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您当前的位置： 一种诃子总黄酮的超声提取工艺的制作方法
2021-01-08 11:01:40|
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起点商标网 本发明涉及植物黄酮提取的
技术领域：
，具体涉及一种诃子总黄酮的超声提取工艺。
背景技术：
：诃子为使君子科榄仁树属植物诃子的干燥根。中医药对诃子的认识和应用源远流长，早在《金医要略》、《本草纲目》、《药性论》等名著中，就对其性味、功能及治疗有详细描述，而蒙医药文献记载，诃子的蒙药名为“阿如拉”，最早记载于藏医药书《月王药诊》当中，之后唐代宇妥·元丹贡布等编著的《四部医典》及清代伊喜巴拉珠尔的《认药白晶鉴》等经典著作对其都有详细论述。诃子具有涩肠止泻、敛肺止咳、利咽开音的功效，主治久泻久痢、便血脱肛、肺虚喘咳、久嗽不止、咽痛音哑。现代药理学研究表明，诃子中含有三萜类、酚酸类（没食子酰葡萄糖类、没食子酰简单酯类化合物等）、黄酮类、脂肪族化合物以及氨基酸、糖类、矿物质、维生素、酶类等成分。其中，生物总黄酮是指黄酮类化合物，其是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分。所以，从植物中提取总黄酮开发药物十分有必要，但传统的提取总黄酮的方法，如热水提取法、碱性水或碱性稀醇提取法、有机溶剂提取法等或多多少存在提取时间长、有机溶剂消耗大、提取温度高等缺点。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供一种省时、高效、低耗、黄酮类化合物得率得率较高的诃子总黄酮的超声提取工艺，从而克服上述现有技术的不足。本发明的第二个目的是提供的诃子总黄酮的超声提取工艺，能够高效的提取诃子总黄酮，极具应用前景。本发明的第三个目的是提供一种诃子总黄酮提取工艺，能够筛选出诃子总黄酮超声提取工艺的最佳参数，并且与现有技术相比提取率高。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：本发明第一方面提供了一种诃子总黄酮的超声提取工艺，包括以下步骤：（1）确定诃子总黄酮提取工艺的影响因素，针对乙醇体积分数、料液比、超声时间、ph四种影响因素进行单因素实验，以诃子总黄酮提取率为指标，确定每个影响因素的最优值；（2）确定影响诃子总黄酮提取率主次因素的顺序，以每个影响因素的最优值为依据各选出三个水平，通过四因素三水平为条件进行正交实验，以诃子总黄酮提取率为指标，确定影响总黄酮提取率主次因素；（3）分别以筛出的影响因素的最佳工艺参数作为提取参数，进行在不同温度下的诃子总黄酮提取，以诃子总黄酮提取率为指标，确定包含乙醇体积分数、料液比、超声时间、ph、提取温度五种影响因素的最佳提取工艺。进一步，上述工艺还包括绘制标准曲线，用于总黄酮含量的测定的步骤。对于绘制标准曲线的步骤，可以与上述步骤同步进行，或在前在后均可，无顺序限制。优选的是，以芦丁为标准品绘制标准曲线，采用亚硝酸钠-硝酸铝络合分光光度法实验结果绘制标准曲线，其中波长为510nm。对于标准曲线的具体公式无具体限制，能够满足线性要求，符合标准曲线制定标准即可。在本发明一种优选地实施方式中，根据实验结果绘制出芦丁标准曲线，芦丁标准曲线的线性方程为y=0.0846×x-0.0006，r2=0.9993，式中，y为质量浓度，x为吸光值。进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，上所述步骤（2）中对四种影响因素进行单因素实验具体为：以某个影响因素作为自变量，其余影响因素均为确定数值，进行诃子总黄酮提取，以诃子总黄酮提取率为指标，确定该影响因素的最优值。具体的，例如以乙醇体积分数为自变量，其余料液比、超声时间、ph均为确定数值，进行诃子总黄酮提取，以诃子总黄酮提取率为指标，确定乙醇体积分数的最优值。进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，总黄酮提取率（%）=[（c×v×n×10-3）/w]×100%；式中，c为诃子测定样品中总黄酮液浓度（mg/ml），v为提取液体积（ml），n为稀释倍数，w为称取的诃子粗粉质量（g）。在本发明一种优选地实施方式中，诃子总黄酮的超声提取工艺包括以下步骤：（a）诃子粗粉制备：取诃子中药饮片，干燥并粉碎成粗粉，过50-80目筛，阴凉处存放备用；（b）将步骤（a）中获得的诃子粗粉按照诃子粗粉：乙醇溶液的料液比准确称取，混合均匀获得混合液；所述乙醇溶液为ph、体积分数相同和/或不同的乙醇溶液；（c）将（b）中获得的混合液进行超声提取，在不同超声时间、温度下提取获得一级提取液；一级提取液离心或过滤，弃掉沉淀或滤渣，将上清或滤液回收获得二级提取液，即获得总黄酮醇溶性提取物；（d）二级提取液测定吸光值，再根据标准曲线的线性方程，获得吸光值对应的诃子测定样品中总黄酮液浓度c（mg/ml），最后计算诃子总黄酮提取率。