含HSP90抑制剂和PARP抑制剂的药物组合物的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种含hsp90抑制剂和parp抑制剂的药物组合物。

背景技术：

套细胞淋巴瘤（mcl）是一种恶性程度较高的非霍奇金淋巴瘤。因其临床表现复杂，疾病进展多样以及经常出现复发，目前尚无治愈方案。常规化疗药物对mcl患者毒副作用较大，且易发生耐药，因此，亟待寻找新的治疗方法和策略。mcl目前的治疗主要以利妥昔单抗和阿糖胞苷为基础，联合化疗及自体干细胞移植（asct）治疗。虽然有效延长了疾病的缓解时间，但尚未发现治愈的方法，这与常规化疗的毒副作用及耐药密切相关。为了减少化疗带来的不良反应，人们将目光投向了靶向药物的研究。

热休克蛋白90（hsp90）是一种依赖atp的分子伴侣蛋白，它可以防止蛋白质发生错误折叠或异常聚集，并可维持细胞内环境的稳定。大量研究发现hsp90在多种癌症患者的肿瘤组织和血清中都有较高的表达。hsp90已成为多种疾病的重要药物靶点。ganetespib(sta-9090)是syntapharmaceuticals公司研究开发的用于血液和实体恶性肿瘤的静脉注射的第二代hsp90抑制剂。它是一种含间苯二酚的三唑化合物，具有新颖的化学结构。随着肿瘤分子生物学的研究进展，肿瘤分子靶向治疗已成为肿瘤研究的热点，大部分肿瘤的生物学行为并非由单一信号传导通路所支配，而是多个信号传导通路共同起作用的，因此联合用药针对多靶点进行靶向治疗不仅旨在减少或延缓耐药性的出现、降低毒性，而且通过多种药物对癌细胞杀伤的协同作用取得更好的疗效。

多聚adp核糖聚合酶（parp）抑制剂（parpi）是一种新型靶向抗肿瘤药物，通过影响肿瘤细胞的dna损伤修复发挥抗肿瘤作用，parp抑制剂奥拉帕尼（olaparib）可以通过合成致死选择性靶向具有brca1/brca2抑癌基因突变的肿瘤细胞。目前，还未见关于hsp90抑制剂和btk抑制剂联合用药用于抗肿瘤的相关研究报道。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中存在的缺陷，改善目前常用治疗方案对套系细胞淋巴瘤治疗效果上的不足，提供一种治含hsp90抑制剂和parp抑制剂的药物组合物。具体涉及含有有效剂量的parp抑制剂olaparib和第二代hsp90抑制剂ganetespib的联合用药。

本发明提供了一种药物组合物，其包含有hsp90抑制剂和parp抑制剂。

其中，所述的hsp90抑制剂是ganetespib，所述的parp抑制剂选自olaparib。

优选地，所述的组合物中ganetespib和olaparib的摩尔浓度比为15nm：6.25~100μm或20nm：5~75μm。

此外，本发明还请求保护上述的药物组合物在预防和/或治疗套细胞淋巴瘤肿的应用。所述的药物组合物中含有，hsp90抑制剂是ganetespib，所述的parp抑制剂是olaparib。

有现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供一种用于治疗套细胞淋巴瘤的药物组合物，具体为将hsp90抑制剂和parp抑制剂组合使用。为套细胞淋巴瘤药物治疗提供新的药物选择。本发明通过生物学活性分析后发现olaparib与ganetespib联合用药对套细胞淋巴瘤jeko-1和rec-1有明显抑制作用，效果显著优于单独用药，具有相加或协同效应。相比传统用olaparib单药治疗，可降低olaparib的作用浓度，且能够明显抑制套细胞淋巴瘤增殖，避免由于只使用单药olaparib治疗的复发性以及获得性耐药事件的发生。同时为药物的设计研发提供了新的理论支持，在对套细胞淋巴瘤的研究和治疗方面具有极大的价值。

附图说明

图1是不同浓度的ganetespib处理jeko-1细胞72h后对增殖的影响；

图2是不同浓度的olaparib处理jeko-1细胞72h后对增殖的影响；

图3是不同浓度的ganetespib处理jeko-1细胞72h后对增殖的影响；

图4是不同浓度的olaparib处理rec-1细胞72h后对增殖的影响；

图5是ganetespib处理增加jeko-1细胞对olaparib的敏感性；

图6是ganetespib处理增加rec-1细胞对olaparib的敏感性。

具体实施方式

本发明公开了一种药物组合物。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从化学试剂公司购买。发明所中olaparib、ganetespib均购自于sellect公司，套细胞淋巴瘤（mcl）细胞jeko-1、rec-1均来自于atcc。本发明所用的术语“parp抑制剂”是指靶向、降低或抑制多聚adp核糖聚合酶活性的化合物。该术语包括但不限于olaparib。本发明所用的术语“hsp90抑制剂”是指靶向、降低或抑制活性的化合物。该术语包括但不限于ganetespib。

