一种毛里求斯排草素在制备利胆药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药领域，毛里求斯排草素具有抗氧化、抗炎、提高总胆汁酸分泌量的用途。

背景技术：

金钱草药材为过路黄lysimachchristinaehance的干燥全草，为川渝道地药材，其具有清热解毒、利尿排石、活血散淤的作用。金钱草中化学成分多样，其中黄酮为其主要活性成分。众所周知，药用植物里的黄酮类化合物是一类很好的天然抗氧化剂，能降低氧化应激反应和相关疾病的发病率。同时，其能通过调节促炎分子如肿瘤坏死因子(tnf-α)及炎症过程中产生的一氧化氮(no)的产生抑制炎症过程，减少细胞凋亡及组织损伤。在日常生活中，自由基和活性氧作为人体副产物在细胞代谢过程中不断产生，如果不及时消除，容易导致功能性大分子的氧化损伤，引起很多跟衰老有关的的疾病。并且，炎症过程中产生的no易与自由基如超氧化物结合产生高破坏性的过氧硝酸盐。黄酮类化合物在抗氧化及抗炎作用中起着极其重要的作用。研究表明，金钱草黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎利胆及预防草酸钙结石形成和复发的作用。金钱草对肝胆结石的疗效尤为显著，而该病通常伴有胆道感染及胆汁淤积。研究表明，金钱草利胆排石作用主要是通过降低胆汁中游离胆红素和钙离子的含量，提高总胆汁酸的含量，从而抑制胆红素结石的形成。同时，其能增加胆汁分泌量，松弛胆囊平滑肌从而增加胆囊排空，并能有效抗炎，减少胆道感染。

金钱草黄酮类化合物的抗氧化及抗炎作用对于治疗肝胆结石类病症有明显的辅助作用。但金钱草总黄酮所含的毛里求斯排草素具有抗氧化、抗炎、提高总胆汁酸分泌量的作用或用于制备治疗胆囊炎、胆结石的药物均未见有关报道，具体的毛里求斯排草素的功效也未见有深入研究。

技术实现要素：

申请人在对金钱草药理活性研究过程中，发现金钱草中总黄酮具有抗炎、提高总胆汁酸分泌量效果显著。从中发现及毛里求斯排草素为金钱草总黄酮发挥利胆作用的主要有效成分，申请人将毛里求斯排草素用于制备治疗胆囊炎、胆结石药物的用途。

申请人的进一步实验研究发现将毛里求斯排草素应用于治疗胆囊炎、胆结石疾病具有显著的效果，因此本申请还公开了将毛里求斯排草素用于制备治疗胆囊炎、胆结石疾病药物的用途.

本发明所述用途的药物，可以是毛里求斯排草素与药学上可接受的辅料采用常规的制剂工艺制成特定剂型，剂型不受到限制，只要是毛里求斯排草素可以制成的剂型即可，包括但不限于片剂、胶囊、颗粒剂。本发明所述用途的药物，制剂方法不受到限制，可以是制药领域任何一种可采用的制剂工艺。

本发明所述用途的药物，可以依据其自身特点主要采用口服给药的方法，其制剂剂型可以是片剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊剂、口服液、混悬液等。

发明人进行的药理实验显示，毛里求斯排草素具有显著的具有抗氧化、抗炎、提高总胆汁酸分泌量的作用。因此本发明所述用途的药物临床上应用于治疗和/或预防治疗胆囊炎、胆结石。

附图说明

图1raw246.7细胞形态；a)对照组，b)lps组，c)毛里求斯排草素20μg/ml，d)金钱草总黄酮100μg/ml，e)金钱草总黄酮200μg/ml，f)金钱草总黄酮300μg/ml(×200)

具体实施方式

下述实施例用于说明本发明的实现方式，并不仅限于用下述方法实施。

下述实施例中毛里求斯排草素可以采用常规的提取分离方法从金钱草获得，也可以购买毛里求斯排草素化学试剂。本发明所用的毛里求斯排草素利用金钱草提取分离获得，经检测其纯度为98.3％。

实施例1毛里求斯排草素的制备方法

样品溶液制备：称取金钱草药材粗粉2000g，用8倍量的70％乙醇回流提取，提取3次，每次2h，合并提取液，将提取液减压浓缩至无醇味，取出10ml作为总提取部位，其余部分4℃保存备用。

