3-芳基香豆素类化合物的应用的制作方法

本发明涉及药物生产领域，具体提供3-芳基香豆素类化合物在制备糖尿病疾病及相关的血管钙化药物中的应用。
背景技术：
：糖尿病是一种慢性的、多因素的代谢紊乱，以高血糖、胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能障碍为特征的一种疾病。糖尿病患者极易并发心血管疾病，心血管并发症是糖尿病患者最主要的死亡原因，这与血管钙化病变具有很大的联系，其患者广泛存在血管钙化。相比普通人群，糖尿病患者发生血管钙化的指数明显升高，主要发生在冠状动脉和下肢血管，同时血管钙化与动脉粥样硬化、心力衰竭等预后也密切相关。血管钙化是指通过将羟基磷灰石矿物质沉积到细胞外基质中硬化动脉的内侧层。与传统上认为血管钙化是一个随着年龄增加、以矿物质代谢失调为主的渐进性的被动过程相比，目前发现血管钙化形成是由多种细胞起源并与骨发育相似的、主动的、高度可调控的复杂病理生理过程。目前有关高糖对内皮细胞表型改变的分子调控机制尚不十分清楚。根据现有文献，高血糖的重要代谢产物-糖基化终末产物(ages)可通过多种途径和方式诱发钙化级联反应进而导致血管钙化的发生，这可能是高糖诱发血管钙化的最重要原因。在血管钙化的治疗方面，目前尚无逆转血管钙化的手段,但多种干预措施可用于减慢或延缓血管钙化的进展，例如控制高血糖等传统危险因素、阻断ages生成、ages/rage的相互作用、降低氧化应激等，但这些干预措施仍存在作用靶点单一，副作用大，治疗效果差等缺点，所以治疗血管钙化是目前研究的难点和热点。近年来有多种天然产物被报道具有血管保护的作用，香豆素与黄酮类化合物因为具有良好的ages生成抑制、抗氧化、抗炎活性近年来备受关注，其中伞形花内酯、槲皮素、大豆异黄酮等都被认为具有良好的血管保护作用而被多次的研究与报导，但因为其活性较弱，或细胞毒性、致癌等副作用直接成药有一定困难。技术实现要素：本发明是针对上述现有技术的不足，提供两种3-芳基香豆素类化合物的应用。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：结构式i和/或结构式ii所示3-芳基香豆素类化合物在制备预防和/或治疗糖尿病人血管钙化药物中的应用，经大量实验，申请人发现结构式i和结构式ii所示3-芳基香豆素类化合物在降低血糖的同时，可很好地预防与治疗糖尿病引发的血管钙化。作为优选，结构式i和/或结构式ii化合物可用于制备多靶点抗糖尿病诱发的血管钙化的药物。所述抗糖尿病诱发的血管钙化药物以结构式i和/或结构式ii所示3-芳基香豆素类化合物为有效成分。作为优选，结构式i和/或结构式ii化合物可用于制备碱性磷酸酶活性抑制剂。所述碱性磷酸酶活性抑制剂以结构式i和/或结构式ii所示3-芳基香豆素类化合物为有效成分。作为优选，结构式i和/或结构式ii化合物可用于制备ages形成抑制剂。所述ages形成抑制剂以结构式i和/或结构式ii所示3-芳基香豆素类化合物为有效成分。预防和/或治疗糖尿病及其并发症的组合物，有效成分为结构式i和/或结构式ii所示3-芳基香豆素类化合物。结构式i化合物、结构式ii化合物或组合物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。需要的时候，在结构式i化合物、结构式ii化合物或组合物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体，以制备成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式的药品和/或保健品。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。进一步的，结构式i和/或结构式ii所示3-芳基香豆素类化合物还可以应用于在体外进行血管平滑肌细胞钙化水平试验中。申请人在细胞水平上对3-芳基香豆素类化合物减慢或延缓血管钙化进程这一活性进行了评价和筛选，所涉及的两种3-芳基香豆素类化合物具有高活性低毒性、可显著抑制血管钙化。附图说明附图1是实施例三中ages诱导钙化alp结果；附图2是实施例四中ages诱导钙化alp结果。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明的两种3-芳基香豆素类化合物抗糖尿病活性进行详细说明，但本发明并不局限于此。本领域技术人员根据本发明专利所做出的各种变化均应在本发明权利的保护范围之内。下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例中所用的两种化合物的结构式及编号如下：实施例一：两个化合物对细胞的毒性测定(1)培养2-8代人体主动脉血管平滑肌细胞，用含10％胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔5000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。(2)设置7个组别，分别为：正常组、ⅰ-6.25ug、ⅰ-12.5ug、ⅰ-25ug、ⅱ-6.25ug、ⅱ-12.5ug、ⅱ-25ug。药物每组设置6个复孔。同一般培养条件，培养24h，48h。(3)培养结束后，每孔加mtt溶液(5mg/ml，用pbs<ph＝7.4>配制)20ul。