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您当前的位置： 中药复方颗粒剂及其制备方法与流程
2021-01-08 11:01:48|
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起点商标网 本发明涉及一种中药复方颗粒剂及其制备方法。
背景技术：
：地中海贫血是先天性基因缺陷致使人体不能正常合成血红蛋白珠蛋白引起的一种遗传性血液病，也叫珠蛋白合成障碍性贫血，是世界范围内发病率最高、危害最大的单基因遗传病，属难治性遗传性溶血性贫血，因最初在地中海地区发现而得名。其发病机制是位于11号、16号染色体调控珠蛋白合成的基因突变或缺失，造成大量无效红细胞生成，最终导致溶血性贫血，后续累积影响到心、脾等人体重要器官的功能。地中海贫血有明显的地中海贫血貌：面色萎黄，头颅方大，颧骨突起，鼻梁凹陷，眼睑浮肿，肤色如黄土，唇舌色淡，肝脾肿大。据who秘书处报告，全世界约有1亿多人携带地中海贫血基因，每年约有30万婴儿在出生时患有地中海贫血综合征。我国是地中海贫血的高发国。地中海贫血在我国危害较大的主要有两种，即α-和β-型两种，南方各省发病率较高。仅广西、广东、海南三省地中海贫血基因携带者达2000多万。该病多为婴幼儿、少年发病，表现为虚劳、眩晕、心悸、黄疸、腹中瘢积，生长发育迟缓等。患者症见严重贫血、地贫貌。血象检查有红细胞低色性贫血，可出现靶形细胞，网织细胞增加，核红细胞、红细胞渗透压减低。β地中海贫血症患者，除上述特征外，其临床上表现出：腰膝酸软、眩晕、心悸、气短、乏力、脱发耳鸣、面色、唇、甲苍白，手足心热，盗汗等症状。在国际上，地中海贫血的治疗原则仍以输血和去铁治疗为主。除轻型地中海贫血临床上不要求特殊治疗外(需适当补充叶酸和维生素e)，中间型α和β地中海贫血一般采用红细胞少量输注法，重型β地中海贫血则采用高剂量输血或输注浓缩红细胞联合除铁剂治疗是基本的治疗措施，而且应从早期开始给予中、高剂量输血，以使患儿生长发育接近正常，减少肠道吸收铁，抑制脾肿大，防止骨骼病变。其方法是：先反复输注浓缩红细胞，使患儿血红蛋白含量达120～150g/l；然后每隔2～4周输注浓缩红细胞10～15ml/kg，使血红蛋白含量维持在90～105g/l以上。但本法容易导致含铁血黄素沉着症，故应同时给予铁螯合剂(注射用甲磺酸去铁胺、去铁酮片等)治疗，可增加铁从尿液和粪便排出，但不能阻止胃肠道对铁的吸收，而且长期使用可致白内障和骨发育障碍，剂量过大可引起视力和听觉减退。但由于地中海贫血患者大量溶血而引起巨脾、功能亢进，加重贫血和铁沉积而导致其他脏器损伤，这种治疗最多只能维持十几年。脾切除手术治疗：脾切除对α地中海贫血和中间型β地中海贫血的疗效较好，对重型β地中海贫血效果差。脾切除可致免疫功能减弱，后遗症非常严重。且应在5～6岁以后施行并严格掌握适应证。骨髓和干细胞移植：异基因造血干细胞移植是目前能根治重型β地中海贫血的方法。如有hla相配的造血干细胞供者，应作为治疗重型β地中海贫血的首选方法。但目前受髓源和配型限制还很难普及，且费用高昂。基因治疗：基因治疗可增加γ基因表达或减少a基因表达，以改善β地中海贫血的症状。虽然是未来发展的方向，但因同源重组率未解决，临床应用尚待时日。此外，国内外有人尝试用羟基脲、5-氮杂胞苷、阿糖胞苷、马利兰、异烟肼等几种化疗药进行探索性治疗，但由于这些药物疗效不确切，且有极强的副作用，其临床应用受到限制。因此，对地中海贫血的有效治疗仍是世界性难题，并且至今几乎没有有效治疗地中海贫血的中、西药物。cn200610078866.x公开了一种治疗地中海贫血的药物及其制备工艺，然而该工艺路线复杂，最终得到的膏剂含有何首乌提取物和有机溶剂残留物，长期服用不安全，而且在乙醇提取过程中使用的有机溶剂容易发生爆炸的极大安全生产隐患；另外，当归和砂仁仅以挥发油形式提取出了部分类型有效成分，有些类型的有效成分根本未进入终产品并且有些有效成分只有一部分进入终产品，影响最终药物药效发挥，最终得到的膏剂重量大，不易储存和运输，容易腐败，服用也不方便；此外，该工艺还需要复杂的挥发油包合、干燥步骤，挥发油包合物在干燥过程中损失较大，同时也增加了生产成本。因此，仍然需要一种改进的用于治疗地中海贫血的药物及其制备工艺。技术实现要素：为了克服现有技术的问题，本发明的一个目的是提供一种中药复方颗粒剂，该中药复方颗粒剂可以提供患者良好的用药顺应性，携带、贮藏、运输、服用方便，更耐储存，用药更安全，毒副作用更小，同时具有良好的地中海贫血症治疗功效。本发明的另一个目的是提供一种用于制备中药复方颗粒剂的方法，该方法能够避免容易发生有机溶剂爆炸的安全生产隐患，降低生产成本，并且能够以全成分提取各中药组分的有效成分，通过该方法能够制备可以提供患者良好的用药顺应性，携带、贮藏、运输、服用方便，更耐储存，用药更安全，毒副作用更小，同时具有良好的地中海贫血症治疗功效的中药复方颗粒剂。为达到本发明的上述目的，本发明的一个方面提供一种中药复方颗粒剂，所述中药复方颗粒剂由辅料和作为活性成分的中药提取物制成，所述辅料含有填充剂，所述中药提取物是从由以下重量份的组分组成的中药材组合物提取的全成分提取物：5～8份山萸肉；3～5份熟地黄；2～5份盐补骨脂；2～4份炙黄芪；2～4份当归；0.5～3份阿胶；2～4份鸡血藤；2～4份党参；3～5份醋鳖甲；以及0.5～2份砂仁。根据本发明的中药复方颗粒剂，进一步地，所述中药材组合物由以下重量份的组分组成：6份山萸肉；4份熟地黄；3份盐补骨脂；3份炙黄芪；3份当归；1份阿胶；3份鸡血藤；3份党参；4份醋鳖甲；以及1份砂仁。根据本发明的中药复方颗粒剂，进一步地，基于所述中药复方颗粒剂的总重量，所述填充剂的量为10～70重量％。根据本发明的中药复方颗粒剂，进一步地，所述填充剂选自蔗糖、可溶性淀粉或它们的组合。根据本发明的中药复方颗粒剂，进一步地，所述辅料还含有矫味剂，并且基于所述中药复方颗粒剂的总重量，所述矫味剂的量为0.1～10重量％。本发明的另一个方面提供一种用于制备上面任一项所述的中药复方颗粒剂的方法，所述方法包括以下步骤：将砂仁进行水蒸气蒸馏并且收集挥发油和蒸馏后的水溶液；将山萸肉、熟地黄、盐补骨脂、炙黄芪、当归、党参、鸡血藤和醋鳖甲的预混料用水煎煮提取以获得水提取液；将所述蒸馏后的水溶液与所述水提取液混合并浓缩为稠膏；将所述稠膏进行干燥以获得干膏；将阿胶和所述干膏进行研磨并且加入含有填充剂的辅料进行干法混合以获得干混物；将所述干混物进行干法制粒以获得半成品颗粒；将所述半成品颗粒进行整粒；将所述挥发油喷入整粒后的半成品颗粒中并进行密闭闷润以获得所述中药复方颗粒剂。根据本发明的方法，进一步地，所述方法还包括将在整粒后移除的半成品颗粒重新进行干法制粒的步骤。根据本发明的方法，进一步地，将所述蒸馏后的水溶液与所述水提取液混合并浓缩为稠膏的步骤在40～100℃的温度和减压条件下进行。根据本发明的方法，进一步地，将所述稠膏进行干燥以获得干膏的步骤在40～100℃的温度和减压条件下进行。根据本发明的方法，进一步地，所述方法还包括将整粒后的半成品颗粒进行干燥使得颗粒水分不超过13重量％的步骤。有益效果根据本发明的方法工艺路线简单，不采用乙醇等有机溶剂提取工艺，因无需使用有机溶剂，从而避免容易发生有机溶剂爆炸的安全生产隐患，降低成本，无需复杂的砂仁挥发油包合工艺，进一步降低成本，并且砂仁采用全成分蒸馏提取工艺提取其全成分(包含挥发油和蒸馏水溶液)，而当归采用水煎煮工艺提取其全成分，以全成分进入制剂终产品，药效发挥更好，更符合中医汤剂的临床效果；而且，根据本发明的方法采用干法制粒工艺，所获得的中药复方制剂为颗粒剂，患者携带、贮藏、运输、服用方便，顺应性好，载药量高，更耐储存，不易腐败，不含具有肝毒性的何首乌提取物以及有机溶剂残留物，用药更安全，毒副作用更小。此外，进一步结合采用有效成分更易溶出和补肾作用更强的盐补骨脂以及有效成分更易溶出和软坚散结作用更强的醋鳖甲，使得本中药复方颗粒剂滋阴补肾，益髓生血，补气健脾之功效有增无减，适用于治疗α-和β-地中海贫血症。动物毒性实验表明，本中药复方颗粒剂具备更优的安全性和更低的毒副作用，其最大给药量可达162.36g生药/kg，相当于临床用量的104.75倍；并且在9～36g/kg/d剂量范围内给药6个月未见药物延迟性毒性反应，表明颗粒剂在sd大鼠水平的安全使用剂量至少在36g/kg以上。本中药复方颗粒剂对小鼠骨髓早期造血祖细胞增殖分化影响研究结果表明，各剂量组均能升高受3.5gy60co-γ射线照射致小鼠肾虚髓损模型血液中外周血白细胞数，促进cfu-gm、cfu-e、cfu-meg增殖，升高小鼠骨髓中cd34+细胞数，其中高剂量组对外周血白细胞作用显著，高、中剂量组对骨髓造血干/祖细胞作用显著，低剂量组对0d34+细胞作用显著。本中药复方颗粒剂防治60co-γ射线诱导大鼠再生障碍性贫血的药效学研究结果表明，其对60co-γ射线诱导大鼠再生障碍性贫血疗效肯定。具体实施方式根据本发明的中药复方颗粒剂由辅料和作为活性成分的中药提取物制成，所述辅料含有填充剂，所述中药提取物是从由以下重量份的组分组成的中药材组合物提取的全成分提取物：5～8份山萸肉；3～5份熟地黄；2～5份盐补骨脂；2～4份炙黄芪；2～4份当归；0.5～3份阿胶；2～4份鸡血藤；2～4份党参；3～5份醋鳖甲；以及0.5～2份砂仁。本中药制剂以山萸肉为君，滋阴补肾，意在补肾中真阴(真精)使真阴得养，髓海充盈，血有生源，故能益髓生精化血。熟地黄、炙黄芪、党参、当归、盐补骨脂、阿胶为臣药。熟地黄、盐补骨脂，协助君药生精化血，加强补肾之功，又盐补骨脂滋补肾阳，生发阳气，相对补骨脂而言，有效成分更易溶出，补肾作用更强。炙黄芪补中益气，阿胶滋阴补血，共奏益气补血之功。补肾药是从根本上治疗地中海贫血，可谓治本，而补血药以治标，标本同治相得益彰。本病肾虚而温养脾土不力，脾主气，气帅血，脾虚则气弱，不能帅血运行，致血滞为瘀，发为瘢积。炙黄芪，党参补气，气为血帅，气行则血行。鸡血藤、醋鳖甲为佐，鸡血藤、醋鳖甲滋阴养血，既软坚散结，消散腹中瘢积，其中醋鳖甲相对鳖甲而言，有效成分更易溶出，软坚散结作用更强。使药砂仁，消减养阴补血药之滋腻，使该药久服不碍脾胃。本中药制剂君、臣、佐、使四者合用，共奏滋阴补肾、益髓生血、补气健脾。既治本，又治标，既治主病，又治兼症，与地中海贫血之病因，病机，辨证论治非常贴合。在本发明中，术语“全成分提取物”是指在提取时中药材组合物各组分的全部有效成分均被提取出来并且进入最终的中药复方颗粒剂中。在根据本发明的中药复方颗粒剂中，优选地，所述中药材组合物由以下重量份的组分组成：6份山萸肉；4份熟地黄；3份盐补骨脂；3份炙黄芪；3份当归；1份阿胶；3份鸡血藤；3份党参；4份醋鳖甲；以及1份砂仁。根据本发明的中药复方颗粒剂含有辅料。所述辅料应当含有填充剂。在一些更具体的实施方案中，除填充剂之外，所述辅料还可以含有矫味剂。