优选一级提取液离心的转速为6000g，离心时间为10min进一步，所述乙醇体积分数包括但不限于30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%。优选30-40%，更优选35%。进一步，所述诃子粗粉：乙醇溶液的料液比包括但不限于1g:10ml、1g:15ml、1g:20ml、1g:25ml、1g:30ml、1g:35ml、1g:40ml、1g:45ml、1g:50ml，优选1g：30ml。进一步，所述溶液ph包括但不限于2.03、3、3.63、4、5、5.67，更优选2.03。进一步，所述超声时间包括但不限于10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min，优选25min。优选地，所述超声温度包括但不限于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，更优选50℃。本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：1、本发明提供的诃子总黄酮的超声提取工艺，通过对乙醇体积分数、液料比、超声提取时间、溶液ph和温度工艺参数进行研究，确定了诃子总黄酮超声提取的最佳工艺条件，具有省时、高效、低耗、总黄酮得率高等优点，是一种新型的诃子总黄酮提取工艺，具有良好的应用和发展前景，为更好地提取诃子总黄酮提供一种新的途径和方法。2、本发明提供的诃子总黄酮的超声提取工艺通过对诃子进行乙醇-超声-ph-温度，获得的总黄酮的平均提取率高达8.79mg/g。具体实施方式除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及
技术领域：
的技术人员通常理解的相同的含义。下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。实施例1-8乙醇体积分数变化的单因素实验一种诃子总黄酮超声提取工艺，包括以下步骤：（1）诃子粗粉制备：取诃子中药饮片，干燥并粉碎成粗粉，过50～80目筛，获得诃子粗粉，密闭阴凉处存放备用；（2）取诃子粗粉1g置于离心管中，加入20ml的不同体积分数的乙醇溶液混合摇匀，ph一致，室温条件下，超声30min，获得一级提取液；一级提取液离心或者过滤，弃掉沉淀或者滤渣，将上清或滤液回收获得二级提取液，获得总黄酮醇溶性提取物；（3）二级提取液采用亚硝酸钠-硝酸铝络合分光光度法测定其吸光值，再通过线性方程为y=0.0846×x-0.0006，获得吸光值对应的诃子测定样品中总黄酮液浓度c（mg/ml），最后计算诃子总黄酮提取率。（4）实施例1-8中调整乙醇体积分数，具体详见表1；表1乙醇体积分数变化及黄酮提取率组别乙醇体积分数%总黄酮提取率/%实施例105.19实施例2308.09实施例3408.32实施例4506.70实施例5605.86实施例6706.25实施例7805.64实施例81001.64由表1可知，实施例1-8中原料用量、乙醇溶液加入体积、超声时间和ph同等条件下，乙醇体积分数为40%时诃子总黄酮提取率最高为8.32%。表中。由此确定乙醇体积分数最优值范围为30%、35%、40%。实施例9-13乙醇溶液的加入体积变化的单因素实验一种诃子总黄酮超声提取工艺，包括以下步骤：单因素实验（1）诃子粗粉制备与实施例1中（1）一致；（2）取诃子粗粉1g置于离心管中，加入40%乙醇溶液混合摇匀，ph一致，室温条件下，超声30min，获得一级提取液；一级提取液离心或者过滤，弃掉沉淀或者滤渣，将上清或者滤液回收获得二级提取液；获得总黄酮醇溶性提取物；（3）二级提取液采用亚硝酸钠-硝酸铝络合分光光度法测定其吸光值，再通过线性方程为y=0.0846×x-0.0006，获得吸光值对应的诃子测定样品中总黄酮液浓度c（mg/ml），最后计算诃子总黄酮提取率；（4）实施例9-13中调整40%乙醇溶液的加入体积，具体详见表2。表2乙醇溶液的加入体积变化组别乙醇溶液的加入体积ml总黄酮提取率/%实施例9105.34实施例10206.41实施例11307.26实施例12407.00实施例13506.33由表2可知，实施例9-13中原料用量、乙醇体积分数、超声时间和ph同等条件下，加入体积为30ml时诃子总黄酮提取率最高为7.26%。由此确定加入体积最优值范围为25ml、30ml、35ml。实施例14-18超声时间变化的单因素实验一种诃子总黄酮超声提取工艺，包括以下步骤：单因素实验（1）诃子粗粉制备与实施例1中（1）一致；（2）取诃子粗粉1g置于离心管中，加入20ml的40%乙醇溶液混合摇匀，ph一致，室温条件下，不同超声时间，获得一级提取液；一级提取液离心或者过滤，弃掉沉淀或者滤渣，将上清或者滤液回收获得二级提取液；获得总黄酮醇溶性提取物；（3）二级提取液采用亚硝酸钠-硝酸铝络合分光光度法测定其吸光值，再通过线性方程为y=0.0846×x-0.0006，获得吸光值对应的诃子测定样品中总黄酮液浓度c（mg/ml），最后计算诃子总黄酮提取率；（4）实施例14-18中调整超声时间，具体详见表3。