实施例1不同浓度的ganetespib处理jeko-1细胞后对增殖的影响

根据说明书用dmso将ganetespib配制为10mm的储存浓度，后续使用浓度用dmso培养基进行梯度稀释。收集培养状态良好的套细胞淋巴瘤细胞jeko-1，200g离心5min，弃上清，pbs清洗一次。重悬细胞，进行细胞计数，将细胞悬液种于24孔细胞培养皿中，密度为每孔1ml培养基含5×10^４个细胞，每孔中加入不同使用浓度的ganetespib处理细胞，恒温培养箱中培养72h；同时设置空白对照组。采用mtt法检测细胞增殖，待检测孔中加入100μl5mg/ml的mtt溶液，于培养箱中孵育1.5h，显微镜下观察有蓝紫色甲瓒结晶，吸弃上清液，每孔加400μldmso溶解结晶，拍匀，最后用酶标仪在550nm波长处测定每孔吸光值，计算细胞的相对存活率。存活率（%）＝(实验组od值-空白对照组od值)/(对照组od值-空白对照组od值)×100％，实验结果如图1所示，由graphpad软件计算得出ganetespib处理jeko-1细胞的半数抑制浓度（ic50）为12.841.57nm。可见，ganetespib可以有效抑制jeko-1细胞增殖，ganetespib对jeko-1细胞生长的抑制呈浓度依赖关系。

实施例2不同浓度的olaparib处理jeko-1细胞后对增殖的影响

根据说明书用dmso将olaparib配制为10mm的储存浓度，后续使用浓度用dmso培养基进行梯度稀释。收集培养状态良好的套细胞淋巴瘤细胞jeko-1，200g离心5min，弃上清，pbs清洗一次。重悬细胞，进行细胞计数，将细胞悬液种于24孔细胞培养皿中，密度为每孔1ml培养基含5×10^４个细胞，每孔中加入不同使用浓度的olaparib处理细胞，恒温培养箱中培养72h；同时设置空白对照组。采用mtt法检测细胞增殖，待检测孔中加入100μl的mtt（5mg/ml）溶液，于培养箱中孵育1.5h，显微镜下观察有蓝紫色甲瓒结晶，吸弃上清液，每孔加400μldmso溶解结晶，拍匀，最后用酶标仪在550nm波长处测定每孔吸光值，计算细胞的相对存活率，存活率（%）＝(实验组od值-空白对照组od值)/(对照组od值-空白对照组od值)×100％。实验结果如图2所示，由graphpad软件计算得出olaparib处理jeko-1细胞的半数抑制浓度（ic50）为24.563.65μm。可见，olaparib可以有效抑制jeko-1细胞的增殖，且olaparib对jeko-1细胞生长的抑制呈浓度依赖关系。

实施例3不同浓度的ganetespib处理rec-1细胞后对增殖的影响

根据说明书用dmso将ganetespib配制为10mm的储存浓度，后续使用浓度用dmso培养基梯度稀释。收集培养状态良好的套细胞淋巴瘤细胞rec-1，200g离心5min，弃上清，pbs清洗一次。重悬细胞，进行细胞计数，将细胞悬液种于24孔细胞培养皿中，密度为每孔1ml培养基含5×10^４个细胞，每孔中加入不同使用浓度的ganetespib处理细胞，恒温培养箱中培养72h；同时设置空白对照组。采用mtt法检测细胞增殖，待检测孔中加入100μlmtt（5mg/ml）溶液，于培养箱中孵育1.5h，显微镜下观察有蓝紫色甲瓒结晶，吸弃上清液，每孔加400μldmso溶解结晶，拍匀，最后用酶标仪在550nm波长处测定每孔吸光值，计算细胞的相对存活率，存活率（%）＝(实验组od值-空白对照组od值)/(对照组od值-空白对照组od值)×100％。实验结果如图3所示，由graphpad软件计算得出ganetespib处理rec-1细胞的半数抑制浓度（ic50）为20.573.34nm；可见，ganetespib可以有效抑制rec-1细胞的增殖，ganetespib对rec-1细胞生长的抑制呈浓度依赖关系。

