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您当前的位置： 光声响应型可编辑纳米探针、制备方法及其用途与流程
2021-01-08 11:01:02|
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本发明属于纳米生物技术领域，具体涉及一种光声响应型可编辑纳米探针、制备方法及其用途。
背景技术：
癌症已成为人类生命和健康的主要威胁之一，对癌症进行临川预先诊断和精准治疗是全世界一直关注的重要课题。
在癌症治疗的众多方法中，光动力治疗和声动力治疗由于不需要手术介入以及长期服用药物，因此已引起越来越多专家学者的兴趣，具有广阔的应用前景。金丝桃素是一种优良的光敏剂，在特定波长的照射下可以产生单线态氧，用于癌细胞的杀灭；此外，在特定的声波作用下，金丝桃素也可以产生大量的活性氧物种，具有穿透性强、安全性高、特异性好等优点。
但是在此过程中，由于环境中氧的不断消耗，会使产生的活性氧物种不断减少，使得光动力和声动力治疗的长效性降低；因此开发一种稳定性高、长效性好的光/声动力纳米诊疗剂具有重要的临床应用价值。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种光声响应型可编辑纳米探针、制备方法及其用途。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
本发明实施例提供一种光声响应型可编辑纳米诊疗探针，该探针由以下各项组成：
核为表面功能化sio2纳米球，所述表面功能化sio2纳米球内部镶嵌或包裹有功能纳米粒子；
中间为1,3-二环氧甘油醚甘油胺偶联的金丝桃素；
最外层为镶嵌血红蛋白的超分子聚合物囊泡。
上述方案中，所述表面功能化的、镶嵌或包裹有纳米粒子的sio2纳米球的核为通过物理、化学方法合成的多孔sio2微纳米粒子，其中可选择装载具有光热功能、荧光功能、药物的诊疗剂纳米粒子；表面修饰剂为具有硅烷氧基的硅烷偶联剂。
上述方案中，所述1,3-二环氧甘油醚甘油胺偶联的金丝桃素是通过1,3-二环氧甘油醚甘油胺和金丝桃素通过聚合反应形成；所述金丝桃素和1,3-二环氧甘油醚甘油胺的摩尔比为0.01～1。
上述方案中，所述超分子聚合物囊泡由血红蛋白和第一化合物通过自组装获得；所述第一化合物的分子式为
本发明实施例还提供一种如上述方案中任意一项所述的光声响应型可编辑纳米诊疗探针的制备方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1，金丝桃素和1,3-二环氧甘油醚甘油胺混合液的制备：1,3-二环氧甘油醚甘油胺加入到0.5ml的tris-hcl缓冲液中获得环氧甘油醚甘油胺的tris-hcl分散液，再将环氧甘油醚甘油胺的tris-hcl分散液和金丝桃素的dmso分散液混合，加热搅拌，获得第一分散液；
步骤2，功能化的sio2纳米粒子的表面偶联：将功能化的sio2纳米粒子的pbs分散液加热到至40℃，在搅拌下加入第一分散液，反应1～48h，离心提纯，将沉淀物重新分散在去离子水中，获得金丝桃素偶联的sio2纳米粒子分散液；
步骤3，囊泡前驱体的制备：将第一化合物分散在二甲基甲酰胺中,获得第二分散液；将血红蛋白分散在tris-hcl缓冲液中，加热到60℃，获得第三分散液；在氮气保护下，将所述第二分散液以0.6ml/h的速度加入第三分散液，反应10h，旋转蒸发，产物溶于甲醇中，渗析24h，然后真空冻干，获得囊泡前驱体；
步骤4，超分子聚合物囊泡的制备：向金丝桃素偶联的sio2纳米粒子分散液中加入含有第二化合物的去离子水分散液中，搅拌反应，通过超滤膜过滤将得到的产物重新分散在pbs中；在搅拌下加入囊泡前驱体分散液，反应10h，退货透析膜透析48h，获得纳米探针。
上述方案中，所述步骤1中，1,3-二环氧甘油醚甘油胺分散液的浓度为0.1～1m；金丝桃素的分散液的浓度为0.01～1m；金丝桃素和1,3-二环氧甘油醚甘油胺混合液中，金丝桃素和1,3-二环氧甘油醚甘油胺的摩尔比为0.01～1；加热的温度为30～50℃，搅拌时间为30min。