表3不同超声时间组别超声时间min总黄酮提取率/%实施例14106.59实施例15207.01实施例16306.48实施例17405.94实施例18506.15由表3可知，实施例14-18中原料用量、乙醇体积分数、加入体积和ph同等条件下超声时间为20min时诃子总黄酮提取率最高为7.01%。由此确定超声时间最优值范围为15min、20min、25min。实施例19-23溶液ph变化的单因素实验一种诃子总黄酮超声提取工艺，包括以下步骤：单因素实验（1）诃子粗粉制备与实施例1中（1）一致；（2）取诃子粗粉1g置于离心管中，加入20ml的40%乙醇溶液混合摇匀，不同ph柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制，室温条件下，超声时间为20min，获得一级提取液；一级提取液离心或者过滤，弃掉沉淀或者滤渣，将上清或者滤液回收获得二级提取液；获得总黄酮醇溶性提取物；（3）二级提取液采用亚硝酸钠-硝酸铝络合分光光度法测定其吸光值，再通过线性方程为y=0.0846×x-0.0006，获得吸光值对应的诃子测定样品中总黄酮液浓度c（mg/ml），最后计算诃子总黄酮提取率；（4）调整实施例19-23中溶液ph，具体详见表4。表4溶液不同ph组别ph缓冲液的配制总黄酮提取率/%实施例192.03磷酸氢二钠1.24ml+柠檬酸18.67ml8.13实施例202.85磷酸氢二钠5.7ml+柠檬酸14.3mll7.84实施例213.63磷酸氢二钠8.82ml+柠檬酸11.08ml8.27实施例224.45磷酸氢二钠11.15ml+柠檬酸8.85ml6.37实施例235.67磷酸氢二钠13.85ml+柠檬酸6.15ml7.03由表4可知，实施例19-23中原料用量、乙醇体积分数、加入体积和超声时间同等条件下ph为3.36时诃子总黄酮提取率最高为8.27%。由此确定ph最优值范围为2.03、2.85、3.63。实施例24四因素三水平正交实验一种诃子总黄酮超声提取工艺，包括以下步骤：（1）诃子粗粉制备与实施例1中（1）一致；（2）取诃子粗粉1g置于离心管中，加入不同体积的不同体积分数乙醇溶液混合摇匀，不同ph柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制，室温条件下，不同超声时间，获得一级提取液；一级提取液离心或者过滤，弃掉沉淀或者滤渣，将上清或者滤液回收获得二级提取液；获得总黄酮醇溶性提取物；（3）所述（2）中为30%体积分数的乙醇，体积25ml，ph为2.03，超声时间为15min，其中柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制为磷酸氢二钠1.55ml+柠檬酸23.45ml；（4）所述（2）中为30%体积分数的乙醇，体积30ml，ph为2.85，超声时间为20min，其中柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制为磷酸氢二钠8.55ml+柠檬酸21.45ml；（5）所述（2）中为30%体积分数的乙醇，体积35ml，ph为3.63，超声时间为25min，其中柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制为磷酸氢二钠15.44ml+柠檬酸19.56ml；（6）所述（2）中为35%体积分数的乙醇，体积25ml，ph为3.63，超声时间为20min，其中柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制为磷酸氢二钠11.03ml+柠檬酸13.97ml；（7）所述（2）中为35%体积分数的乙醇，体积30ml，ph为2.03，超声时间为25min，其中柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制为磷酸氢二钠1.86ml+柠檬酸28.14ml；（8）所述（2）中为35%体积分数的乙醇，体积35ml，ph为2.85，超声时间为15min，其中柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制为磷酸氢二钠9.97ml+柠檬酸25.03ml；（9）所述（2）中为40%体积分数的乙醇，体积25ml，ph为2.85，超声时间为25min，其中柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制为磷酸氢二钠7.12ml+柠檬酸17.88ml；（10）所述（2）中为40%体积分数的乙醇，体积30ml，ph为3.63，超声时间为15min，其中柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制为磷酸氢二钠13.23ml+柠檬酸16.77ml；（11）所述（2）中为40%体积分数的乙醇，体积35ml，ph为2.03，超声时间为20min，其中柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制为磷酸氢二钠2.17ml+柠檬酸32.83ml；（12）二级提取液采用亚硝酸钠-硝酸铝络合分光光度法测定其吸光值，再通过线性方程为y=0.0846×x-0.0006，获得吸光值对应的诃子测定样品中总黄酮液浓度c（mg/ml），最后计算诃子总黄酮提取率。