所述填充剂可以选自蔗糖、可溶性淀粉或它们的组合，矫味剂可以选自甜菊素等。当中药复方颗粒剂含有填充剂时，基于中药复方颗粒剂的总重量，填充剂的量可以为10～70重量％。当中药复方颗粒剂含有矫味剂时，基于中药复方颗粒剂的总重量，矫味剂的量可以为0.1～10重量％。上述中药复方颗粒剂通过根据本发明的中药复方颗粒剂的制备方法制备而成。所述方法可以包括以下步骤：将砂仁进行水蒸气蒸馏并且收集挥发油和蒸馏后的水溶液；将山萸肉、熟地黄、盐补骨脂、炙黄芪、当归、党参、鸡血藤和醋鳖甲的预混料用水煎煮提取以获得水提取液；将所述蒸馏后的水溶液与所述水提取液混合并浓缩为稠膏；将所述稠膏进行干燥以获得干膏；将阿胶和所述干膏进行研磨并且加入含有填充剂的辅料进行干法混合以获得干混物；将所述干混物进行干法制粒以获得半成品颗粒；将所述半成品颗粒进行整粒；将所述挥发油喷入整粒后的半成品颗粒中并进行密闭闷润以获得所述中药复方颗粒剂。在根据本发明的方法中，可以将砂仁进行水蒸气蒸馏并且收集挥发油和蒸馏后的水溶液。具体地，可以将砂仁投入挥发油提取罐中，加水，加热，进行水蒸气蒸馏，收集挥发油(密闭)，蒸馏后的水溶液可以另器收集，通过离心或过滤进行除杂澄清处理。再将砂仁投入挥发油提取罐中之前，可以使用研磨机或粉碎机将砂仁捣碎，加入的水可以为砂仁的6～10倍量。可以在蒸馏之前加水浸泡砂仁0～4小时，也可以不进行浸泡。水蒸气蒸馏的时间可以为6小时。最优选以8倍量加水蒸馏提取6小时，因为挥发油提取量最大。在根据本发明的方法中，可以将山萸肉、熟地黄、盐补骨脂、炙黄芪、当归、党参、鸡血藤和醋鳖甲的预混料用水煎煮提取以获得水提取液。该步骤可以使用提取机组进行。煎煮可以进行多次。煎煮时间可以为0.5～4小时。在一些具体实施方案中，可以加水煎煮三次，每次1小时。加入的水量可以为预混料的量的6～8倍。在一些更具体实施方案中，加水煎煮三次，每次1.0小时，加水量为预混料的8倍(第一次)、6倍(第二次)、6倍(第三次)。在煎煮之后，水提取液可以通过离心或过滤进行除杂澄清处理。之后，可以将砂仁蒸馏后的水溶液与所述水提取液混合浓缩为稠膏。浓缩可以在40～100℃的温度和减压(比如真空)条件下进行。浓缩后的稠膏的相对密度通常为1.34～1.38(70～80℃)。在浓缩之后，可以将稠膏干燥成干膏。干燥可以在40～100℃的温度和减压(比如真空)条件下进行。干燥时间可以为12小时以上。根据本发明的方法，在获得干膏之后，可以将阿胶和所述干膏进行研磨并且加入含有填充剂的辅料进行干法混合以获得干混物。可以将阿胶和所述干膏分别进行研磨成细粉(比如80目)，然后与含有填充剂的辅料混合在一起以获得干混物；或者可以将阿胶和所述干膏一起研磨成细粉，然后与含有填充剂的辅料混合在一起以获得干混物。研磨可以使用粉碎机或研磨机进行。干膏粉与填充剂的重量比可以为9：1～3：7，优选1：1～3：1。然后，可以将所述干混物进行干法制粒以获得半成品颗粒。干法制粒可以采用干法制粒机进行。轧辊转速可以为10～20rpm，下料桨转速可以为20～40rpm，轧辊的压力可以在4～8mpa范围内，侧封的压力可以在1～3mpa范围内。根据本发明，在干法制粒之后，可以将所述半成品颗粒进行整粒。整粒可以通过如下进行：使用12目筛筛选，然后使用10目和30目筛进行选粒，收集通过10目筛而不能通过30目筛颗粒。整粒之后，可以将砂仁挥发油喷入整粒后的半成品颗粒中并进行密闭闷润以获得所述中药复方颗粒剂。在喷入砂仁挥发油之后，可以进行混合并在密闭容器中进行闷润。闷润时间通常为2小时以上。根据本发明的方法还可以包括在整粒后移除的半成品颗粒重新进行干法制粒的步骤。具体地，可以将不能通过10目筛和能过30目筛的颗粒重新制粒。重新制粒的条件如上所述。通常干法制粒获得的半成品颗粒的水分为不超过13％，优选5.0％，如水分超标，需要在80℃以下烘至水分含量达到标准。因此，根据本发明的方法还可以包括将整粒后的半成品颗粒进行干燥使得颗粒水分不超过5.0重量％的步骤。干燥温度可以为50～80℃。此外，根据本发明的方法还可以包括将中药复方颗粒剂进行总混的步骤。总混的时间可以为15分钟。以下，将通过一些实施例来具体说明本发明。应当懂得，这些实施例仅用于说明的目的，它们并不以任何方式对本发明构成限制。实施例1中药复方颗粒剂的制备首先将砂仁除去杂质及非药用部分，然后使用粉碎机破碎。将62.5g破碎后的砂仁投入挥发油提取罐组中，加8倍量水，加热，水蒸气蒸馏6小时，收集挥发油(密闭)，蒸馏后的水溶液另器收集并且过滤(滤器孔径不低于200目)。将375g山萸肉、250g熟地黄、187.5g炙黄芪、187.5g党参、187.5g当归、187.5g盐补骨脂、187.5g鸡血藤、250g醋鳖甲投入提取机组中，加水煎煮三次(第一次加8倍量水，第二、三次加6倍量水)，每次1小时，过滤煎液(滤器孔径不低于200目)，滤液与砂仁蒸馏后的水溶液合并，在70℃真空浓缩成相对密度为1.34～1.38(70～80℃)的稠膏。使用真空干燥箱将稠膏80℃真空干燥12小时成干膏，将干燥的干膏放凉。使用粉碎机将干膏粉碎成细粉(80目)，即得干膏粉。使用粉碎机将62.5g阿胶粉碎成细粉(80目)。然后在混合机中依次投入干膏粉、阿胶粉和甜菊素10g以及蔗糖粉(干膏粉∶蔗糖的重量比例约为1∶1)，干混5分钟。使用干法制粒机(制粒条件：轧辊转速为15rpm，下料桨转速为30rpm，轧辊压力为6mpa，侧封的压力为2mpa)20目筛网制粒，即得半成品颗粒。整粒使用12目筛进行，并使用10目和30目筛进行选粒，收集通过10目筛而不能通过30目筛颗粒。不能通过10目筛和能过30目筛的颗粒重新制粒。将制粒后得到的颗粒与整粒后的颗粒合并。最后将砂仁挥发油在混合机中边搅拌边喷入到颗粒中，干混5分钟后移入物料桶中，密闭闷润2小时。最后将颗粒总混15分钟，装袋。实施例2首先将砂仁除去杂质及非药用部分，然后使用粉碎机破碎。将62.5g破碎后的砂仁投入挥发油提取罐组中，加8倍量水，加热，水蒸气蒸馏6小时，收集挥发油(密闭)，蒸馏后的水溶液另器收集并且过滤(滤器孔径不低于200目)。将500g山萸肉、250g熟地黄、187.5g炙黄芪、187.5g党参、125g当归、187.5g盐补骨脂、125g鸡血藤、250g醋鳖甲投入提取机组中，加水煎煮三次(第一次加8倍量水，第二、三次加6倍量水)，每次1小时，过滤煎液(滤器孔径不低于200目)，滤液与砂仁蒸馏后的水溶液合并，在80℃真空浓缩成相对密度为1.34～1.38(70～80℃)的稠膏。使用真空干燥箱将稠膏90℃真空干燥12小时成干膏，将干燥的干膏放凉。使用粉碎机将干膏粉碎成细粉(80目)，即得干膏粉。使用粉碎机将187.5g阿胶粉碎成细粉(80目)。然后在混合机中依次投入干膏粉、阿胶粉和甜菊素10g以及蔗糖粉(干膏粉∶蔗糖的重量比例约为3∶1)，干混5分钟。使用干法制粒机(制粒条件：轧辊转速为15rpm，下料桨转速为30rpm，轧辊压力为6mpa，侧封的压力为2mpa)20目筛网制粒，即得半成品颗粒。整粒使用12目筛进行，并使用10目和30目筛进行选粒，收集通过10目筛而不能通过30目筛颗粒。不能通过10目筛和能过30目筛的颗粒重新制粒。将制粒后得到的颗粒与整粒后的颗粒合并。最后将砂仁挥发油在混合机中边搅拌边喷入到颗粒中，干混5分钟后移入物料桶中，密闭闷润2小时。最后将颗粒总混15分钟，装袋。实施例3首先将砂仁除去杂质及非药用部分，然后使用粉碎机破碎。将62.5g破碎后的砂仁投入挥发油提取罐组中，加8倍量水，加热，水蒸气蒸馏6小时，收集挥发油(密闭)，蒸馏后的水溶液另器收集并且过滤(滤器孔径不低于200目)。将375g山萸肉、312.5g熟地黄、187.5g炙黄芪、125g党参、187.5g当归、187.5g盐补骨脂、187.5g鸡血藤、250g醋鳖甲投入提取机组中，加水煎煮三次(第一次加8倍量水，第二、三次加6倍量水)，每次1小时，过滤煎液(滤器孔径不低于200目)，滤液与砂仁蒸馏后的水溶液合并，在70℃真空浓缩成相对密度为1.34～1.38(70～80℃)的稠膏。使用真空干燥箱将稠膏80℃真空干燥12小时成干膏，将干燥的干膏放凉。使用粉碎机将干膏粉碎成细粉(80目)，即得干膏粉。使用粉碎机将62.5g阿胶粉碎成细粉(80目)。然后在混合机中依次投入干膏粉、阿胶粉和甜菊素10g以及可溶性淀粉(干膏粉∶可溶性淀粉的重量比例约为5∶1)，干混5分钟。使用干法制粒机(制粒条件：轧辊转速为15rpm，下料桨转速为30rpm，轧辊压力为6mpa，侧封的压力为2mpa)20目筛网制粒，即得半成品颗粒。整粒使用12目筛进行，并使用10目和30目筛进行选粒，收集通过10目筛而不能通过30目筛颗粒。不能通过10目筛和能过30目筛的颗粒重新制粒。将制粒后得到的颗粒与整粒后的颗粒合并。最后将砂仁挥发油在混合机中边搅拌边喷入到颗粒中，干混5分钟后移入物料桶中，密闭闷润2小时。最后将颗粒总混15分钟，装袋。实施例4实施例1～3的中药复方颗粒剂的相关动物毒性试验1、动物急性毒性试验取昆明种小鼠(清洁级，体重19～21g，雌雄各半，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供)40只，雌雄各半，正常对照组和给药组各20只。小鼠在实验环境下饲养2日，给药前禁食供饮16小时，实施例药物用蒸馏水配制成1.353g生药/ml，给药体积0.4ml/10g，对照组给予相同容积的蒸馏水。一日内灌胃给予药液3次，每次间隔6小时，每次给药量为54.12g生药/kg，一日内累计给药量为162.36g生药/kg。给药后即刻观察动物行为及反应，外观、四肢活动、摄食、饮水、排泄等情况，并每天观察一次，连续14天，详细记录每只动物的反应情况。同时记录每日进食量及体重。结果显示，试验小鼠给药当日可见蜷卧少动，部分小鼠出现腹泻。给药后第1天饮食量明显下降，以后逐渐恢复。雄性小鼠给药后1天体重增长缓慢，与正常对照组相比有明显差异(p＜0.05)，2天后恢复正常。其它未见明显异常。观察14天结束时，未发现动物死亡。本发明药物以药物最大允许浓度1.353g生药/ml、小鼠最大灌胃容积0.4ml/10g，一日内灌胃给药3次，累计给药量为162.36g生药/kg。经14天观察，除给药当天蜷卧少动，部分小鼠出现腹泻，给药后第1天饮食量明显下降，雄性小鼠给药后1天体重增长缓慢外，其它未见明显异常，观察期间未见小鼠死亡。结果表明，小鼠一日内累计给药量为162.36g生药/kg时，仍未见因药物毒性引起的死亡和严重不良反应。临床试验推荐人日服用量为93g生药，按人平均体重60kg计，则临床人日服剂量为1.55g生药/kg，因此小鼠最大给药量相当于临床试验人日服剂量的104.75倍。2、动物长期毒性试验试验使用spf级sd大鼠作为长期毒性试验的啮齿类动物种属，由军事医学科学院实验动物中心提供，160只，5～6周龄，雌雄各半，每组30只，体重120～160g。