继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150uldmso，振荡10分钟，使结晶物充分融解。(4)选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。(5)结果下表所示：组别正常组ⅰ-6.25ugⅰ-12.5ugⅰ-25ugⅱ-6.25ugⅱ-12.5ugⅱ-25ugod均值0.5730.5650.6010.5540.5640.5990.578由测试结果可以看出在不同浓度梯度下，结构式i和结构式ii对细胞均无毒性。实施例二：人的血管平滑肌细胞的钙化诱导(1)钙化诱导液的配制称取牛血清白蛋白20mg，溶于50mmol/lpbs(ph7.4)配制成终浓度为10mg/ml的牛血清白蛋白的pbs(ph7.4)缓冲液。称取79.2mg葡萄糖，溶于2ml蒸馏水中，配制成终浓度为0.2mol/l的葡萄糖溶液。将以上两种溶液进行混合并过滤，加入0.02％双抗，以防止细菌增长。以上混合溶液在37℃温育14天，使用荧光分光光度计设定激发波长和发射波长分别为350nm和420nm，测得age的荧光强度如下：(2)人体主动脉血管平滑肌的钙化诱导购买人体主动脉血管平滑肌细胞(havsmcs)。取2-8代的细胞用于实验。用ages钙化培养基诱导细胞后，分为6组，包括正常对照组，钙化模型组，溶媒对照组，阳性对照组，样品ⅰ处理组，样品ⅱ处理组。其中样品处理组又按浓度分为3小组：6.25ug/ml、12.5ug/ml、25ug/ml。在37℃、5％co2条件下温育4天后进行碱性磷酸酶活性检测。实施例三：两种化合物对钙化细胞碱性磷酸酶活性的抑制作用测定1.体外碱性磷酸酶活性的测定原理碱性磷酸酶广泛分布于人体的骨骼、肠、肾脏、肝脏、胎盘等组织，是临床上常用的筛查诊断骨病的一个检测指标。在碱性条件下，para-nitrophenylphosphate(pnpp)可在碱性磷酸酶作用下生成para-nitrophenol。para-nitrophenol在碱性条件下呈黄色产物，可以在400-415nm检测吸光度。产物黄色越深，说明碱性磷酸酶活性越高，吸光度值越高，反之酶活性越低。2.反应溶液的配制(1)试剂准备:将所有试剂取出,恢复至室温使用。(2)显色底物溶液的配制:取一管显色底物,溶解于2.5ml的检测缓冲液中，先用1ml检测缓冲液进行溶解,充分溶解和混匀后,转移至15ml离心管,再加入1.5ml检测缓冲液,充分溶解和混匀,冰上放置。新鲜配制的显色底物溶液在6小时内使用。(3)标准品工作液的配制:取10ulpnitrophenol溶液(10mm)，用检测缓冲液稀释至0.2ml，最终浓度为0.5mm。(4)细胞裂解液的准备:钙化诱导后的细胞去除培养液，用pbs洗一遍。24孔板每孔加入80微升裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。随后10000g离心3min取上清,用于碱性磷酸酶的检测。(5)按照下表使用96孔板设置空白对照孔、标准品孔和样品孔。标准品的用量分别为4、8、16、24、32和40微升,样品加50微升。(6)用枪头轻轻吹打混匀。(7)37℃孵育15分钟。(8)每孔加入100u1反应终止液终止反应。此时,标准品或有碱性磷酸酶活性的孔会呈现不同深浅的黄色。(9)在405m测定吸光度。(10)结果如图1及下表所示。由测试结果可以看出：结构式i和结构式ii均能抑制钙化细胞碱性磷酸酶的活性，其中结构式i的效果最佳，结构式ii对于碱性磷酸酶活性的抑制作用虽然不及结构式i及阳性对照药，但与钙化组相比仍能明显抑制碱性磷酸酶的活性。组别正常低糖正常高糖钙化诱导阴性对照阳性对照ⅰ-6.25ugⅰ-12.5ugⅰ-25ugod均值0.1480.2540.4770.4670.3230.3230.3480.36ⅱ-6.25ugⅱ-12.5ugⅱ-25ug0.3310.4190.418实施例四：两种化合物与其他同骨架化合物对钙化细胞碱性磷酸酶活性的抑制作用的比较随机选取如下四个化合物进行碱性磷酸酶活性抑制作用的对比实验。(1)按照实施例二的方法进行钙化诱导液的配制以及人体主动脉血管平滑肌细胞的钙化诱导。(2)标准品工作液的配制:取10ulpnitrophenol溶液(10mm)，用检测缓冲液稀释至0.2ml，最终浓度为0.5mm。(3)按照实施例三的方法对结构式i、ii、iii、iv、v、vi六种化合物对钙化细胞碱性磷酸酶活性的抑制作用进行测定。(4)结果如图2及下表所示。可以看出结构式i、ii化合物较其他类似化合物对钙化诱导细胞的碱性磷酸酶活性有更为明显的抑制作用。组别正常低糖正常高糖钙化诱导阴性对照阳性对照od均值0.2160.3270.6190.6070.384组别ⅰ-12.5ugⅱ-12.5ugiii-12.5ugiv-12.5ugv-12.5ugvi-12.5ugod均值0.3690.4520.5780.6040.5390.577综上以上所有实施案例可以看出，上述两化合物具有良好的降钙活性，通过抑制碱性磷酸酶活性等途径发挥降低糖尿病病人血管钙化以及保护糖尿病引发的心血管并发症的作用。此发明专利为发展多靶点治疗糖尿病血管并发症的药物提供了重要思路，具有重要的研究价值和应用潜力。当前第1页1 2 3 

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