上述（3）-（11）的正交表见表5，诃子总黄酮提取率结果见表6。表5正交实验因素与水平表6正交实验结果因素乙醇浓度/%料液比/g:ml超声时间/minph实验结果/%实验1a1b1c1d18.98实验2a1b2c2d29.37实验3a1b3c3d38.81实验4a2b1c2d38.08实验5a2b2c3d110.87实验6a2b3c1d29.27实验7a3b1c3d29.13实验8a3b2c1d39.01实验9a3b3c2d19.05均值19.0538.7309.0879.633均值29.4079.7508.8339.257均值39.0639.0439.6038.633极差0.3541.0200.7701.000由表5可知，实施例24中原料用量、乙醇体积分数为35%、加入体积为30ml、超声时间为25min和ph为2.03时诃子总黄酮提取率最高为10.87%。由表6可知，正交试验结果分析中可以得到，料液比、乙醇体积分数、超声时间、ph四个因素对超声提取诃子总黄酮的主次顺序为：诃子总黄酮提取量影响顺序为：b＞d＞c＞a（料液比＞ph＞超声时间＞乙醇浓度），即料液比对提取量的影响最大。最佳提取工艺为b2、d1、c3、a2。实施例25-29超声温度变化的单因素实验一种诃子总黄酮超声提取工艺，包括以下步骤：正交实验（1）所述内容与实施例1中（1）一致；（2）取诃子粗粉1g置于离心管中，加入30ml的35%乙醇溶液混合摇匀，ph为2.03柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制，不用温度条件下，超声时间为25min，获得一级提取液；一级提取液离心或者过滤，弃掉沉淀或者滤渣，将上清或者滤液回收获得二级提取液；获得总黄酮醇溶性提取物；（3）实施例25-29中调整超声温度为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃；（4）二级提取液采用亚硝酸钠-硝酸铝络合分光光度法测定其吸光值，再通过线性方程为y=0.0846×x-0.0006，获得吸光值对应的诃子测定样品中总黄酮液浓度c（mg/ml），最后计算诃子总黄酮提取率。表7实施例25-29的总黄酮提取率组别总黄酮提取率/%实施例257.21实施例268.88实施例279.40实施例288.30实施例2910.15由表7可知，实施例25-29中最佳提取工艺参数不变超声温度为70℃时诃子总黄酮提取率最高为10.15%。但是考虑提取时的安全、有效、经济等综合因素的考虑确定最佳超声温度为50℃。实施例30检验诃子总黄酮超声提取工艺的重现性一种诃子总黄酮超声提取工艺，包括以下步骤：（1）诃子粗粉制备与实施例1中（1）一致；（2）取诃子粗粉1g置于离心管中，加入30ml的35%乙醇溶液混合摇匀，ph为2.03柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制，超声温度为50℃，超声时间为25min，获得一级提取液；一级提取液离心或者过滤，弃掉沉淀或者滤渣，将上清或者滤液回收获得二级提取液；获得总黄酮醇溶性提取物；（3）重复步骤2的工艺8次，检测最佳工艺重现性。（4）二级提取液采用亚硝酸钠-硝酸铝络合分光光度法测定其吸光值，再通过线性方程为y=0.0846×x-0.0006，获得吸光值对应的诃子测定样品中总黄酮液浓度c（mg/ml），最后计算诃子总黄酮提取率，结果见表8。表8实施例30的总黄酮提取率由表8可知，实施例30中8次测得平均诃子总黄酮提取率为10.31%，rsd=7.61%（n=8）。由此确定超声提取诃子总黄酮工艺最佳参数是乙醇体积分数为35%、加入体积为30ml、超声时间为25min、ph为2.03和超声温度为50℃。对比例1一种诃子总黄酮的有机溶剂浸泡方法，具体步骤与实施例30基本相同，区别在于：所述超声温度改为浸泡温度，其中浸泡温度为室温；超声时间改为浸泡时间，其中浸泡时间为1080min。对比例2一种诃子总黄酮的有机溶剂煎煮方法，具体步骤与实施例30基本相同，区别在于：所述超声温度改为煎煮温度，其中煎煮温度为70℃；超声时间改为煎煮时间，其中煎煮时间为60min。表9不同提取方法对诃子总黄酮提取的影响由表9可知，对诃子总黄酮提取率，实施例30＞对比例2＞对比例1（超声乙醇提取＞煎煮乙醇提取＞浸泡乙醇提取）。超声乙醇提取的提取率高于煎煮乙醇提取和浸泡乙醇提取的提取率，且耗时最短，提取所需温度适中，其他条件一致。综合考虑用超声乙醇提取最为合适。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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技术领域：