试验动物适应一周后分组，称动物体重和进食量、进水量，按动物性别和体重等均衡和随机原则分组，每组30只，雌雄各半。设为3个给药组和1个对照组，每组中每个性别动物各为15只。依据最大给药量将大鼠长毒各组的给药剂量分别定为低剂量组9g/kg、中剂量18g/kg、高剂量36g/kg。大鼠试验给药途径为灌胃。每周给药6次，给药时间为每日上午8:30～10:30，灌胃容积开始为每1.56ml/100g体重；在试验40天后，因动物体重较大，调整配药浓度，灌胃容积调整为每1.25ml/100g体重，对照组动物灌胃相应容积的蒸馏水。给药期定为6个月，停药后观察30天。在试验过程中每日观察动物的一般状态，包括动物皮毛外表状态、鼻腔和肛门等有无分泌物、活动情况等；每周测定体重一次，同时测定进食量、进水量；分别于给药后3个月、6个月、停药后30天活杀40只大鼠(每组10只，雌雄各半)，进行尿液生化分析、外周血有形成分指标、凝血指标、血清生化指标、大体解剖，称量脏器重量及计算脏器系数，并进行组织病理学检查。结果显示，大鼠连续口服颗粒剂6个月，低剂量组(9g/kg，相当于推荐人临床日用剂量的13.75倍)是基本安全剂量。虽然中剂量组(18g/kg，相当于推荐人临床日用剂量的27.50倍)、高剂量组(36g/kg，相当于推荐人临床日用剂量的55.00倍)少数动物在药后尿生化分析中“血”、“蛋白质”及尿素氮(ure)、磷酸肌酸激酶(ck)出现了异常(对照组也出现了异常)，其实是其剂量太高的正常反应；而且停药后1个月，除大剂量组雌性大鼠磷酸肌酸激酶(ck)含量显著低于对照组，其余各项指标与对照组比较均未见显著差异，说明本发明颗粒剂9～36g/kg/d剂量范围内给药6个月未见药物延迟性毒性反应，表明所述颗粒剂在sd大鼠水平的安全使用剂量至少在36g/kg以上。受试药物中药复方颗粒剂sd大鼠口服给药6个月发生变化的各项观察指标除体重、磷酸肌酸激酶(ck)含量外，其余发生变化的指标在停药后1个月均恢复正常值水平，说明药物对机体产生的毒性反应是可逆的。低、中、高剂量的中药复方颗粒剂制剂经口给予sd大鼠3个月、6个月和停药1个月，可引起轻微至轻度的脾脏髓外造血和骨髓红系造血功能增强，属于治疗作用外的疗效作用，表明该药的临床治疗效果较为显著；该药物对造血系统和免疫系统的脏器、器官和组织无损伤作用。实施例5中药复方颗粒剂的药理学试验1、中药复方颗粒剂对小鼠骨髓早期造血祖细胞增殖分化影响研究1.1实验材料1.1.1实验动物昆明种小鼠132只，二级，雌性102只，雄性30只。其中，外周血指标检测每组10只，共60只，雌雄各半；造血祖细胞培养每组3只，两个时间点共36只，雌性；cd34+细胞检测每组6只，共36只，雌性。小鼠日龄6～8周，体重18～22g。购自解放军军事医学科学院实验动物中心。1.1.2实验药物实施例1颗粒剂，药物浓度：每g中药复方颗粒剂相当于生药2.368g。阳性药：重组人粒细胞刺激因子注射液(g-csf)：北京双鹭药业股份有限公司。1.1.3主要仪器与试剂f820型血细胞分析仪：日本希森美康公司。co2培养箱(型号：hepaclass100)：thermoforma公司。rpmi1640：购自gibcobrl公司。胎牛血清、马血清：购自北京军区兽医防治中心。甲基纤维素：购自whatman公司。fitc标记的大鼠抗小鼠cd34抗体及对照抗体：购自美国bectondickinson公司。epo、il-3、il-11、l-谷氨酰胺：购自sigma公司。溶血素、稀释液、清洗液均由山东兰桥科技有限公司生产。1.2试验方法1.2.1模型制作试验采用3.5gy60co-γ射线照射，剂量为3.5gy，剂量率为1.31gy.min-1。1.2.2外周血象检测实验1.2.2.1分组及给药实验共分6组，分别为正常对照组、模型对照组、阳性药对照组、中药复方颗粒剂高剂量组、中药复方颗粒剂中剂量组、中药复方颗粒剂低剂量组。每组实验小鼠10只，雌雄各半。中药复方颗粒剂药物组灌胃给药后2天，60co-γ射线3.5gy照射造成小鼠骨髓造血抑制、外周血象有形成分减少，造模后再连续给药14天，每天1次。正常组和模型组灌胃给予等体积的蒸馏水，阳性对照组皮下注射重组人粒细胞刺激因子注射液(g-csf)，连续14天，每天1次。正常对照组：给予等量蒸馏水灌胃。模型对照组：给予等量蒸馏水灌胃。g-csf阳性药对照组：30μg/kg(注射容积：0.1ml/10g)。中药复方颗粒剂高剂量组：给药剂量10.0g/kg体重。中药复方颗粒剂中剂量组：给药剂量5.0g/kg体重。中药复方颗粒剂低剂量组：给药剂量2.5g/kg体重。1.3.3.2观察指标及检测方法分别在照前、照后1、3、5、7、11、13、15、17、21天，每只小鼠尾静脉取血20μl。用sysmex-800自动血球计数仪检测外周血象。1.2.3造血祖细胞检测实验1.2.3.1分组及给药实验共分6组，分别为正常对照组、模型对照组、阳性药对照组、中药复方颗粒剂高剂量组、中药复方颗粒剂中剂量组、中药复方颗粒剂低剂量组。每组小鼠6只，雌性。中药复方颗粒剂药物组灌胃给药后2天，60co-γ射线3.5gy照射造模，造模后再连续给药7天，每天1次。正常组和模型组灌胃给予等体积的蒸馏水，阳性对照组皮下注射重组人粒细胞刺激因子注射液(g-csf)，连续7天，每天1次。正常对照组：给予等量蒸馏水灌胃。模型对照组：给予等量蒸馏水灌胃。g-csf阳性药对照组：30μg/kg(注射容积：0.1ml/10g)。中药复方颗粒剂高剂量组：给药剂量10.0g/kg体重。中药复方颗粒剂中剂量组：给药剂量5.0g/kg体重。中药复方颗粒剂低剂量组：给药剂量2.5g/kg体重。1.2.3.2集落培养(1)分别在造模后3天、7天2个时间点，每组每次取3只小鼠颈椎脱臼处死。将颈椎脱臼处死小鼠置75％酒精中浸泡片刻消毒，取下小鼠股骨，用rpmi1640培养液冲出骨髓细胞，过4号针头制成单细胞悬液，计数细胞并算出接种细胞悬液量，按接种有核细胞1×105/ml体系计算。(2)配粒系培养体系(马血清2ml；g-csf100ng；细胞1×105/ml；1640补至7.6ml)，用恒温水浴法在37℃条件下预热10min后加入5％煮沸琼脂0.5ml立即混匀，用5ml注射器边加边摇快速混匀。每皿滴入上述体系1ml，放一塑料盒中并放几个加水的平皿后，于37℃、5％co2的条件下培养6天观察计数，多于50个细胞为一个细胞集落。(3)配红系、混合系、巨核系培养体系(巯基乙醇1×10-4m0.2ml；3％l-谷氨酰胺0.03ml；马血清0.7ml；epo100u；il-360ng；il-1150ng；2.7％甲基纤维素0.7ml；细胞1×105/ml)，放于振荡器上振荡片刻，加入24孔板中，每孔0.2ml，于37℃、5％co2的条件下培养3天观察计数cfu-e、cfu-meg；培养6天观察计数bfu-e、cfu-mix。1.2.4cd34+细胞检测实验1.2.4.1分组及给药实验共分6组，分别为正常对照组、模型对照组、阳性药对照组、中药复方颗粒剂高剂量组、中药复方颗粒剂中剂量组、中药复方颗粒剂低剂量组。每组实验小鼠6只，雌性。中药复方颗粒剂药物组灌胃给药后2天，60co-γ射线3.5gy照射造模，造模后再连续给药7天，每天1次。正常组和模型组灌胃给予等体积的蒸馏水，阳性对照组皮下注射重组人粒细胞刺激因子注射液(g-csf)，连续7天，每天1次。正常对照组：给予等量蒸馏水灌胃。模型对照组：给予等量蒸馏水灌胃。g-csf阳性药对照组：30μg/kg(注射容积：0.1ml/10g)。中药复方颗粒剂高剂量组：给药剂量10.0g/kg体重。中药复方颗粒剂中剂量组：给药剂量5.0g/kg体重。中药复方颗粒剂低剂量组：给药剂量2.5g/kg体重。1.2.4.2观察指标及检测方法在造模后7天颈椎脱臼处死小鼠，用含0.2％牛血清白蛋白的pbs缓冲液冲出小鼠股骨骨髓细胞，取1×106个细胞加入30μl小鼠血清，反应10min，以封闭非特异结合位点，加入10μifitc标记的大鼠抗小鼠cd34抗体，对照管加入相应的对照抗体，4℃避光反应30min。加入2ml红细胞裂解液，作用5min，用含0.2％牛血清白蛋白和0.1％叠氮钠的pbs缓冲液洗细胞两次，加入终浓度为3μg/ml的pi染液，上机检测。1.2.5数据处理及统计输入所有动物不同时间的测量结果，计算各组均数、标准差及组间均数的显著性t检验。1.3试验结果1.3.1外周血象1.3.1.1外周血白细胞与正常对照组比较，照射对照组在造模后第1～21天白细胞数显著降低(p＜0.01～0.001)，说明造模成功。与照射对照组比较，阳性药组在造模后第1～17天(除3、11天)白细胞数显著升高(p＜0.05～0.001)；中药复方颗粒剂各剂量组均能升高白细胞数，高、中、低剂量组分别在造模后第5、7、13天，第13天，第13、17天显著促进白细胞数升高(p＜0.05～0.01)，结果见表1。表1中药复方颗粒剂对3.5gy60co-γ射线照射小鼠外周血白细胞(wbc1×109/l)的影响(n＝10，)注：与正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；与照射对照组比较，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.0011.3.1.2外周血红细胞与血红蛋白与正常对照组比较，造模后照射对照组的外周血红细胞、血红蛋白均有一定程度的下降，第3～21天血红细胞显著降低(p＜0.05～0.001)，第3～21天血红蛋白显著降低(第17天除外，p＜0.05～0.001)，说明造模成功。阳性药组和中药复方颗粒剂各剂量组的红细胞、血红蛋白在15或17天显著高于照射对照组(p＜0.05～0.01)，结果见表2、表3。表2中药复方颗粒剂对3.5gy60co-γ射线照射小鼠外周血红细胞(rbc1×1012/l)的影响(n＝10，)注：与正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；与照射对照组比较，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001表3中药复方颗粒剂对3.5gy60co-γ射线照射小鼠外周血血红蛋白(hgbg/l)的影响(n＝10，)注：与正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；与照射对照组比较，#p＜0.05，##p＜0.011.3.1.3血小板数照射对照组和用药组的血小板计数，在照射后1天呈下降，3～5天上升后又下降的趋势，照射后7天达最低值，此后缓慢回升。但中药复方颗粒剂各剂量组从照射后5天起较对照组恢复快，其中高剂量组在第5、11、13天；中剂量组在第13天明显高于照射对照组(p＜0.05～0.001)，结果见表4。