实施例4不同浓度的olaparib处理rec-1细胞后对增殖的影响

根据说明书用dmso将olaparib配制为10mm的储存浓度，后续使用浓度用dmso培养基梯度稀释。收集培养状态良好的套细胞淋巴瘤细胞rec-1，200g离心5min，弃上清，pbs清洗一次。重悬细胞，进行细胞计数，将细胞悬液种于24孔细胞培养皿中，密度为每孔1ml培养基含5×10^４个细胞，每孔中加入不同使用浓度的olaparib处理细胞，恒温培养箱中培养72h；同时设置空白对照组。采用mtt法检测细胞增殖，待检测孔加入100μl5mg/ml的mtt溶液，于培养箱中孵育1.5h，显微镜下观察有蓝紫色甲瓒结晶，吸弃上清液，每孔加400μldmso溶解结晶，拍匀，最后用酶标仪在550nm波长处测定每孔吸光值，计算细胞的相对存活率，存活率（%）＝(实验组od值-空白对照组od值)/(对照组od值-空白对照组od值)×100％。实验结果如图4所示，由graphpad软件计算得出olaparib处理rec-1细胞的半数抑制浓度（ic50）为55.378.27μm；可见，olaparib可以有效抑制rec-1细胞的增殖，且olaparib对jeko-1细胞生长的抑制呈浓度依赖关系。

实施例5ganetespib处理增加jeko-1细胞对olaparib的敏感性

根据说明书用dmso将ganetespib配制为10mm的储存浓度，后续使用浓度用dmso培养基进行梯度稀释。收集培养状态良好的套细胞淋巴瘤细胞jeko-1，200g离心5min，弃上清，pbs清洗一次。重悬细胞，进行细胞计数，将细胞悬液种于24孔细胞培养皿中，密度为每孔1ml培养基含5×10^４个细胞，种好细胞后，先加vehicle（dmso）或ganetespib15nm处理12h，200g离心5min，弃上清，pbs洗掉药物后，将细胞再次种回24孔板，然后加不同浓度的olaparib（0、6.25、12.5、25、50和100μm）处理60h；同时设置空白对照组。采用mtt法检测细胞增殖，待检测孔加100μl5mg/ml的mtt溶液，于培养箱中孵育1.5h，显微镜下观察有蓝紫色甲瓒结晶，吸弃上清液，每孔加400μldmso溶解结晶，拍匀，最后用酶标仪在550nm波长处测定每孔吸光值，计算细胞的相对存活率，存活率（%）＝(实验组od值-空白对照组od值)/(对照组od值-空白对照组od值)×100％。实验结果如图5所示，由graphpad软件计算得出单药组ic50为26.213.43μm，联合给药组为ic50为8.01×1.47μm；说明ganetespib能增强olaparib对jeko-1的生长抑制作用，ganetespib和olaparib联合应用能显著增强jeko-1细胞对olaparib的敏感性，联合用药后olaparib的灵敏度较单独给药提高了超过3倍。

实施例6ganetespib处理增加rec-1细胞对olaparib的敏感性

根据说明书用dmso将ganetespib配制为10mm的储存浓度，后续使用浓度用dmso培养基进行梯度稀释。收集培养状态良好的套细胞淋巴瘤细胞rec-1，200g离心5min，弃上清，pbs清洗一次。重悬细胞，进行细胞计数，将细胞悬液种于24孔细胞培养皿中，密度为每孔1ml培养基含5×10^４个细胞，种好细胞后，先加vehicle（dmso）或ganetespib20nm处理12h，200g离心5min，弃上清，pbs洗掉药物后，将细胞再次种回24孔板，然后加不同浓度的olaparib（0、5、10、25、50和75μm）处理60h；同时设置空白对照组。采用mtt法检测细胞增殖，待检测孔加100μl5mg/ml的mtt溶液，于培养箱中孵育1.5h，显微镜下观察有蓝紫色甲瓒结晶，吸弃上清液，每孔加400μldmso溶解结晶，拍匀，最后用酶标仪在550nm波长处测定每孔吸光值，计算细胞的相对存活率，存活率（%）＝(实验组od值-空白对照组od值)/(对照组od值-空白对照组od值)×100％。实验结果如图6所示，由graphpad软件计算得出单药组ic50为50.68±10.90μm，联合给药组ic50为7.53×1.49μm。说明ganetespib能增强olaparib对rec-1的生长抑制作用，ganetespib和olaparib联合应用能显著增强套细胞淋巴瘤rec-1细胞的增殖抑制作用，联合用药后olaparib的灵敏度较单独给药提高了约7倍。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

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