，具体涉及一种诃子总黄酮的超声提取工艺。
背景技术：
：诃子为使君子科榄仁树属植物诃子的干燥根。中医药对诃子的认识和应用源远流长，早在《金医要略》、《本草纲目》、《药性论》等名著中，就对其性味、功能及治疗有详细描述，而蒙医药文献记载，诃子的蒙药名为“阿如拉”，最早记载于藏医药书《月王药诊》当中，之后唐代宇妥·元丹贡布等编著的《四部医典》及清代伊喜巴拉珠尔的《认药白晶鉴》等经典著作对其都有详细论述。诃子具有涩肠止泻、敛肺止咳、利咽开音的功效，主治久泻久痢、便血脱肛、肺虚喘咳、久嗽不止、咽痛音哑。现代药理学研究表明，诃子中含有三萜类、酚酸类（没食子酰葡萄糖类、没食子酰简单酯类化合物等）、黄酮类、脂肪族化合物以及氨基酸、糖类、矿物质、维生素、酶类等成分。其中，生物总黄酮是指黄酮类化合物，其是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分。所以，从植物中提取总黄酮开发药物十分有必要，但传统的提取总黄酮的方法，如热水提取法、碱性水或碱性稀醇提取法、有机溶剂提取法等或多多少存在提取时间长、有机溶剂消耗大、提取温度高等缺点。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供一种省时、高效、低耗、黄酮类化合物得率得率较高的诃子总黄酮的超声提取工艺，从而克服上述现有技术的不足。本发明的第二个目的是提供的诃子总黄酮的超声提取工艺，能够高效的提取诃子总黄酮，极具应用前景。本发明的第三个目的是提供一种诃子总黄酮提取工艺，能够筛选出诃子总黄酮超声提取工艺的最佳参数，并且与现有技术相比提取率高。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：本发明第一方面提供了一种诃子总黄酮的超声提取工艺，包括以下步骤：（1）确定诃子总黄酮提取工艺的影响因素，针对乙醇体积分数、料液比、超声时间、ph四种影响因素进行单因素实验，以诃子总黄酮提取率为指标，确定每个影响因素的最优值；（2）确定影响诃子总黄酮提取率主次因素的顺序，以每个影响因素的最优值为依据各选出三个水平，通过四因素三水平为条件进行正交实验，以诃子总黄酮提取率为指标，确定影响总黄酮提取率主次因素；（3）分别以筛出的影响因素的最佳工艺参数作为提取参数，进行在不同温度下的诃子总黄酮提取，以诃子总黄酮提取率为指标，确定包含乙醇体积分数、料液比、超声时间、ph、提取温度五种影响因素的最佳提取工艺。进一步，上述工艺还包括绘制标准曲线，用于总黄酮含量的测定的步骤。对于绘制标准曲线的步骤，可以与上述步骤同步进行，或在前在后均可，无顺序限制。优选的是，以芦丁为标准品绘制标准曲线，采用亚硝酸钠-硝酸铝络合分光光度法实验结果绘制标准曲线，其中波长为510nm。对于标准曲线的具体公式无具体限制，能够满足线性要求，符合标准曲线制定标准即可。在本发明一种优选地实施方式中，根据实验结果绘制出芦丁标准曲线，芦丁标准曲线的线性方程为y=0.0846×x-0.0006，r2=0.9993，式中，y为质量浓度，x为吸光值。进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，上所述步骤（2）中对四种影响因素进行单因素实验具体为：以某个影响因素作为自变量，其余影响因素均为确定数值，进行诃子总黄酮提取，以诃子总黄酮提取率为指标，确定该影响因素的最优值。具体的，例如以乙醇体积分数为自变量，其余料液比、超声时间、ph均为确定数值，进行诃子总黄酮提取，以诃子总黄酮提取率为指标，确定乙醇体积分数的最优值。进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，总黄酮提取率（%）=[（c×v×n×10-3）/w]×100%；式中，c为诃子测定样品中总黄酮液浓度（mg/ml），v为提取液体积（ml），n为稀释倍数，w为称取的诃子粗粉质量（g）。在本发明一种优选地实施方式中，诃子总黄酮的超声提取工艺包括以下步骤：（a）诃子粗粉制备：取诃子中药饮片，干燥并粉碎成粗粉，过50-80目筛，阴凉处存放备用；（b）将步骤（a）中获得的诃子粗粉按照诃子粗粉：乙醇溶液的料液比准确称取，混合均匀获得混合液；所述乙醇溶液为ph、体积分数相同和/或不同的乙醇溶液；（c）将（b）中获得的混合液进行超声提取，在不同超声时间、温度下提取获得一级提取液；一级提取液离心或过滤，弃掉沉淀或滤渣，将上清或滤液回收获得二级提取液，即获得总黄酮醇溶性提取物；（d）二级提取液测定吸光值，再根据标准曲线的线性方程，获得吸光值对应的诃子测定样品中总黄酮液浓度c（mg/ml），最后计算诃子总黄酮提取率。优选一级提取液离心的转速为6000g，离心时间为10min进一步，所述乙醇体积分数包括但不限于30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%。