表4中药复方颗粒剂对3.5gy60co-γ射线照射小鼠外周血血小板(plt1×109l)的影响(n＝10，)注：与正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；与照射对照组比较，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.0011.3.2造血祖细胞与照射对照组比较，阳性药与中药复方颗粒剂各剂量组在照射后3、7天均促进cfu-gm、cfu-e增殖(p＜0.05～0.001)；中药复方颗粒剂高、中剂量组在药后3、7天还促进cfu-meg、cfu-mix增殖(p＜0.05～0.01)，结果见表5。表5中药复方颗粒剂对3.5gy60co-γ射线照射小鼠造血祖细胞的影响(n＝3，)注：与正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；与照射对照组比较，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.0011.3.3cd34+细胞与正常对照组比较，照射对照组在造模后7天骨髓cd34+细胞显著降低(p＜0.01)，说明造模成功。照射模型组cd34+细胞数明显下降，阳性药治疗后cd34+细胞数显著上升，中药复方颗粒剂各剂量组均能升高小鼠骨髓中cd34+细胞数，其中，低剂量组与照射模型对照组相比有显著差异(p＜0.05)，结果见表6。表6中药复方颗粒剂对3.5gy60co-γ射线照射小鼠7天骨髓cd34+细胞的影响(n＝6，)注：与正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；与照射对照组比较，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001结果表明，中药复方颗粒剂各剂量组均能升高外周血白细胞数，促进cfu-gm、cfu-e、cfu-meg增殖，升高小鼠骨髓中cd34+细胞数，其中，高剂量组对外周血白细胞作用显著，高、中剂量组对骨髓造血干/祖细胞作用显著，低剂量组对cd34+细胞作用显著。2、中药复方颗粒剂防治60co-γ射线诱导大鼠再生障碍性贫血的药效学研究2.1试验材料大鼠：购自北京市华阜康生物科技股份有限公司。实施例1颗粒剂，药物浓度：每g中药复方颗粒剂相当于生药2.368g。注射用环磷酰胺：山西普德药业股份有限公司，0.2g/支。阳性药：司坦唑醇片(康力龙，临床可用于再生障碍性贫血治疗，可能使骨髓造血功能得到改善，特别是红细胞生成)，广西南宁百会药业集团有限公司，2mg/片。2.2试验方法2.2.1试验动物及适应性喂养sd大鼠80只，体重180～200g，购入后置于恒温(24±0.5℃)恒湿(50±10％)的动物房内适应性喂养1周，自由饮水、摄食。2.2.2试验分组及给药sd大鼠适应性喂养1周后，按体重随机分出10只为正常对照组。其余70只在北京大学化学所钴源室用60co-γ射线4.0gy照射，照射后大鼠状态显示不佳，蜷缩、活动减少。采用60co-γ射线4.0gy照射后，对存活大鼠随机按体重分为5组。本次实验总计分为6组：正常对照组、模型对照组、阳性药对照组、中药复方颗粒剂小剂量组、中药复方颗粒剂中剂量组、中药复方颗粒剂大剂量组。从第4d开始给予环磷酰胺25.0mg·kg-1腹腔注射，连续3天，制备再生障碍性贫血动物大鼠模型。连续注射环磷酰胺3天，于最后一次注射给药的当天，阳性药组按体重2.8mg/kg，中药复方颗粒剂小、中、大剂量组的给药剂量分别按体重：7.2g/kg、4.16g/kg、2.4g/kg灌胃，将药物溶于去离子水中，大鼠按体重1ml/100g灌胃，正常对照组、模型对照组给予相同的去离子水灌胃。2.2.3观察指标(1)对再障模型大鼠一般情况的影响：活动、饮食、二便、皮毛、腹泻、消瘦、发育、精神状态(2)对再障模型大鼠外周血象的影响：血wbc、rbc、hgb及pt等变化(3)对再障模型大鼠骨髓有核细胞数的影响：计数每根股骨大鼠骨髓有核细胞数(4)对再障模型大鼠免疫功能的影响①流式细胞术检测：cd3、cd4、cd8及cd4/cd8。②放射免疫法检测：tgf-β1、il-1、ifnγ、tnfα等。2.3试验结果2.3.1对再障模型大鼠一般情况的影响模型对照组大鼠活动、饮食减少，精神状态不佳，大便稀薄，小便时带血，皮毛竖起、消瘦、发育不良，体重减轻，耳、唇、甲部苍白，贫血情况明显。中药复方颗粒剂各剂量组的以上症状有不同程度的改善，尤其是贫血症状改善明显，体重明显增加，其中以中药复方颗粒剂中剂量组的大鼠状态为最佳。在造模和治疗过程中有部分动物死亡，各组大鼠存活情况，见表7。存活动物全部测定外周血像；考虑到实验操作可行性，并满足统计学的要求，从存活动物中每组随机选择6只测定骨髓有核细胞数、cd4、cd8、cd3、cd4/cd8、tgf-β1、il-1。2.3.2对再障模型大鼠外周血象的影响见表7表7中药复方颗粒剂对60co-γ射线诱导大鼠再生障碍性贫血外周血像的影响注：与正常对照组比，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型对照组比，*p＜0.05，**p＜0.01；与阳性药组比，△p＜0.05，△△p＜0.01。实验中60co-γ射线4.0gy照射结合环磷酰胺25.0mg·kg-1腹腔注射大鼠再生障碍性动物模型，外周血象全细胞wbc、rbc及hgb减少，分别与正常对照组比较，统计学处理有显著性差异(p＜0.01)，表明造模成功。中药复方颗粒剂各剂量组治疗后，外周血象显著增加，与模型对照组比较有显著性差异(p＜0.01)，中药复方颗粒剂与阳性药组比较，wbc指标，大、中剂量组有显著性差异(p＜0.05)，hgb指标，小剂量组有显著性差异(p＜0.05)，说明中药复方颗粒剂作用优于司坦唑醇片作用，中药复方颗粒剂治疗作用具有剂量依赖关系。2.3.3对再障模型大鼠骨髓有核细胞数的影响见表8表8中药复方颗粒剂对60co-γ射线诱导大鼠再生障碍性贫血骨髓有核细胞数的影响组别n骨髓有核细胞数×107正常对照组66.510±0.191模型对照组61.042±0.322##阳性药组64.632±0.473**小剂量组64.734±0.171**中剂量组64.470±0.369**大剂量组65.042±0.354**注：与正常对照组比，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型对照组比，*p＜0.05，**p＜0.01；与阳性药组比，△p＜0.05，△△p＜0.01。模型对照组动物，骨髓有核细胞明显降低，骨髓增生显著低下，与正常对照组比较，统计学有显著性差异(p＜0.01)，表明造模成功。中药复方颗粒剂各剂量组治疗后，骨髓有核细胞数显著增加，与模型对照组比有显著性差异(p＜0.01)。2.3.4对再障模型大鼠cd4、cd8、cd3、cd4/cd8的影响见表9表9中药复方颗粒剂对60co-γ射线诱导大鼠再生障碍性贫血cd4、cd8、cd3、cd4/cd8的影响注：与正常对照组比，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型对照组比，*p＜0.05，**p＜0.01；与阳性药组比，△p＜0.05，△△p＜0.01。模型对照组动物的外周血cd8、cd3、cd4/cd8与正常对照组比较，均有不同程度的增加，经统计学处理有显著性差异(p＜0.05)，表明造模成功。中药复方颗粒剂各剂量组治疗后可以明显降低，与模型对照组比较，有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，与阳性药组比较，无显著性差异；中药复方颗粒剂各剂量组治疗后，cd4可以明显升高，与模型对照组比较，除小剂量组外，有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，且中药复方颗粒剂治疗作用具有剂量依赖关系。2.3.5对再障模型大鼠血清tgf-β1、il-1的影响见表10表10中药复方颗粒剂对60co-γ射线诱导再生障碍性贫血大鼠血清tgf-β1、il-1的影响组别ntgf-β1il～1正常对照组613.839±0.4050.267±0.012模型对照组628.411±0.714##0.150±0.009##阳性药组617.646±0.605**0.214±0.005**颗粒剂小剂量组618.777±0.257**0.153±0.002△颗粒剂中剂量组613.421±1.277**△0.195±0.008*颗粒剂大剂量组616.658±1.080**0.209±0.006**注：与正常对照组比，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型对照组比，*p＜0.05，**p＜0.01；与阳性药组比，△p＜0.05，△△p＜0.01。模型对照组动物大鼠血清tgf-β1与正常对照组比较，显著增加，经统计学处理有显著性差异(p＜0.01)，il-1与正常对照组比较，显著降低，经统计学处理有显著性差异(p＜0.01)，表明造模成功。中药复方颗粒剂各剂量组治疗后，tgf-β1明显降低，与模型对照组比较，有显著性差异(p＜0.01)，与阳性药组比较，中剂量组有显著性差异(p＜0.05)；中药复方颗粒剂各剂量组治疗后，il-1明显升高，与模型对照组比较，中、高剂量组有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，与阳性药组比较，小剂量组有显著性差异(p＜0.05)；且中药复方颗粒剂治疗作用具有剂量依赖关系。2.3.6对再障模型大鼠血清ifn-γ、tnf-α的影响见表11表11中药复方颗粒剂对60co-γ射线诱导再生障碍性贫血大鼠血清ifn～γ、tnf-α的影响注：与正常对照组比，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型对照组比，*p＜0.05，**p＜0.01；与阳性药组比，△p＜0.05，△△p＜0.01。模型对照组动物大鼠血清ifn-γ、tnf-d与正常对照组比较，显著增加，经统计学处理有显著性差异(p＜0.01)，表明造模成功。与模型对照组比较，中药复方颗粒剂各剂量组治疗后明显降低ifn-γ、tnf-α，有显著性差异(p＜0.01)；与阳性药组比较，中药复方颗粒剂高剂量组有显著性差异(p＜0.05)，且中药复方颗粒剂治疗作用具有剂量依赖关系。实施例2～3的颗粒剂的类似药理学试验表明，与实施例1的颗粒剂没有明显差别。上述实施例仅例示性的说明了本发明，而非用于限制本发明。熟知本领域的技术人员应当理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，对本发明实施例所作的任何更改和变化均落在本发明的范围内。