称取处理好的ab-8大孔树脂1000g，湿法装柱，将加纯水稀释并过滤好的金钱草粗提液(生药浓度5mg/ml)上柱，调节流速为1d/s。吸附完全后，用3bv纯水洗脱，控制流速为6bv/h，再分别用5bv30％(或50％或70％或90％)乙醇洗脱，控制流速为3bv/h，收集乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥，得金钱草30％乙醇部位(i)、50％乙醇部位(ii)、70％乙醇部位(iii)、90％乙醇部位(iv)，将70％乙醇部位(iii)利用硅胶柱色谱分离得到毛里求斯排草素。

实施例2毛里求斯排草素的活性考察1

dpph自由基清除试验：dpph自由基清除实验。取200μl毛里求斯排草素，加入800μldpph甲醇溶液，充分混合后于室温放置60min，在517nm处测定吸光度。以纯水作为空白对照。

还原性实验：取2ml一系列浓度的毛里求斯排草素，用甲醇稀释成溶液后加入2.5ml1％的铁氰化钾溶液，于50℃水浴中反应20min，然后加入2.5ml10％的三氯乙酸，混合液于3000rpm下离心10min，取2.5ml上清液，向其中加入2.5ml纯水与0.5ml0.1％的fecl3溶液，于700nm处测定吸光度。以纯水为空白对照。

no/亚硝酸盐的测定：no的释放量通过亚硝酸盐的含量间接反映，细胞用金钱草总黄酮(300μg/ml)以及毛里求斯排草素(50μg/ml)预先孵育1h，然后加入终浓度为1mg/ml的lps，继续置5％co2培养箱中于37℃孵育24h。取100μl培养基与相同体积的griess试剂混合，于室温孵育10min，采用酶标仪于540nm处测定吸光度。

人总胆汁酸(tba)酶联免疫分析试验：人总胆汁酸(tba)酶联免疫分析试剂盒制备标准品，分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(25μg/ml)。加样将样品加于酶标板孔底部，轻轻摇晃混匀。用封板膜封板后置37℃温育30分钟。将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用，小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。温育、洗涤，每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。每孔加终止液50μl，终止反应。以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(cd值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

实验结果：对金钱草总黄酮和毛里求斯排草素分别进行dpph自由基清除试验、还原性试验及细胞抗炎实验，并计算其ic50值，结果如表1所示。结果表明毛里求斯排草素抗氧化及细胞抗炎能力最强。

表1金钱草总黄酮与毛里求斯排草素抗氧化及抗炎结果

对试验中的小鼠raw246.7巨噬细胞进行观察(图1)，从倒置显微镜中可以看出，与正常对照组相比，lps刺激后变形的细胞明显增加，巨噬细胞原本扁平的外形因lps的刺激使细胞质凸出并向四周蔓延，细胞形态学的改变表明lps刺激导致的炎症模型成功。然而，金钱草极性总黄酮和毛里求斯排草素对lps具有拮抗作用，使细胞变形程度减少。

在人总胆汁酸(tba)酶联免疫分析试验中，空白孔板的胆汁酸浓度为1.59mmol/ml，毛里求斯排草素组胆汁酸浓度为2.09mmol/ml。说明了具有促胆汁酸分泌的作用。

实施例3毛里求斯排草素的活性考察2

雌雄各半的sd大鼠总计50只，适应性喂养一周后，随机分为5组，每组10只。空白对照组灌服蒸馏水，阳性药物对照组灌服中成药消炎利胆片混悬液，实验组灌服毛里求斯排草素混悬液高、中、低3种剂量。每日灌胃一次，持续7天。于第7天，灌胃给药1小时后，进行麻醉并行胆总管引流，分别记录第一、二、三小时总共三个时段的胆汁流量，对不同时段的三组胆汁流量变化进行观察对比。

实验结果：通过对各组胆汁流量的计量观察，对照组和实验组的胆汁流量均比空白组增加，毛里求斯排草素高、种、低3个剂量组与消炎利胆片阳性药物对照组均能增高胆汁分泌量，其中毛里求斯排草素高剂量组增加最显著，且表现了一定的剂量依赖性。

三、结论

本发明通过对毛里求斯排草素的抗氧化试验、抗炎试验、促进胆汁酸分泌实验，结果表明毛里求斯排草素具有较好的抗氧化试验、抗炎试验、促进胆汁酸分泌的效果，对于治疗胆囊炎、胆结石等疾病提供依据。

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