优选30-40%，更优选35%。进一步，所述诃子粗粉：乙醇溶液的料液比包括但不限于1g:10ml、1g:15ml、1g:20ml、1g:25ml、1g:30ml、1g:35ml、1g:40ml、1g:45ml、1g:50ml，优选1g：30ml。进一步，所述溶液ph包括但不限于2.03、3、3.63、4、5、5.67，更优选2.03。进一步，所述超声时间包括但不限于10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min，优选25min。优选地，所述超声温度包括但不限于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，更优选50℃。本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：1、本发明提供的诃子总黄酮的超声提取工艺，通过对乙醇体积分数、液料比、超声提取时间、溶液ph和温度工艺参数进行研究，确定了诃子总黄酮超声提取的最佳工艺条件，具有省时、高效、低耗、总黄酮得率高等优点，是一种新型的诃子总黄酮提取工艺，具有良好的应用和发展前景，为更好地提取诃子总黄酮提供一种新的途径和方法。2、本发明提供的诃子总黄酮的超声提取工艺通过对诃子进行乙醇-超声-ph-温度，获得的总黄酮的平均提取率高达8.79mg/g。具体实施方式除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及
技术领域：
的技术人员通常理解的相同的含义。下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。实施例1-8乙醇体积分数变化的单因素实验一种诃子总黄酮超声提取工艺，包括以下步骤：（1）诃子粗粉制备：取诃子中药饮片，干燥并粉碎成粗粉，过50～80目筛，获得诃子粗粉，密闭阴凉处存放备用；（2）取诃子粗粉1g置于离心管中，加入20ml的不同体积分数的乙醇溶液混合摇匀，ph一致，室温条件下，超声30min，获得一级提取液；一级提取液离心或者过滤，弃掉沉淀或者滤渣，将上清或滤液回收获得二级提取液，获得总黄酮醇溶性提取物；（3）二级提取液采用亚硝酸钠-硝酸铝络合分光光度法测定其吸光值，再通过线性方程为y=0.0846×x-0.0006，获得吸光值对应的诃子测定样品中总黄酮液浓度c（mg/ml），最后计算诃子总黄酮提取率。（4）实施例1-8中调整乙醇体积分数，具体详见表1；表1乙醇体积分数变化及黄酮提取率组别乙醇体积分数%总黄酮提取率/%实施例105.19实施例2308.09实施例3408.32实施例4506.70实施例5605.86实施例6706.25实施例7805.64实施例81001.64由表1可知，实施例1-8中原料用量、乙醇溶液加入体积、超声时间和ph同等条件下，乙醇体积分数为40%时诃子总黄酮提取率最高为8.32%。表中。由此确定乙醇体积分数最优值范围为30%、35%、40%。实施例9-13乙醇溶液的加入体积变化的单因素实验一种诃子总黄酮超声提取工艺，包括以下步骤：单因素实验（1）诃子粗粉制备与实施例1中（1）一致；（2）取诃子粗粉1g置于离心管中，加入40%乙醇溶液混合摇匀，ph一致，室温条件下，超声30min，获得一级提取液；一级提取液离心或者过滤，弃掉沉淀或者滤渣，将上清或者滤液回收获得二级提取液；获得总黄酮醇溶性提取物；（3）二级提取液采用亚硝酸钠-硝酸铝络合分光光度法测定其吸光值，再通过线性方程为y=0.0846×x-0.0006，获得吸光值对应的诃子测定样品中总黄酮液浓度c（mg/ml），最后计算诃子总黄酮提取率；（4）实施例9-13中调整40%乙醇溶液的加入体积，具体详见表2。表2乙醇溶液的加入体积变化组别乙醇溶液的加入体积ml总黄酮提取率/%实施例9105.34实施例10206.41实施例11307.26实施例12407.00实施例13506.33由表2可知，实施例9-13中原料用量、乙醇体积分数、超声时间和ph同等条件下，加入体积为30ml时诃子总黄酮提取率最高为7.26%。由此确定加入体积最优值范围为25ml、30ml、35ml。实施例14-18超声时间变化的单因素实验一种诃子总黄酮超声提取工艺，包括以下步骤：单因素实验（1）诃子粗粉制备与实施例1中（1）一致；（2）取诃子粗粉1g置于离心管中，加入20ml的40%乙醇溶液混合摇匀，ph一致，室温条件下，不同超声时间，获得一级提取液；一级提取液离心或者过滤，弃掉沉淀或者滤渣，将上清或者滤液回收获得二级提取液；获得总黄酮醇溶性提取物；（3）二级提取液采用亚硝酸钠-硝酸铝络合分光光度法测定其吸光值，再通过线性方程为y=0.0846×x-0.0006，获得吸光值对应的诃子测定样品中总黄酮液浓度c（mg/ml），最后计算诃子总黄酮提取率；（4）实施例14-18中调整超声时间，具体详见表3。