上述方案中，所述步骤2中，金丝桃素与sio2纳米粒子的质量比为1:200～1:10000。
上述方案中，所述步骤3中，第二分散液和第三分散液中第一化合物和血红蛋白的质量比为20:1～1:1。
上述方案中，所述步骤4中，含有第二化合物的去离子水分散液与金丝桃素偶联的sio2纳米粒子的质量比为1:5000～1:20000；超滤膜和透析膜的截留分子量(mwco)为100000；所述含有第二化合物的的分子式为
本发明实施例还提供一种光声响应型可编辑纳米探针，用于荧光标记、或者光/声动力治疗剂、或者纳米材料/药物载体的用途。
与现有技术相比，本发明利用多聚合技术将光敏剂金丝桃素偶联在硅烷化sio2多功能纳米粒子表面，使其具有更加稳定的理化结构；另外，利用开环聚合法制备聚合物囊泡，同时将具有氧输运功能的血红蛋白镶嵌其中，从而在光动力、声动力治疗过程中源源不断提供氧，进而实现长效治疗的目的；本发明提供的纳米探针可以根据需求来选择核心的功能纳米粒子，实现可编辑诊疗功能，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为根据本发明的一个实施方案的光声响应型可编辑纳米探针的tem照片；
图2为根据本发明的一个实施方案的光声响应型可编辑纳米探针的吸收谱；
图3为根据本发明的一个实施方案的光声响应型可编辑纳米探针的荧光谱；
图4为根据本发明的一个实施方案的光声响应型可编辑纳米探针孵育下4t1细胞的存活率曲线；
图5为根据本发明的一个实施方案的光声响应型可编辑纳米探针在光照条件下4t1细胞的存活率曲线；
图6为根据本发明的一个实施方案的光声响应型可编辑纳米探针在超声波处理下4t1细胞的存活率曲线活性氧物种相对含量。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种光声响应型可编辑纳米诊疗探针，该探针由以下各项组成：
核为表面功能化sio2纳米球，所述表面功能化sio2纳米球内部镶嵌或包裹有功能纳米粒子；
中间为1,3-二环氧甘油醚甘油胺偶联的金丝桃素；
最外层为镶嵌血红蛋白的超分子聚合物囊泡。
所述表面功能化的、镶嵌或包裹有纳米粒子的sio2纳米球的核为通过物理、化学方法合成的多孔sio2微纳米粒子，其中可选择装载具有光热功能、荧光功能、药物的诊疗剂纳米粒子；表面修饰剂为具有硅烷氧基的硅烷偶联剂。
所述光热功能采用au、cuxs等纳米粒子，所述荧光功能采用荧光分子、量子点、稀土发光纳米粒子，所述药物采用盐酸阿霉素；所述具有硅烷氧基的硅烷偶联剂采用3-氨丙基三乙氧基硅烷。
所述1,3-二环氧甘油醚甘油胺偶联的金丝桃素是通过1,3-二环氧甘油醚甘油胺和金丝桃素通过聚合反应形成；所述金丝桃素和1,3-二环氧甘油醚甘油胺的摩尔比为0.01～1。
所述超分子聚合物囊泡由血红蛋白和第一化合物通过自组装获得；所述第一化合物的分子式为
本发明实施例还提供一种光声响应型可编辑纳米诊疗探针的制备方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1，金丝桃素和1,3-二环氧甘油醚甘油胺混合液的制备：1,3-二环氧甘油醚甘油胺加入到0.5ml的tris-hcl缓冲液中获得环氧甘油醚甘油胺的tris-hcl分散液，再将环氧甘油醚甘油胺的tris-hcl分散液和金丝桃素的dmso分散液混合，加热搅拌，获得第一分散液；
具体地，1,3-二环氧甘油醚甘油胺分散液的浓度为0.1～1m；金丝桃素的分散液的浓度为0.01～1m；金丝桃素和1,3-二环氧甘油醚甘油胺混合液中，金丝桃素和1,3-二环氧甘油醚甘油胺的摩尔比为0.01～1；加热的温度为30～50℃，搅拌时间为30min。
步骤2，功能化的sio2纳米粒子的表面偶联：将功能化的sio2纳米粒子的pbs分散液加热到至40℃，在搅拌下加入第一分散液，反应1～48h，离心提纯，将沉淀物重新分散在去离子水中，获得金丝桃素偶联的sio2纳米粒子分散液；
具体地，金丝桃素与sio2纳米粒子的质量比为1:200～1:10000。