且本发明的保护范围应由所附的权利要求确定。当前第1页1 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：地中海贫血是先天性基因缺陷致使人体不能正常合成血红蛋白珠蛋白引起的一种遗传性血液病，也叫珠蛋白合成障碍性贫血，是世界范围内发病率最高、危害最大的单基因遗传病，属难治性遗传性溶血性贫血，因最初在地中海地区发现而得名。其发病机制是位于11号、16号染色体调控珠蛋白合成的基因突变或缺失，造成大量无效红细胞生成，最终导致溶血性贫血，后续累积影响到心、脾等人体重要器官的功能。地中海贫血有明显的地中海贫血貌：面色萎黄，头颅方大，颧骨突起，鼻梁凹陷，眼睑浮肿，肤色如黄土，唇舌色淡，肝脾肿大。据who秘书处报告，全世界约有1亿多人携带地中海贫血基因，每年约有30万婴儿在出生时患有地中海贫血综合征。我国是地中海贫血的高发国。地中海贫血在我国危害较大的主要有两种，即α-和β-型两种，南方各省发病率较高。仅广西、广东、海南三省地中海贫血基因携带者达2000多万。该病多为婴幼儿、少年发病，表现为虚劳、眩晕、心悸、黄疸、腹中瘢积，生长发育迟缓等。患者症见严重贫血、地贫貌。血象检查有红细胞低色性贫血，可出现靶形细胞，网织细胞增加，核红细胞、红细胞渗透压减低。β地中海贫血症患者，除上述特征外，其临床上表现出：腰膝酸软、眩晕、心悸、气短、乏力、脱发耳鸣、面色、唇、甲苍白，手足心热，盗汗等症状。在国际上，地中海贫血的治疗原则仍以输血和去铁治疗为主。除轻型地中海贫血临床上不要求特殊治疗外(需适当补充叶酸和维生素e)，中间型α和β地中海贫血一般采用红细胞少量输注法，重型β地中海贫血则采用高剂量输血或输注浓缩红细胞联合除铁剂治疗是基本的治疗措施，而且应从早期开始给予中、高剂量输血，以使患儿生长发育接近正常，减少肠道吸收铁，抑制脾肿大，防止骨骼病变。其方法是：先反复输注浓缩红细胞，使患儿血红蛋白含量达120～150g/l；然后每隔2～4周输注浓缩红细胞10～15ml/kg，使血红蛋白含量维持在90～105g/l以上。但本法容易导致含铁血黄素沉着症，故应同时给予铁螯合剂(注射用甲磺酸去铁胺、去铁酮片等)治疗，可增加铁从尿液和粪便排出，但不能阻止胃肠道对铁的吸收，而且长期使用可致白内障和骨发育障碍，剂量过大可引起视力和听觉减退。但由于地中海贫血患者大量溶血而引起巨脾、功能亢进，加重贫血和铁沉积而导致其他脏器损伤，这种治疗最多只能维持十几年。脾切除手术治疗：脾切除对α地中海贫血和中间型β地中海贫血的疗效较好，对重型β地中海贫血效果差。脾切除可致免疫功能减弱，后遗症非常严重。且应在5～6岁以后施行并严格掌握适应证。骨髓和干细胞移植：异基因造血干细胞移植是目前能根治重型β地中海贫血的方法。如有hla相配的造血干细胞供者，应作为治疗重型β地中海贫血的首选方法。但目前受髓源和配型限制还很难普及，且费用高昂。基因治疗：基因治疗可增加γ基因表达或减少a基因表达，以改善β地中海贫血的症状。虽然是未来发展的方向，但因同源重组率未解决，临床应用尚待时日。此外，国内外有人尝试用羟基脲、5-氮杂胞苷、阿糖胞苷、马利兰、异烟肼等几种化疗药进行探索性治疗，但由于这些药物疗效不确切，且有极强的副作用，其临床应用受到限制。因此，对地中海贫血的有效治疗仍是世界性难题，并且至今几乎没有有效治疗地中海贫血的中、西药物。cn200610078866.x公开了一种治疗地中海贫血的药物及其制备工艺，然而该工艺路线复杂，最终得到的膏剂含有何首乌提取物和有机溶剂残留物，长期服用不安全，而且在乙醇提取过程中使用的有机溶剂容易发生爆炸的极大安全生产隐患；另外，当归和砂仁仅以挥发油形式提取出了部分类型有效成分，有些类型的有效成分根本未进入终产品并且有些有效成分只有一部分进入终产品，影响最终药物药效发挥，最终得到的膏剂重量大，不易储存和运输，容易腐败，服用也不方便；此外，该工艺还需要复杂的挥发油包合、干燥步骤，挥发油包合物在干燥过程中损失较大，同时也增加了生产成本。因此，仍然需要一种改进的用于治疗地中海贫血的药物及其制备工艺。技术实现要素：为了克服现有技术的问题，本发明的一个目的是提供一种中药复方颗粒剂，该中药复方颗粒剂可以提供患者良好的用药顺应性，携带、贮藏、运输、服用方便，更耐储存，用药更安全，毒副作用更小，同时具有良好的地中海贫血症治疗功效。本发明的另一个目的是提供一种用于制备中药复方颗粒剂的方法，该方法能够避免容易发生有机溶剂爆炸的安全生产隐患，降低生产成本，并且能够以全成分提取各中药组分的有效成分，通过该方法能够制备可以提供患者良好的用药顺应性，携带、贮藏、运输、服用方便，更耐储存，用药更安全，毒副作用更小，同时具有良好的地中海贫血症治疗功效的中药复方颗粒剂。为达到本发明的上述目的，本发明的一个方面提供一种中药复方颗粒剂，所述中药复方颗粒剂由辅料和作为活性成分的中药提取物制成，所述辅料含有填充剂，所述中药提取物是从由以下重量份的组分组成的中药材组合物提取的全成分提取物：5～8份山萸肉；3～5份熟地黄；2～5份盐补骨脂；2～4份炙黄芪；2～4份当归；0.5～3份阿胶；2～4份鸡血藤；2～4份党参；3～5份醋鳖甲；以及0.5～2份砂仁。根据本发明的中药复方颗粒剂，进一步地，所述中药材组合物由以下重量份的组分组成：6份山萸肉；4份熟地黄；3份盐补骨脂；3份炙黄芪；3份当归；1份阿胶；3份鸡血藤；3份党参；4份醋鳖甲；以及1份砂仁。根据本发明的中药复方颗粒剂，进一步地，基于所述中药复方颗粒剂的总重量，所述填充剂的量为10～70重量％。根据本发明的中药复方颗粒剂，进一步地，所述填充剂选自蔗糖、可溶性淀粉或它们的组合。根据本发明的中药复方颗粒剂，进一步地，所述辅料还含有矫味剂，并且基于所述中药复方颗粒剂的总重量，所述矫味剂的量为0.1～10重量％。本发明的另一个方面提供一种用于制备上面任一项所述的中药复方颗粒剂的方法，所述方法包括以下步骤：将砂仁进行水蒸气蒸馏并且收集挥发油和蒸馏后的水溶液；将山萸肉、熟地黄、盐补骨脂、炙黄芪、当归、党参、鸡血藤和醋鳖甲的预混料用水煎煮提取以获得水提取液；将所述蒸馏后的水溶液与所述水提取液混合并浓缩为稠膏；将所述稠膏进行干燥以获得干膏；将阿胶和所述干膏进行研磨并且加入含有填充剂的辅料进行干法混合以获得干混物；将所述干混物进行干法制粒以获得半成品颗粒；将所述半成品颗粒进行整粒；将所述挥发油喷入整粒后的半成品颗粒中并进行密闭闷润以获得所述中药复方颗粒剂。根据本发明的方法，进一步地，所述方法还包括将在整粒后移除的半成品颗粒重新进行干法制粒的步骤。根据本发明的方法，进一步地，将所述蒸馏后的水溶液与所述水提取液混合并浓缩为稠膏的步骤在40～100℃的温度和减压条件下进行。根据本发明的方法，进一步地，将所述稠膏进行干燥以获得干膏的步骤在40～100℃的温度和减压条件下进行。根据本发明的方法，进一步地，所述方法还包括将整粒后的半成品颗粒进行干燥使得颗粒水分不超过13重量％的步骤。有益效果根据本发明的方法工艺路线简单，不采用乙醇等有机溶剂提取工艺，因无需使用有机溶剂，从而避免容易发生有机溶剂爆炸的安全生产隐患，降低成本，无需复杂的砂仁挥发油包合工艺，进一步降低成本，并且砂仁采用全成分蒸馏提取工艺提取其全成分(包含挥发油和蒸馏水溶液)，而当归采用水煎煮工艺提取其全成分，以全成分进入制剂终产品，药效发挥更好，更符合中医汤剂的临床效果；而且，根据本发明的方法采用干法制粒工艺，所获得的中药复方制剂为颗粒剂，患者携带、贮藏、运输、服用方便，顺应性好，载药量高，更耐储存，不易腐败，不含具有肝毒性的何首乌提取物以及有机溶剂残留物，用药更安全，毒副作用更小。此外，进一步结合采用有效成分更易溶出和补肾作用更强的盐补骨脂以及有效成分更易溶出和软坚散结作用更强的醋鳖甲，使得本中药复方颗粒剂滋阴补肾，益髓生血，补气健脾之功效有增无减，适用于治疗α-和β-地中海贫血症。动物毒性实验表明，本中药复方颗粒剂具备更优的安全性和更低的毒副作用，其最大给药量可达162.36g生药/kg，相当于临床用量的104.75倍；并且在9～36g/kg/d剂量范围内给药6个月未见药物延迟性毒性反应，表明颗粒剂在sd大鼠水平的安全使用剂量至少在36g/kg以上。本中药复方颗粒剂对小鼠骨髓早期造血祖细胞增殖分化影响研究结果表明，各剂量组均能升高受3.5gy60co-γ射线照射致小鼠肾虚髓损模型血液中外周血白细胞数，促进cfu-gm、cfu-e、cfu-meg增殖，升高小鼠骨髓中cd34+细胞数，其中高剂量组对外周血白细胞作用显著，高、中剂量组对骨髓造血干/祖细胞作用显著，低剂量组对0d34+细胞作用显著。本中药复方颗粒剂防治60co-γ射线诱导大鼠再生障碍性贫血的药效学研究结果表明，其对60co-γ射线诱导大鼠再生障碍性贫血疗效肯定。具体实施方式根据本发明的中药复方颗粒剂由辅料和作为活性成分的中药提取物制成，所述辅料含有填充剂，所述中药提取物是从由以下重量份的组分组成的中药材组合物提取的全成分提取物：5～8份山萸肉；3～5份熟地黄；2～5份盐补骨脂；2～4份炙黄芪；2～4份当归；0.5～3份阿胶；2～4份鸡血藤；2～4份党参；3～5份醋鳖甲；以及0.5～2份砂仁。本中药制剂以山萸肉为君，滋阴补肾，意在补肾中真阴(真精)使真阴得养，髓海充盈，血有生源，故能益髓生精化血。熟地黄、炙黄芪、党参、当归、盐补骨脂、阿胶为臣药。熟地黄、盐补骨脂，协助君药生精化血，加强补肾之功，又盐补骨脂滋补肾阳，生发阳气，相对补骨脂而言，有效成分更易溶出，补肾作用更强。炙黄芪补中益气，阿胶滋阴补血，共奏益气补血之功。补肾药是从根本上治疗地中海贫血，可谓治本，而补血药以治标，标本同治相得益彰。本病肾虚而温养脾土不力，脾主气，气帅血，脾虚则气弱，不能帅血运行，致血滞为瘀，发为瘢积。炙黄芪，党参补气，气为血帅，气行则血行。鸡血藤、醋鳖甲为佐，鸡血藤、醋鳖甲滋阴养血，既软坚散结，消散腹中瘢积，其中醋鳖甲相对鳖甲而言，有效成分更易溶出，软坚散结作用更强。使药砂仁，消减养阴补血药之滋腻，使该药久服不碍脾胃。本中药制剂君、臣、佐、使四者合用，共奏滋阴补肾、益髓生血、补气健脾。既治本，又治标，既治主病，又治兼症，与地中海贫血之病因，病机，辨证论治非常贴合。在本发明中，术语“全成分提取物”是指在提取时中药材组合物各组分的全部有效成分均被提取出来并且进入最终的中药复方颗粒剂中。在根据本发明的中药复方颗粒剂中，优选地，所述中药材组合物由以下重量份的组分组成：6份山萸肉；4份熟地黄；3份盐补骨脂；3份炙黄芪；3份当归；1份阿胶；3份鸡血藤；3份党参；4份醋鳖甲；以及1份砂仁。根据本发明的中药复方颗粒剂含有辅料。所述辅料应当含有填充剂。在一些更具体的实施方案中，除填充剂之外，所述辅料还可以含有矫味剂。所述填充剂可以选自蔗糖、可溶性淀粉或它们的组合，矫味剂可以选自甜菊素等。当中药复方颗粒剂含有填充剂时，基于中药复方颗粒剂的总重量，填充剂的量可以为10～70重量％。