、体重、一般状态观察：各组大鼠腹腔注射伊立替康后，每天观察腹泻程度，按以下标准打分：粪便正常成形，0分；轻度腹泻，粪便软湿，1分；中度腹泻，粪便不成形，肛周轻度着色，2分；重度腹泻，水样粪便，肛周重度着色，3分。各组大鼠腹泻打分情况见下表1：

表1：腹腔注射伊立替康后各组大鼠腹泻状况打分(mean±sd，n＝8)

注：与模型组比较*p<0.05，**p<0.01

腹腔注射伊立替康后，大鼠当天即腹泻，模型组在注射后5天，个别大鼠腹泻有所减轻，给药组大鼠大鼠腹泻状态较模型组减轻，到第5天逐渐恢复正常。各组大鼠体重变化无显著差异。模型组大鼠表现出精神萎靡状态，但体重没有显著下降，各给药组大鼠精神状态较模型组更好。另外，相比益智提取物，诺卡酮有效减少使用剂量，而且第4天诺卡酮组腹泻程度明显比益智提取物组腹泻程度低，可见诺卡酮为更优选择，可更好应用于制备治疗伊立替康引起腹泻不良反应的药物。

(2)组织病理切片检测：取4％多聚甲醛固定24h后的结肠组织，常规脱水、固定、切片。一部分切片用苏木精-伊红(he)染色，另一部分切片免疫组化染色。各组大鼠结肠组织中he染色和cox-2、inos、mcp-1免疫组化染色显微镜下观察见图2。

he染色病理切片可见模型组大鼠结肠组织细胞黏膜表面扩张充血，部分黏膜坏死脱落。正常对照组大鼠结肠组织细胞排列整齐，边缘清晰。益智提取物和诺卡酮组大鼠结肠组织细胞可见部分炎细胞，肉芽组织增生，呈现出损伤后修复状态，黏膜损伤状态比模型组轻微。

cox-2蛋白的阳性染色(棕黄色)见于结肠细胞中，大部分分布在胞浆，少部分分布于胞核(模型组图)，呈现较广泛的表达。观察可见，模型组较空白组表达明显增多。各给药组cox-2蛋白表达相对模型组有一定程度的降低，其中益智提取物与阳性药柳氮磺吡啶对cox-2蛋白表达的抑制作用较为明显。

inos蛋白阳性染色(棕黄色)以细或粗颗粒存在于结肠细胞中，细胞膜上偶见(模型组图)，空白组正常结肠中低表达。与cox-2蛋白表达趋势一致：各给药组inos蛋白表达相对模型组有一定程度的降低，诺卡酮对inos蛋白表达的抑制作用较益智提取物更大。

单核细胞趋化蛋白-1(mcp-1)染色(棕黄色)示结肠组织表达mcp-1蛋白的细胞。由图可见，空白组中无可视染色，模型组中出现染色细胞。各给药组对mcp-1均有抑制作用，益智提取物组、阳性药柳氮磺吡啶抑制作用较为明显。

(3)westernblot法检测结肠组织中mcp-1、cox-2、inos蛋白表达：

称取约0.05-0.10g组织样品置2ml离心管中，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。加入组织重量5-10倍体积混合好的ripa裂解液(含1mmpmsf)，置于冰上进行匀浆(30s低速匀浆，间隙1min)。重复碾几次使组织尽量碾碎。放入4℃冰箱裂解3h后，4℃下12000rpm离心5min，取上清200μl于0.5ml离心管中，多余的-80℃冻存。bca法定量蛋白质浓度。按蛋白含量测定结果，用ripa裂解液(含1mmpmsf)稀释样品至同一蛋白浓度(5μg/μl),取200μl，与2×sds加样染料与去离子水混合均匀，将各样品置于蛋白变性仪上95℃加热5min，使蛋白质变性。12000rpm离心5min，取上清液上样10％sds聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后转印刷到pvdf膜，室温下置于水平摇床上封闭1h，然后分别用一抗、二抗孵育，反应时间和抗体浓度按说明书进行。ecl化学发光法显色，使用fluorchemetm成像系统成像，拍照后imagej软件进行蛋白条带灰度分析定量。

inos、cox-2、mcp-1蛋白表达及定量见图3，图3为益智提取物、诺卡酮对伊立替康导致的腹泻大鼠结肠组织中mcp-1、cox-2、inos蛋白表达的影响(westernblot法)；1.正常对照组2.模型组3.柳氮磺吡啶4.益智提取物5.诺卡酮；注：与空白组比较**p<0.01，与模型组比较#p<0.05,##p<0.01。

以上结果表明，益智提取物及其活性成分诺卡酮能有效减轻伊立替康导致的腹泻不良反应，缩短腹泻日程，减轻结肠黏膜损伤。产生上述作用的机制可能与抑制结肠黏膜组织中cox-2、inos、mcp-1蛋白的表达有关。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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