表3不同超声时间组别超声时间min总黄酮提取率/%实施例14106.59实施例15207.01实施例16306.48实施例17405.94实施例18506.15由表3可知，实施例14-18中原料用量、乙醇体积分数、加入体积和ph同等条件下超声时间为20min时诃子总黄酮提取率最高为7.01%。由此确定超声时间最优值范围为15min、20min、25min。实施例19-23溶液ph变化的单因素实验一种诃子总黄酮超声提取工艺，包括以下步骤：单因素实验（1）诃子粗粉制备与实施例1中（1）一致；（2）取诃子粗粉1g置于离心管中，加入20ml的40%乙醇溶液混合摇匀，不同ph柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制，室温条件下，超声时间为20min，获得一级提取液；一级提取液离心或者过滤，弃掉沉淀或者滤渣，将上清或者滤液回收获得二级提取液；获得总黄酮醇溶性提取物；（3）二级提取液采用亚硝酸钠-硝酸铝络合分光光度法测定其吸光值，再通过线性方程为y=0.0846×x-0.0006，获得吸光值对应的诃子测定样品中总黄酮液浓度c（mg/ml），最后计算诃子总黄酮提取率；（4）调整实施例19-23中溶液ph，具体详见表4。表4溶液不同ph组别ph缓冲液的配制总黄酮提取率/%实施例192.03磷酸氢二钠1.24ml+柠檬酸18.67ml8.13实施例202.85磷酸氢二钠5.7ml+柠檬酸14.3mll7.84实施例213.63磷酸氢二钠8.82ml+柠檬酸11.08ml8.27实施例224.45磷酸氢二钠11.15ml+柠檬酸8.85ml6.37实施例235.67磷酸氢二钠13.85ml+柠檬酸6.15ml7.03由表4可知，实施例19-23中原料用量、乙醇体积分数、加入体积和超声时间同等条件下ph为3.36时诃子总黄酮提取率最高为8.27%。由此确定ph最优值范围为2.03、2.85、3.63。实施例24四因素三水平正交实验一种诃子总黄酮超声提取工艺，包括以下步骤：（1）诃子粗粉制备与实施例1中（1）一致；（2）取诃子粗粉1g置于离心管中，加入不同体积的不同体积分数乙醇溶液混合摇匀，不同ph柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制，室温条件下，不同超声时间，获得一级提取液；一级提取液离心或者过滤，弃掉沉淀或者滤渣，将上清或者滤液回收获得二级提取液；获得总黄酮醇溶性提取物；（3）所述（2）中为30%体积分数的乙醇，体积25ml，ph为2.03，超声时间为15min，其中柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制为磷酸氢二钠1.55ml+柠檬酸23.45ml；（4）所述（2）中为30%体积分数的乙醇，体积30ml，ph为2.85，超声时间为20min，其中柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制为磷酸氢二钠8.55ml+柠檬酸21.45ml；（5）所述（2）中为30%体积分数的乙醇，体积35ml，ph为3.63，超声时间为25min，其中柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制为磷酸氢二钠15.44ml+柠檬酸19.56ml；（6）所述（2）中为35%体积分数的乙醇，体积25ml，ph为3.63，超声时间为20min，其中柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制为磷酸氢二钠11.03ml+柠檬酸13.97ml；（7）所述（2）中为35%体积分数的乙醇，体积30ml，ph为2.03，超声时间为25min，其中柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制为磷酸氢二钠1.86ml+柠檬酸28.14ml；（8）所述（2）中为35%体积分数的乙醇，体积35ml，ph为2.85，超声时间为15min，其中柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制为磷酸氢二钠9.97ml+柠檬酸25.03ml；（9）所述（2）中为40%体积分数的乙醇，体积25ml，ph为2.85，超声时间为25min，其中柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制为磷酸氢二钠7.12ml+柠檬酸17.88ml；（10）所述（2）中为40%体积分数的乙醇，体积30ml，ph为3.63，超声时间为15min，其中柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制为磷酸氢二钠13.23ml+柠檬酸16.77ml；（11）所述（2）中为40%体积分数的乙醇，体积35ml，ph为2.03，超声时间为20min，其中柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制为磷酸氢二钠2.17ml+柠檬酸32.83ml；（12）二级提取液采用亚硝酸钠-硝酸铝络合分光光度法测定其吸光值，再通过线性方程为y=0.0846×x-0.0006，获得吸光值对应的诃子测定样品中总黄酮液浓度c（mg/ml），最后计算诃子总黄酮提取率。