当中药复方颗粒剂含有矫味剂时，基于中药复方颗粒剂的总重量，矫味剂的量可以为0.1～10重量％。上述中药复方颗粒剂通过根据本发明的中药复方颗粒剂的制备方法制备而成。所述方法可以包括以下步骤：将砂仁进行水蒸气蒸馏并且收集挥发油和蒸馏后的水溶液；将山萸肉、熟地黄、盐补骨脂、炙黄芪、当归、党参、鸡血藤和醋鳖甲的预混料用水煎煮提取以获得水提取液；将所述蒸馏后的水溶液与所述水提取液混合并浓缩为稠膏；将所述稠膏进行干燥以获得干膏；将阿胶和所述干膏进行研磨并且加入含有填充剂的辅料进行干法混合以获得干混物；将所述干混物进行干法制粒以获得半成品颗粒；将所述半成品颗粒进行整粒；将所述挥发油喷入整粒后的半成品颗粒中并进行密闭闷润以获得所述中药复方颗粒剂。在根据本发明的方法中，可以将砂仁进行水蒸气蒸馏并且收集挥发油和蒸馏后的水溶液。具体地，可以将砂仁投入挥发油提取罐中，加水，加热，进行水蒸气蒸馏，收集挥发油(密闭)，蒸馏后的水溶液可以另器收集，通过离心或过滤进行除杂澄清处理。再将砂仁投入挥发油提取罐中之前，可以使用研磨机或粉碎机将砂仁捣碎，加入的水可以为砂仁的6～10倍量。可以在蒸馏之前加水浸泡砂仁0～4小时，也可以不进行浸泡。水蒸气蒸馏的时间可以为6小时。最优选以8倍量加水蒸馏提取6小时，因为挥发油提取量最大。在根据本发明的方法中，可以将山萸肉、熟地黄、盐补骨脂、炙黄芪、当归、党参、鸡血藤和醋鳖甲的预混料用水煎煮提取以获得水提取液。该步骤可以使用提取机组进行。煎煮可以进行多次。煎煮时间可以为0.5～4小时。在一些具体实施方案中，可以加水煎煮三次，每次1小时。加入的水量可以为预混料的量的6～8倍。在一些更具体实施方案中，加水煎煮三次，每次1.0小时，加水量为预混料的8倍(第一次)、6倍(第二次)、6倍(第三次)。在煎煮之后，水提取液可以通过离心或过滤进行除杂澄清处理。之后，可以将砂仁蒸馏后的水溶液与所述水提取液混合浓缩为稠膏。浓缩可以在40～100℃的温度和减压(比如真空)条件下进行。浓缩后的稠膏的相对密度通常为1.34～1.38(70～80℃)。在浓缩之后，可以将稠膏干燥成干膏。干燥可以在40～100℃的温度和减压(比如真空)条件下进行。干燥时间可以为12小时以上。根据本发明的方法，在获得干膏之后，可以将阿胶和所述干膏进行研磨并且加入含有填充剂的辅料进行干法混合以获得干混物。可以将阿胶和所述干膏分别进行研磨成细粉(比如80目)，然后与含有填充剂的辅料混合在一起以获得干混物；或者可以将阿胶和所述干膏一起研磨成细粉，然后与含有填充剂的辅料混合在一起以获得干混物。研磨可以使用粉碎机或研磨机进行。干膏粉与填充剂的重量比可以为9：1～3：7，优选1：1～3：1。然后，可以将所述干混物进行干法制粒以获得半成品颗粒。干法制粒可以采用干法制粒机进行。轧辊转速可以为10～20rpm，下料桨转速可以为20～40rpm，轧辊的压力可以在4～8mpa范围内，侧封的压力可以在1～3mpa范围内。根据本发明，在干法制粒之后，可以将所述半成品颗粒进行整粒。整粒可以通过如下进行：使用12目筛筛选，然后使用10目和30目筛进行选粒，收集通过10目筛而不能通过30目筛颗粒。整粒之后，可以将砂仁挥发油喷入整粒后的半成品颗粒中并进行密闭闷润以获得所述中药复方颗粒剂。在喷入砂仁挥发油之后，可以进行混合并在密闭容器中进行闷润。闷润时间通常为2小时以上。根据本发明的方法还可以包括在整粒后移除的半成品颗粒重新进行干法制粒的步骤。具体地，可以将不能通过10目筛和能过30目筛的颗粒重新制粒。重新制粒的条件如上所述。通常干法制粒获得的半成品颗粒的水分为不超过13％，优选5.0％，如水分超标，需要在80℃以下烘至水分含量达到标准。因此，根据本发明的方法还可以包括将整粒后的半成品颗粒进行干燥使得颗粒水分不超过5.0重量％的步骤。干燥温度可以为50～80℃。此外，根据本发明的方法还可以包括将中药复方颗粒剂进行总混的步骤。总混的时间可以为15分钟。以下，将通过一些实施例来具体说明本发明。应当懂得，这些实施例仅用于说明的目的，它们并不以任何方式对本发明构成限制。实施例1中药复方颗粒剂的制备首先将砂仁除去杂质及非药用部分，然后使用粉碎机破碎。将62.5g破碎后的砂仁投入挥发油提取罐组中，加8倍量水，加热，水蒸气蒸馏6小时，收集挥发油(密闭)，蒸馏后的水溶液另器收集并且过滤(滤器孔径不低于200目)。将375g山萸肉、250g熟地黄、187.5g炙黄芪、187.5g党参、187.5g当归、187.5g盐补骨脂、187.5g鸡血藤、250g醋鳖甲投入提取机组中，加水煎煮三次(第一次加8倍量水，第二、三次加6倍量水)，每次1小时，过滤煎液(滤器孔径不低于200目)，滤液与砂仁蒸馏后的水溶液合并，在70℃真空浓缩成相对密度为1.34～1.38(70～80℃)的稠膏。使用真空干燥箱将稠膏80℃真空干燥12小时成干膏，将干燥的干膏放凉。使用粉碎机将干膏粉碎成细粉(80目)，即得干膏粉。使用粉碎机将62.5g阿胶粉碎成细粉(80目)。然后在混合机中依次投入干膏粉、阿胶粉和甜菊素10g以及蔗糖粉(干膏粉∶蔗糖的重量比例约为1∶1)，干混5分钟。使用干法制粒机(制粒条件：轧辊转速为15rpm，下料桨转速为30rpm，轧辊压力为6mpa，侧封的压力为2mpa)20目筛网制粒，即得半成品颗粒。整粒使用12目筛进行，并使用10目和30目筛进行选粒，收集通过10目筛而不能通过30目筛颗粒。不能通过10目筛和能过30目筛的颗粒重新制粒。将制粒后得到的颗粒与整粒后的颗粒合并。最后将砂仁挥发油在混合机中边搅拌边喷入到颗粒中，干混5分钟后移入物料桶中，密闭闷润2小时。最后将颗粒总混15分钟，装袋。实施例2首先将砂仁除去杂质及非药用部分，然后使用粉碎机破碎。将62.5g破碎后的砂仁投入挥发油提取罐组中，加8倍量水，加热，水蒸气蒸馏6小时，收集挥发油(密闭)，蒸馏后的水溶液另器收集并且过滤(滤器孔径不低于200目)。将500g山萸肉、250g熟地黄、187.5g炙黄芪、187.5g党参、125g当归、187.5g盐补骨脂、125g鸡血藤、250g醋鳖甲投入提取机组中，加水煎煮三次(第一次加8倍量水，第二、三次加6倍量水)，每次1小时，过滤煎液(滤器孔径不低于200目)，滤液与砂仁蒸馏后的水溶液合并，在80℃真空浓缩成相对密度为1.34～1.38(70～80℃)的稠膏。使用真空干燥箱将稠膏90℃真空干燥12小时成干膏，将干燥的干膏放凉。使用粉碎机将干膏粉碎成细粉(80目)，即得干膏粉。使用粉碎机将187.5g阿胶粉碎成细粉(80目)。然后在混合机中依次投入干膏粉、阿胶粉和甜菊素10g以及蔗糖粉(干膏粉∶蔗糖的重量比例约为3∶1)，干混5分钟。使用干法制粒机(制粒条件：轧辊转速为15rpm，下料桨转速为30rpm，轧辊压力为6mpa，侧封的压力为2mpa)20目筛网制粒，即得半成品颗粒。整粒使用12目筛进行，并使用10目和30目筛进行选粒，收集通过10目筛而不能通过30目筛颗粒。不能通过10目筛和能过30目筛的颗粒重新制粒。将制粒后得到的颗粒与整粒后的颗粒合并。最后将砂仁挥发油在混合机中边搅拌边喷入到颗粒中，干混5分钟后移入物料桶中，密闭闷润2小时。最后将颗粒总混15分钟，装袋。实施例3首先将砂仁除去杂质及非药用部分，然后使用粉碎机破碎。将62.5g破碎后的砂仁投入挥发油提取罐组中，加8倍量水，加热，水蒸气蒸馏6小时，收集挥发油(密闭)，蒸馏后的水溶液另器收集并且过滤(滤器孔径不低于200目)。将375g山萸肉、312.5g熟地黄、187.5g炙黄芪、125g党参、187.5g当归、187.5g盐补骨脂、187.5g鸡血藤、250g醋鳖甲投入提取机组中，加水煎煮三次(第一次加8倍量水，第二、三次加6倍量水)，每次1小时，过滤煎液(滤器孔径不低于200目)，滤液与砂仁蒸馏后的水溶液合并，在70℃真空浓缩成相对密度为1.34～1.38(70～80℃)的稠膏。使用真空干燥箱将稠膏80℃真空干燥12小时成干膏，将干燥的干膏放凉。使用粉碎机将干膏粉碎成细粉(80目)，即得干膏粉。使用粉碎机将62.5g阿胶粉碎成细粉(80目)。然后在混合机中依次投入干膏粉、阿胶粉和甜菊素10g以及可溶性淀粉(干膏粉∶可溶性淀粉的重量比例约为5∶1)，干混5分钟。使用干法制粒机(制粒条件：轧辊转速为15rpm，下料桨转速为30rpm，轧辊压力为6mpa，侧封的压力为2mpa)20目筛网制粒，即得半成品颗粒。整粒使用12目筛进行，并使用10目和30目筛进行选粒，收集通过10目筛而不能通过30目筛颗粒。不能通过10目筛和能过30目筛的颗粒重新制粒。将制粒后得到的颗粒与整粒后的颗粒合并。最后将砂仁挥发油在混合机中边搅拌边喷入到颗粒中，干混5分钟后移入物料桶中，密闭闷润2小时。最后将颗粒总混15分钟，装袋。实施例4实施例1～3的中药复方颗粒剂的相关动物毒性试验1、动物急性毒性试验取昆明种小鼠(清洁级，体重19～21g，雌雄各半，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供)40只，雌雄各半，正常对照组和给药组各20只。小鼠在实验环境下饲养2日，给药前禁食供饮16小时，实施例药物用蒸馏水配制成1.353g生药/ml，给药体积0.4ml/10g，对照组给予相同容积的蒸馏水。一日内灌胃给予药液3次，每次间隔6小时，每次给药量为54.12g生药/kg，一日内累计给药量为162.36g生药/kg。给药后即刻观察动物行为及反应，外观、四肢活动、摄食、饮水、排泄等情况，并每天观察一次，连续14天，详细记录每只动物的反应情况。同时记录每日进食量及体重。结果显示，试验小鼠给药当日可见蜷卧少动，部分小鼠出现腹泻。给药后第1天饮食量明显下降，以后逐渐恢复。雄性小鼠给药后1天体重增长缓慢，与正常对照组相比有明显差异(p＜0.05)，2天后恢复正常。其它未见明显异常。观察14天结束时，未发现动物死亡。本发明药物以药物最大允许浓度1.353g生药/ml、小鼠最大灌胃容积0.4ml/10g，一日内灌胃给药3次，累计给药量为162.36g生药/kg。经14天观察，除给药当天蜷卧少动，部分小鼠出现腹泻，给药后第1天饮食量明显下降，雄性小鼠给药后1天体重增长缓慢外，其它未见明显异常，观察期间未见小鼠死亡。结果表明，小鼠一日内累计给药量为162.36g生药/kg时，仍未见因药物毒性引起的死亡和严重不良反应。临床试验推荐人日服用量为93g生药，按人平均体重60kg计，则临床人日服剂量为1.55g生药/kg，因此小鼠最大给药量相当于临床试验人日服剂量的104.75倍。2、动物长期毒性试验试验使用spf级sd大鼠作为长期毒性试验的啮齿类动物种属，由军事医学科学院实验动物中心提供，160只，5～6周龄，雌雄各半，每组30只，体重120～160g。试验动物适应一周后分组，称动物体重和进食量、进水量，按动物性别和体重等均衡和随机原则分组，每组30只，雌雄各半。设为3个给药组和1个对照组，每组中每个性别动物各为15只。