步骤3，囊泡前驱体的制备：将第一化合物分散在二甲基甲酰胺中,获得第二分散液；将血红蛋白分散在tris-hcl缓冲液中，加热到60℃，获得第三分散液；在氮气保护下，将所述第二分散液以0.6ml/h的速度加入第三分散液，反应10h，旋转蒸发，产物溶于甲醇中，渗析24h，然后真空冻干，获得囊泡前驱体；
具体地，第二分散液和第三分散液中第一化合物和血红蛋白的质量比为20:1～1:1。
步骤4，超分子聚合物囊泡的制备：向金丝桃素偶联的sio2纳米粒子分散液中加入含有第二化合物的去离子水分散液中，搅拌反应，通过超滤膜过滤将得到的产物重新分散在pbs中；在搅拌下加入囊泡前驱体分散液，反应10h，退货透析膜透析48h，获得纳米探针。
具体地，所述超滤膜和透析膜的截留分子量(mwco)为100000。
含有第二化合物的去离子水分散液与金丝桃素偶联的sio2纳米粒子的质量比为1:5000～1:20000；所述含有第二化合物的去离子水分散液的分子式为
本发明实施例提供的一种光声响应型可编辑纳米探针，用于荧光标记、或者光/声动力治疗剂、或者纳米材料/药物载体的用途。
实施例
实施例中sio2纳米球为多孔sio2纳米球，未进行功能纳米粒子镶嵌，其表面已使用3-氨丙基三乙氧基硅烷进行修饰；血红蛋白为牛血红蛋白，分子量64kda。
实施例1：
(1)将0.12mmol的1,3-二环氧甘油醚甘油胺加入到0.5ml的tris-hcl缓冲液中，在搅拌下加入浓度为0.01mol/l金丝桃素的dmso分散液中，控制反应温度与为40℃，使金丝桃素和1,3-二环氧甘油醚甘油胺的摩尔比为0.02，得到第一分散液。
(2)将浓度为2mmol/l的sio2纳米粒子的pbs分散液加热到50℃，在搅拌下加入第一分散液，使金丝桃素与sio2纳米粒子的质量比为1:1000，40℃反应48h。离心提纯，将沉淀物重新分散在去离子水中，得到金丝桃素偶联的sio2纳米粒子分散液。
(3)将0.1g第一化合物分散在3ml二甲基甲酰胺中,得到第二分散液。将血红蛋白在60℃分散在8ml的tris-hcl缓冲液中，得到第三分散液。在氮气保护下，将第二分散液以0.6ml/h的速度加入第三分散液，使第二分散液和第三分散液中第一化合物和血红蛋白的质量比为10:1，反应10h。将溶剂旋转蒸发，产物溶于甲醇中，渗析24h，然后真空冻干，得到囊泡前驱体。
(4)向金丝桃素偶联的sio2纳米粒子分散液中加入含有第二化合物的去离子水分散液中，使含有第二化合物的去离子水分散液与金丝桃素偶联的sio2纳米粒子的质量比为1:6000，搅拌反应，用超滤膜过滤(mwco＝100000)，将得到的产物重新分散在pbs中。在搅拌下加入浓度为0.2mol/l的囊泡前驱体的pbs分散液，使含有第二化合物的去离子水分散液与囊泡前驱体的质量比为1:20，反应10h。用透析膜(mwco＝100000)透析48h，得到最终的纳米探针。
实施例2
(1)将0.12mmol的1,3-二环氧甘油醚甘油胺加入到0.5ml的tris-hcl缓冲液中，在搅拌下加入浓度为0.01mol/l金丝桃素的dmso分散液中，控制反应温度与为40℃，使金丝桃素和1,3-二环氧甘油醚甘油胺的摩尔比为0.02，得到第一分散液。
(2)将浓度为2mmol/l的sio2纳米粒子的pbs分散液加热到50℃，在搅拌下加入第一分散液，使金丝桃素与sio2纳米粒子的质量比为1:1500，40℃反应48h。离心提纯，将沉淀物重新分散在去离子水中，得到金丝桃素偶联的sio2纳米粒子分散液。
(3)将0.1g第一化合物分散在3ml二甲基甲酰胺中,搅拌加热到60℃，加入0.01g氢化钾，反应1h，得到第二分散液。将血红蛋白在60℃分散在8ml的tris-hcl缓冲液中，得到第三分散液。在氮气保护下，将第二分散液以0.6ml/h的速度加入第三分散液，使第二分散液和第三分散液中第一化合物和血红蛋白的质量比为10:1，反应10h。将溶剂旋转蒸发，产物溶于甲醇中，渗析24h，然后真空冻干，得到囊泡前驱体。