上述（3）-（11）的正交表见表5，诃子总黄酮提取率结果见表6。表5正交实验因素与水平表6正交实验结果因素乙醇浓度/%料液比/g:ml超声时间/minph实验结果/%实验1a1b1c1d18.98实验2a1b2c2d29.37实验3a1b3c3d38.81实验4a2b1c2d38.08实验5a2b2c3d110.87实验6a2b3c1d29.27实验7a3b1c3d29.13实验8a3b2c1d39.01实验9a3b3c2d19.05均值19.0538.7309.0879.633均值29.4079.7508.8339.257均值39.0639.0439.6038.633极差0.3541.0200.7701.000由表5可知，实施例24中原料用量、乙醇体积分数为35%、加入体积为30ml、超声时间为25min和ph为2.03时诃子总黄酮提取率最高为10.87%。由表6可知，正交试验结果分析中可以得到，料液比、乙醇体积分数、超声时间、ph四个因素对超声提取诃子总黄酮的主次顺序为：诃子总黄酮提取量影响顺序为：b＞d＞c＞a（料液比＞ph＞超声时间＞乙醇浓度），即料液比对提取量的影响最大。最佳提取工艺为b2、d1、c3、a2。实施例25-29超声温度变化的单因素实验一种诃子总黄酮超声提取工艺，包括以下步骤：正交实验（1）所述内容与实施例1中（1）一致；（2）取诃子粗粉1g置于离心管中，加入30ml的35%乙醇溶液混合摇匀，ph为2.03柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制，不用温度条件下，超声时间为25min，获得一级提取液；一级提取液离心或者过滤，弃掉沉淀或者滤渣，将上清或者滤液回收获得二级提取液；获得总黄酮醇溶性提取物；（3）实施例25-29中调整超声温度为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃；（4）二级提取液采用亚硝酸钠-硝酸铝络合分光光度法测定其吸光值，再通过线性方程为y=0.0846×x-0.0006，获得吸光值对应的诃子测定样品中总黄酮液浓度c（mg/ml），最后计算诃子总黄酮提取率。表7实施例25-29的总黄酮提取率组别总黄酮提取率/%实施例257.21实施例268.88实施例279.40实施例288.30实施例2910.15由表7可知，实施例25-29中最佳提取工艺参数不变超声温度为70℃时诃子总黄酮提取率最高为10.15%。但是考虑提取时的安全、有效、经济等综合因素的考虑确定最佳超声温度为50℃。实施例30检验诃子总黄酮超声提取工艺的重现性一种诃子总黄酮超声提取工艺，包括以下步骤：（1）诃子粗粉制备与实施例1中（1）一致；（2）取诃子粗粉1g置于离心管中，加入30ml的35%乙醇溶液混合摇匀，ph为2.03柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制，超声温度为50℃，超声时间为25min，获得一级提取液；一级提取液离心或者过滤，弃掉沉淀或者滤渣，将上清或者滤液回收获得二级提取液；获得总黄酮醇溶性提取物；（3）重复步骤2的工艺8次，检测最佳工艺重现性。（4）二级提取液采用亚硝酸钠-硝酸铝络合分光光度法测定其吸光值，再通过线性方程为y=0.0846×x-0.0006，获得吸光值对应的诃子测定样品中总黄酮液浓度c（mg/ml），最后计算诃子总黄酮提取率，结果见表8。表8实施例30的总黄酮提取率由表8可知，实施例30中8次测得平均诃子总黄酮提取率为10.31%，rsd=7.61%（n=8）。由此确定超声提取诃子总黄酮工艺最佳参数是乙醇体积分数为35%、加入体积为30ml、超声时间为25min、ph为2.03和超声温度为50℃。对比例1一种诃子总黄酮的有机溶剂浸泡方法，具体步骤与实施例30基本相同，区别在于：所述超声温度改为浸泡温度，其中浸泡温度为室温；超声时间改为浸泡时间，其中浸泡时间为1080min。对比例2一种诃子总黄酮的有机溶剂煎煮方法，具体步骤与实施例30基本相同，区别在于：所述超声温度改为煎煮温度，其中煎煮温度为70℃；超声时间改为煎煮时间，其中煎煮时间为60min。表9不同提取方法对诃子总黄酮提取的影响由表9可知，对诃子总黄酮提取率，实施例30＞对比例2＞对比例1（超声乙醇提取＞煎煮乙醇提取＞浸泡乙醇提取）。超声乙醇提取的提取率高于煎煮乙醇提取和浸泡乙醇提取的提取率，且耗时最短，提取所需温度适中，其他条件一致。综合考虑用超声乙醇提取最为合适。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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