依据最大给药量将大鼠长毒各组的给药剂量分别定为低剂量组9g/kg、中剂量18g/kg、高剂量36g/kg。大鼠试验给药途径为灌胃。每周给药6次，给药时间为每日上午8:30～10:30，灌胃容积开始为每1.56ml/100g体重；在试验40天后，因动物体重较大，调整配药浓度，灌胃容积调整为每1.25ml/100g体重，对照组动物灌胃相应容积的蒸馏水。给药期定为6个月，停药后观察30天。在试验过程中每日观察动物的一般状态，包括动物皮毛外表状态、鼻腔和肛门等有无分泌物、活动情况等；每周测定体重一次，同时测定进食量、进水量；分别于给药后3个月、6个月、停药后30天活杀40只大鼠(每组10只，雌雄各半)，进行尿液生化分析、外周血有形成分指标、凝血指标、血清生化指标、大体解剖，称量脏器重量及计算脏器系数，并进行组织病理学检查。结果显示，大鼠连续口服颗粒剂6个月，低剂量组(9g/kg，相当于推荐人临床日用剂量的13.75倍)是基本安全剂量。虽然中剂量组(18g/kg，相当于推荐人临床日用剂量的27.50倍)、高剂量组(36g/kg，相当于推荐人临床日用剂量的55.00倍)少数动物在药后尿生化分析中“血”、“蛋白质”及尿素氮(ure)、磷酸肌酸激酶(ck)出现了异常(对照组也出现了异常)，其实是其剂量太高的正常反应；而且停药后1个月，除大剂量组雌性大鼠磷酸肌酸激酶(ck)含量显著低于对照组，其余各项指标与对照组比较均未见显著差异，说明本发明颗粒剂9～36g/kg/d剂量范围内给药6个月未见药物延迟性毒性反应，表明所述颗粒剂在sd大鼠水平的安全使用剂量至少在36g/kg以上。受试药物中药复方颗粒剂sd大鼠口服给药6个月发生变化的各项观察指标除体重、磷酸肌酸激酶(ck)含量外，其余发生变化的指标在停药后1个月均恢复正常值水平，说明药物对机体产生的毒性反应是可逆的。低、中、高剂量的中药复方颗粒剂制剂经口给予sd大鼠3个月、6个月和停药1个月，可引起轻微至轻度的脾脏髓外造血和骨髓红系造血功能增强，属于治疗作用外的疗效作用，表明该药的临床治疗效果较为显著；该药物对造血系统和免疫系统的脏器、器官和组织无损伤作用。实施例5中药复方颗粒剂的药理学试验1、中药复方颗粒剂对小鼠骨髓早期造血祖细胞增殖分化影响研究1.1实验材料1.1.1实验动物昆明种小鼠132只，二级，雌性102只，雄性30只。其中，外周血指标检测每组10只，共60只，雌雄各半；造血祖细胞培养每组3只，两个时间点共36只，雌性；cd34+细胞检测每组6只，共36只，雌性。小鼠日龄6～8周，体重18～22g。购自解放军军事医学科学院实验动物中心。1.1.2实验药物实施例1颗粒剂，药物浓度：每g中药复方颗粒剂相当于生药2.368g。阳性药：重组人粒细胞刺激因子注射液(g-csf)：北京双鹭药业股份有限公司。1.1.3主要仪器与试剂f820型血细胞分析仪：日本希森美康公司。co2培养箱(型号：hepaclass100)：thermoforma公司。rpmi1640：购自gibcobrl公司。胎牛血清、马血清：购自北京军区兽医防治中心。甲基纤维素：购自whatman公司。fitc标记的大鼠抗小鼠cd34抗体及对照抗体：购自美国bectondickinson公司。epo、il-3、il-11、l-谷氨酰胺：购自sigma公司。溶血素、稀释液、清洗液均由山东兰桥科技有限公司生产。1.2试验方法1.2.1模型制作试验采用3.5gy60co-γ射线照射，剂量为3.5gy，剂量率为1.31gy.min-1。1.2.2外周血象检测实验1.2.2.1分组及给药实验共分6组，分别为正常对照组、模型对照组、阳性药对照组、中药复方颗粒剂高剂量组、中药复方颗粒剂中剂量组、中药复方颗粒剂低剂量组。每组实验小鼠10只，雌雄各半。中药复方颗粒剂药物组灌胃给药后2天，60co-γ射线3.5gy照射造成小鼠骨髓造血抑制、外周血象有形成分减少，造模后再连续给药14天，每天1次。正常组和模型组灌胃给予等体积的蒸馏水，阳性对照组皮下注射重组人粒细胞刺激因子注射液(g-csf)，连续14天，每天1次。正常对照组：给予等量蒸馏水灌胃。模型对照组：给予等量蒸馏水灌胃。g-csf阳性药对照组：30μg/kg(注射容积：0.1ml/10g)。中药复方颗粒剂高剂量组：给药剂量10.0g/kg体重。中药复方颗粒剂中剂量组：给药剂量5.0g/kg体重。中药复方颗粒剂低剂量组：给药剂量2.5g/kg体重。1.3.3.2观察指标及检测方法分别在照前、照后1、3、5、7、11、13、15、17、21天，每只小鼠尾静脉取血20μl。用sysmex-800自动血球计数仪检测外周血象。1.2.3造血祖细胞检测实验1.2.3.1分组及给药实验共分6组，分别为正常对照组、模型对照组、阳性药对照组、中药复方颗粒剂高剂量组、中药复方颗粒剂中剂量组、中药复方颗粒剂低剂量组。每组小鼠6只，雌性。中药复方颗粒剂药物组灌胃给药后2天，60co-γ射线3.5gy照射造模，造模后再连续给药7天，每天1次。正常组和模型组灌胃给予等体积的蒸馏水，阳性对照组皮下注射重组人粒细胞刺激因子注射液(g-csf)，连续7天，每天1次。正常对照组：给予等量蒸馏水灌胃。模型对照组：给予等量蒸馏水灌胃。g-csf阳性药对照组：30μg/kg(注射容积：0.1ml/10g)。中药复方颗粒剂高剂量组：给药剂量10.0g/kg体重。中药复方颗粒剂中剂量组：给药剂量5.0g/kg体重。中药复方颗粒剂低剂量组：给药剂量2.5g/kg体重。1.2.3.2集落培养(1)分别在造模后3天、7天2个时间点，每组每次取3只小鼠颈椎脱臼处死。将颈椎脱臼处死小鼠置75％酒精中浸泡片刻消毒，取下小鼠股骨，用rpmi1640培养液冲出骨髓细胞，过4号针头制成单细胞悬液，计数细胞并算出接种细胞悬液量，按接种有核细胞1×105/ml体系计算。(2)配粒系培养体系(马血清2ml；g-csf100ng；细胞1×105/ml；1640补至7.6ml)，用恒温水浴法在37℃条件下预热10min后加入5％煮沸琼脂0.5ml立即混匀，用5ml注射器边加边摇快速混匀。每皿滴入上述体系1ml，放一塑料盒中并放几个加水的平皿后，于37℃、5％co2的条件下培养6天观察计数，多于50个细胞为一个细胞集落。(3)配红系、混合系、巨核系培养体系(巯基乙醇1×10-4m0.2ml；3％l-谷氨酰胺0.03ml；马血清0.7ml；epo100u；il-360ng；il-1150ng；2.7％甲基纤维素0.7ml；细胞1×105/ml)，放于振荡器上振荡片刻，加入24孔板中，每孔0.2ml，于37℃、5％co2的条件下培养3天观察计数cfu-e、cfu-meg；培养6天观察计数bfu-e、cfu-mix。1.2.4cd34+细胞检测实验1.2.4.1分组及给药实验共分6组，分别为正常对照组、模型对照组、阳性药对照组、中药复方颗粒剂高剂量组、中药复方颗粒剂中剂量组、中药复方颗粒剂低剂量组。每组实验小鼠6只，雌性。中药复方颗粒剂药物组灌胃给药后2天，60co-γ射线3.5gy照射造模，造模后再连续给药7天，每天1次。正常组和模型组灌胃给予等体积的蒸馏水，阳性对照组皮下注射重组人粒细胞刺激因子注射液(g-csf)，连续7天，每天1次。正常对照组：给予等量蒸馏水灌胃。模型对照组：给予等量蒸馏水灌胃。g-csf阳性药对照组：30μg/kg(注射容积：0.1ml/10g)。中药复方颗粒剂高剂量组：给药剂量10.0g/kg体重。中药复方颗粒剂中剂量组：给药剂量5.0g/kg体重。中药复方颗粒剂低剂量组：给药剂量2.5g/kg体重。1.2.4.2观察指标及检测方法在造模后7天颈椎脱臼处死小鼠，用含0.2％牛血清白蛋白的pbs缓冲液冲出小鼠股骨骨髓细胞，取1×106个细胞加入30μl小鼠血清，反应10min，以封闭非特异结合位点，加入10μifitc标记的大鼠抗小鼠cd34抗体，对照管加入相应的对照抗体，4℃避光反应30min。加入2ml红细胞裂解液，作用5min，用含0.2％牛血清白蛋白和0.1％叠氮钠的pbs缓冲液洗细胞两次，加入终浓度为3μg/ml的pi染液，上机检测。1.2.5数据处理及统计输入所有动物不同时间的测量结果，计算各组均数、标准差及组间均数的显著性t检验。1.3试验结果1.3.1外周血象1.3.1.1外周血白细胞与正常对照组比较，照射对照组在造模后第1～21天白细胞数显著降低(p＜0.01～0.001)，说明造模成功。与照射对照组比较，阳性药组在造模后第1～17天(除3、11天)白细胞数显著升高(p＜0.05～0.001)；中药复方颗粒剂各剂量组均能升高白细胞数，高、中、低剂量组分别在造模后第5、7、13天，第13天，第13、17天显著促进白细胞数升高(p＜0.05～0.01)，结果见表1。表1中药复方颗粒剂对3.5gy60co-γ射线照射小鼠外周血白细胞(wbc1×109/l)的影响(n＝10，)注：与正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；与照射对照组比较，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.0011.3.1.2外周血红细胞与血红蛋白与正常对照组比较，造模后照射对照组的外周血红细胞、血红蛋白均有一定程度的下降，第3～21天血红细胞显著降低(p＜0.05～0.001)，第3～21天血红蛋白显著降低(第17天除外，p＜0.05～0.001)，说明造模成功。阳性药组和中药复方颗粒剂各剂量组的红细胞、血红蛋白在15或17天显著高于照射对照组(p＜0.05～0.01)，结果见表2、表3。表2中药复方颗粒剂对3.5gy60co-γ射线照射小鼠外周血红细胞(rbc1×1012/l)的影响(n＝10，)注：与正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；与照射对照组比较，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001表3中药复方颗粒剂对3.5gy60co-γ射线照射小鼠外周血血红蛋白(hgbg/l)的影响(n＝10，)注：与正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；与照射对照组比较，#p＜0.05，##p＜0.011.3.1.3血小板数照射对照组和用药组的血小板计数，在照射后1天呈下降，3～5天上升后又下降的趋势，照射后7天达最低值，此后缓慢回升。但中药复方颗粒剂各剂量组从照射后5天起较对照组恢复快，其中高剂量组在第5、11、13天；中剂量组在第13天明显高于照射对照组(p＜0.05～0.001)，结果见表4。