(4)向金丝桃素偶联的sio2纳米粒子分散液中加入含有第二化合物的去离子水分散液中，使含有第二化合物的去离子水分散液与金丝桃素偶联的sio2纳米粒子的质量比为1:6000，搅拌反应，用超滤膜过滤(mwco＝100000)，将得到的产物重新分散在pbs中。在搅拌下加入浓度为0.2mol/l的囊泡前驱体的pbs分散液，使含有第二化合物的去离子水分散液与囊泡前驱体的质量比为1:20，反应10h。用透析膜(mwco＝100000)透析48h，得到最终的纳米探针。
实施例3
(1)将0.12mmol的1,3-二环氧甘油醚甘油胺加入到0.5ml的tris-hcl缓冲液中，在搅拌下加入浓度为0.01mol/l金丝桃素的dmso分散液中，控制反应温度与为40℃，使金丝桃素和1,3-二环氧甘油醚甘油胺的摩尔比为0.02，得到第一分散液。
(2)将浓度为2mmol/l的sio2纳米粒子的pbs分散液加热到50℃，在搅拌下加入第一分散液，使金丝桃素与sio2纳米粒子的质量比为1:1000，40℃反应48h。离心提纯，将沉淀物重新分散在去离子水中，得到金丝桃素偶联的sio2纳米粒子分散液。
(3)将0.1g第一化合物分散在3ml二甲基甲酰胺中,搅拌加热到60℃，加入0.01g氢化钾，反应1h，得到第二分散液。将血红蛋白在60℃分散在8ml的tris-hcl缓冲液中，得到第三分散液。在氮气保护下，将第二分散液以0.6ml/h的速度加入第三分散液，使第二分散液和第三分散液中第一化合物和血红蛋白的质量比为10:1，反应10h。将溶剂旋转蒸发，产物溶于甲醇中，渗析24h，然后真空冻干，得到囊泡前驱体。
(4)向金丝桃素偶联的sio2纳米粒子分散液中加入含有第二化合物的去离子水分散液中，使含有第二化合物的去离子水分散液与金丝桃素偶联的sio2纳米粒子的质量比为1:6500，搅拌反应，用超滤膜过滤(mwco＝100000)，将得到的产物重新分散在pbs中。在搅拌下加入浓度为0.2mol/l的囊泡前驱体的pbs分散液，使含有第二化合物的去离子水分散液与囊泡前驱体的质量比为1:40，反应10h。用透析膜(mwco＝100000)透析48h，得到最终的纳米探针。
实施例4
(1)将0.12mmol的1,3-二环氧甘油醚甘油胺加入到0.5ml的tris-hcl缓冲液中，在搅拌下加入浓度为0.01mol/l金丝桃素的dmso分散液中，控制反应温度与为40℃，使金丝桃素和1,3-二环氧甘油醚甘油胺的摩尔比为0.03，得到第一分散液。
(2)将浓度为2mmol/l的sio2纳米粒子的pbs分散液加热到50℃，在搅拌下加入第一分散液，使金丝桃素与sio2纳米粒子的质量比为1:4000，40℃反应48h。离心提纯，将沉淀物重新分散在去离子水中，得到金丝桃素偶联的sio2纳米粒子分散液。
(3)将0.1g第一化合物分散在3ml二甲基甲酰胺中,搅拌加热到60℃，加入0.01g氢化钾，反应1h，得到第二分散液。将血红蛋白在60℃分散在8ml的tris-hcl缓冲液中，得到第三分散液。在氮气保护下，将第二分散液以0.6ml/h的速度加入第三分散液，使第二分散液和第三分散液中第一化合物和血红蛋白的质量比为10:1，反应10h。将溶剂旋转蒸发，产物溶于甲醇中，渗析24h，然后真空冻干，得到囊泡前驱体。
(4)向金丝桃素偶联的sio2纳米粒子分散液中加入含有第二化合物的去离子水分散液中，使含有第二化合物的去离子水分散液与金丝桃素偶联的sio2纳米粒子的质量比为1:6500，搅拌反应，用超滤膜过滤(mwco＝100000)，将得到的产物重新分散在pbs中。在搅拌下加入浓度为0.2mol/l的囊泡前驱体的pbs分散液，使含有第二化合物的去离子水分散液与囊泡前驱体的质量比为1:40，反应10h。用透析膜(mwco＝100000)透析48h，得到最终的纳米探针。
实施例5
(1)将0.12mmol的1,3-二环氧甘油醚甘油胺加入到0.5ml的tris-hcl缓冲液中，在搅拌下加入浓度为0.01mol/l金丝桃素的dmso分散液中，控制反应温度与为45℃，使金丝桃素和1,3-二环氧甘油醚甘油胺的摩尔比为0.8，得到第一分散液。