表4中药复方颗粒剂对3.5gy60co-γ射线照射小鼠外周血血小板(plt1×109l)的影响(n＝10，)注：与正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；与照射对照组比较，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.0011.3.2造血祖细胞与照射对照组比较，阳性药与中药复方颗粒剂各剂量组在照射后3、7天均促进cfu-gm、cfu-e增殖(p＜0.05～0.001)；中药复方颗粒剂高、中剂量组在药后3、7天还促进cfu-meg、cfu-mix增殖(p＜0.05～0.01)，结果见表5。表5中药复方颗粒剂对3.5gy60co-γ射线照射小鼠造血祖细胞的影响(n＝3，)注：与正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；与照射对照组比较，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.0011.3.3cd34+细胞与正常对照组比较，照射对照组在造模后7天骨髓cd34+细胞显著降低(p＜0.01)，说明造模成功。照射模型组cd34+细胞数明显下降，阳性药治疗后cd34+细胞数显著上升，中药复方颗粒剂各剂量组均能升高小鼠骨髓中cd34+细胞数，其中，低剂量组与照射模型对照组相比有显著差异(p＜0.05)，结果见表6。表6中药复方颗粒剂对3.5gy60co-γ射线照射小鼠7天骨髓cd34+细胞的影响(n＝6，)注：与正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；与照射对照组比较，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001结果表明，中药复方颗粒剂各剂量组均能升高外周血白细胞数，促进cfu-gm、cfu-e、cfu-meg增殖，升高小鼠骨髓中cd34+细胞数，其中，高剂量组对外周血白细胞作用显著，高、中剂量组对骨髓造血干/祖细胞作用显著，低剂量组对cd34+细胞作用显著。2、中药复方颗粒剂防治60co-γ射线诱导大鼠再生障碍性贫血的药效学研究2.1试验材料大鼠：购自北京市华阜康生物科技股份有限公司。实施例1颗粒剂，药物浓度：每g中药复方颗粒剂相当于生药2.368g。注射用环磷酰胺：山西普德药业股份有限公司，0.2g/支。阳性药：司坦唑醇片(康力龙，临床可用于再生障碍性贫血治疗，可能使骨髓造血功能得到改善，特别是红细胞生成)，广西南宁百会药业集团有限公司，2mg/片。2.2试验方法2.2.1试验动物及适应性喂养sd大鼠80只，体重180～200g，购入后置于恒温(24±0.5℃)恒湿(50±10％)的动物房内适应性喂养1周，自由饮水、摄食。2.2.2试验分组及给药sd大鼠适应性喂养1周后，按体重随机分出10只为正常对照组。其余70只在北京大学化学所钴源室用60co-γ射线4.0gy照射，照射后大鼠状态显示不佳，蜷缩、活动减少。采用60co-γ射线4.0gy照射后，对存活大鼠随机按体重分为5组。本次实验总计分为6组：正常对照组、模型对照组、阳性药对照组、中药复方颗粒剂小剂量组、中药复方颗粒剂中剂量组、中药复方颗粒剂大剂量组。从第4d开始给予环磷酰胺25.0mg·kg-1腹腔注射，连续3天，制备再生障碍性贫血动物大鼠模型。连续注射环磷酰胺3天，于最后一次注射给药的当天，阳性药组按体重2.8mg/kg，中药复方颗粒剂小、中、大剂量组的给药剂量分别按体重：7.2g/kg、4.16g/kg、2.4g/kg灌胃，将药物溶于去离子水中，大鼠按体重1ml/100g灌胃，正常对照组、模型对照组给予相同的去离子水灌胃。2.2.3观察指标(1)对再障模型大鼠一般情况的影响：活动、饮食、二便、皮毛、腹泻、消瘦、发育、精神状态(2)对再障模型大鼠外周血象的影响：血wbc、rbc、hgb及pt等变化(3)对再障模型大鼠骨髓有核细胞数的影响：计数每根股骨大鼠骨髓有核细胞数(4)对再障模型大鼠免疫功能的影响①流式细胞术检测：cd3、cd4、cd8及cd4/cd8。②放射免疫法检测：tgf-β1、il-1、ifnγ、tnfα等。2.3试验结果2.3.1对再障模型大鼠一般情况的影响模型对照组大鼠活动、饮食减少，精神状态不佳，大便稀薄，小便时带血，皮毛竖起、消瘦、发育不良，体重减轻，耳、唇、甲部苍白，贫血情况明显。中药复方颗粒剂各剂量组的以上症状有不同程度的改善，尤其是贫血症状改善明显，体重明显增加，其中以中药复方颗粒剂中剂量组的大鼠状态为最佳。在造模和治疗过程中有部分动物死亡，各组大鼠存活情况，见表7。存活动物全部测定外周血像；考虑到实验操作可行性，并满足统计学的要求，从存活动物中每组随机选择6只测定骨髓有核细胞数、cd4、cd8、cd3、cd4/cd8、tgf-β1、il-1。2.3.2对再障模型大鼠外周血象的影响见表7表7中药复方颗粒剂对60co-γ射线诱导大鼠再生障碍性贫血外周血像的影响注：与正常对照组比，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型对照组比，*p＜0.05，**p＜0.01；与阳性药组比，△p＜0.05，△△p＜0.01。实验中60co-γ射线4.0gy照射结合环磷酰胺25.0mg·kg-1腹腔注射大鼠再生障碍性动物模型，外周血象全细胞wbc、rbc及hgb减少，分别与正常对照组比较，统计学处理有显著性差异(p＜0.01)，表明造模成功。中药复方颗粒剂各剂量组治疗后，外周血象显著增加，与模型对照组比较有显著性差异(p＜0.01)，中药复方颗粒剂与阳性药组比较，wbc指标，大、中剂量组有显著性差异(p＜0.05)，hgb指标，小剂量组有显著性差异(p＜0.05)，说明中药复方颗粒剂作用优于司坦唑醇片作用，中药复方颗粒剂治疗作用具有剂量依赖关系。2.3.3对再障模型大鼠骨髓有核细胞数的影响见表8表8中药复方颗粒剂对60co-γ射线诱导大鼠再生障碍性贫血骨髓有核细胞数的影响组别n骨髓有核细胞数×107正常对照组66.510±0.191模型对照组61.042±0.322##阳性药组64.632±0.473**小剂量组64.734±0.171**中剂量组64.470±0.369**大剂量组65.042±0.354**注：与正常对照组比，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型对照组比，*p＜0.05，**p＜0.01；与阳性药组比，△p＜0.05，△△p＜0.01。模型对照组动物，骨髓有核细胞明显降低，骨髓增生显著低下，与正常对照组比较，统计学有显著性差异(p＜0.01)，表明造模成功。中药复方颗粒剂各剂量组治疗后，骨髓有核细胞数显著增加，与模型对照组比有显著性差异(p＜0.01)。2.3.4对再障模型大鼠cd4、cd8、cd3、cd4/cd8的影响见表9表9中药复方颗粒剂对60co-γ射线诱导大鼠再生障碍性贫血cd4、cd8、cd3、cd4/cd8的影响注：与正常对照组比，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型对照组比，*p＜0.05，**p＜0.01；与阳性药组比，△p＜0.05，△△p＜0.01。模型对照组动物的外周血cd8、cd3、cd4/cd8与正常对照组比较，均有不同程度的增加，经统计学处理有显著性差异(p＜0.05)，表明造模成功。中药复方颗粒剂各剂量组治疗后可以明显降低，与模型对照组比较，有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，与阳性药组比较，无显著性差异；中药复方颗粒剂各剂量组治疗后，cd4可以明显升高，与模型对照组比较，除小剂量组外，有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，且中药复方颗粒剂治疗作用具有剂量依赖关系。2.3.5对再障模型大鼠血清tgf-β1、il-1的影响见表10表10中药复方颗粒剂对60co-γ射线诱导再生障碍性贫血大鼠血清tgf-β1、il-1的影响组别ntgf-β1il～1正常对照组613.839±0.4050.267±0.012模型对照组628.411±0.714##0.150±0.009##阳性药组617.646±0.605**0.214±0.005**颗粒剂小剂量组618.777±0.257**0.153±0.002△颗粒剂中剂量组613.421±1.277**△0.195±0.008*颗粒剂大剂量组616.658±1.080**0.209±0.006**注：与正常对照组比，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型对照组比，*p＜0.05，**p＜0.01；与阳性药组比，△p＜0.05，△△p＜0.01。模型对照组动物大鼠血清tgf-β1与正常对照组比较，显著增加，经统计学处理有显著性差异(p＜0.01)，il-1与正常对照组比较，显著降低，经统计学处理有显著性差异(p＜0.01)，表明造模成功。中药复方颗粒剂各剂量组治疗后，tgf-β1明显降低，与模型对照组比较，有显著性差异(p＜0.01)，与阳性药组比较，中剂量组有显著性差异(p＜0.05)；中药复方颗粒剂各剂量组治疗后，il-1明显升高，与模型对照组比较，中、高剂量组有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，与阳性药组比较，小剂量组有显著性差异(p＜0.05)；且中药复方颗粒剂治疗作用具有剂量依赖关系。2.3.6对再障模型大鼠血清ifn-γ、tnf-α的影响见表11表11中药复方颗粒剂对60co-γ射线诱导再生障碍性贫血大鼠血清ifn～γ、tnf-α的影响注：与正常对照组比，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型对照组比，*p＜0.05，**p＜0.01；与阳性药组比，△p＜0.05，△△p＜0.01。模型对照组动物大鼠血清ifn-γ、tnf-d与正常对照组比较，显著增加，经统计学处理有显著性差异(p＜0.01)，表明造模成功。与模型对照组比较，中药复方颗粒剂各剂量组治疗后明显降低ifn-γ、tnf-α，有显著性差异(p＜0.01)；与阳性药组比较，中药复方颗粒剂高剂量组有显著性差异(p＜0.05)，且中药复方颗粒剂治疗作用具有剂量依赖关系。实施例2～3的颗粒剂的类似药理学试验表明，与实施例1的颗粒剂没有明显差别。上述实施例仅例示性的说明了本发明，而非用于限制本发明。熟知本领域的技术人员应当理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，对本发明实施例所作的任何更改和变化均落在本发明的范围内。且本发明的保护范围应由所附的权利要求确定。当前第1页1 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