(2)将浓度为2mmol/l的sio2纳米粒子的pbs分散液加热到50℃，在搅拌下加入第一分散液，使金丝桃素与sio2纳米粒子的质量比为1:1000，40℃反应48h。离心提纯，将沉淀物重新分散在去离子水中，得到金丝桃素偶联的sio2纳米粒子分散液。
(3)将0.1g第一化合物分散在3ml二甲基甲酰胺中,搅拌加热到60℃，加入0.01g氢化钾，反应1h，得到第二分散液。将血红蛋白在60℃分散在8ml的tris-hcl缓冲液中，得到第三分散液。在氮气保护下，将第二分散液以0.6ml/h的速度加入第三分散液，使第二分散液和第三分散液中第一化合物和血红蛋白的质量比为10:1，反应10h。将溶剂旋转蒸发，产物溶于甲醇中，渗析24h，然后真空冻干，得到囊泡前驱体。
(4)向金丝桃素偶联的sio2纳米粒子分散液中加入含有第二化合物的去离子水分散液中，使含有第二化合物的去离子水分散液与金丝桃素偶联的sio2纳米粒子的质量比为1:6500，搅拌反应，用超滤膜过滤(mwco＝100000)，将得到的产物重新分散在pbs中。在搅拌下加入浓度为0.2mol/l的囊泡前驱体的pbs分散液，使含有第二化合物的去离子水分散液与囊泡前驱体的质量比为1:40，反应10h。用透析膜(mwco＝100000)透析48h，得到最终的纳米探针。
实施例6
(1)将0.12mmol的1,3-二环氧甘油醚甘油胺加入到0.5ml的tris-hcl缓冲液中，在搅拌下加入浓度为0.01mol/l金丝桃素的dmso分散液中，控制反应温度与为45℃，使金丝桃素和1,3-二环氧甘油醚甘油胺的摩尔比为0.05，得到第一分散液。
(2)将浓度为2mmol/l的sio2纳米粒子的pbs分散液加热到50℃，在搅拌下加入第一分散液，使金丝桃素与sio2纳米粒子的质量比为1:1700，40℃反应48h。离心提纯，将沉淀物重新分散在去离子水中，得到金丝桃素偶联的sio2纳米粒子分散液。
(3)将0.1g第一化合物分散在3ml二甲基甲酰胺中,搅拌加热到60℃，加入0.01g氢化钾，反应1h，得到第二分散液。将血红蛋白在60℃分散在8ml的tris-hcl缓冲液中，得到第三分散液。在氮气保护下，将第二分散液以0.6ml/h的速度加入第三分散液，使第二分散液和第三分散液中第一化合物和血红蛋白的质量比为10:1，反应10h。将溶剂旋转蒸发，产物溶于甲醇中，渗析24h，然后真空冻干，得到囊泡前驱体。
(4)向金丝桃素偶联的sio2纳米粒子分散液中加入含有第二化合物的去离子水分散液中，使含有第二化合物的去离子水分散液与金丝桃素偶联的sio2纳米粒子的质量比为1:6500，搅拌反应，用超滤膜过滤(mwco＝100000)，将得到的产物重新分散在pbs中。在搅拌下加入浓度为0.2mol/l的囊泡前驱体的pbs分散液，使含有第二化合物的去离子水分散液与囊泡前驱体的质量比为1:40，反应10h。用透析膜(mwco＝100000)透析48h，得到最终的纳米探针。
所述诊疗一体化细胞纳米探针的性能测试：
对实施例1得到的探针的形貌进行tem观测，结果如图1所示。可以看到其尺寸分布均一，平均尺寸为38nm。
使用紫外-可见吸收光度计测试实施例2得到的探针的吸收谱，结果如图2所示，可以看到其在可见光波段有3个明显的吸收峰。
使用荧光光度计测试实施例3得到的探针的荧光谱，结果如图3所示，可以看到其在可见光波段有2个明显的发光峰。
采用本领域公知的方法对实施例4得到的探针的进行细胞存活率实验，结果如图4所示，可以看到，在探针与4t1细胞孵育18h后，细胞的存活率依然高于85％。
采用本领域公知的方法对实施例5得到的探针的进行光热实验，结果如图5所示，可以看到，在590nm激光照射下，探针浓度越高，对癌细胞的杀灭作用越强。
采用本领域公知的方法对实施例6得到的探针的进行光热实验，结果如图6所示，可以看到，在1mhz(2w/cm2)超声处理下，在4h时细胞中的活性氧累积达到最大。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。
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