一种基因激活型抗菌生物活性骨修复材料及其制备方法和应用与流程

本发明属于可降解生物医用材料技术领域，具体涉及一种基因激活型抗菌生物活性骨修复材料及其制备方法和应用。

背景技术：

基于micrornas的基因治疗是近年来组织再生领域一个持续的研究热点，高效、安全和多功能的载体的设计与开发是基因治疗的关键。目前最常用的载体是病毒性载体和传统的阳离子聚合物非病毒载体(脂质体和聚乙烯亚胺)，但是由于其大多不具备抗菌生物可降解能力并且存在致瘤性、免疫原性、包装能力有限、制备方法困难等潜在问题，所以基因治疗很难在临床广泛应用。然而基于多肽的非病毒载体能够很好的解决以上这些问题，并且合成简单、原材料生物相容性好、成本低廉，所以多肽非病毒载体的设计和开发在基因治疗中越来越受到人们的关注。

多肽在许多疾病的治疗中发挥着重要的作用，其中具有转运能力的小分子短肽被称为细胞跨膜肽，其由5-30个氨基酸残基组成，不仅能够自身穿透细胞膜还能以共价或非共价结合方式携带蛋白质、核酸和纳米颗粒等多种外源性物质进入细胞。目前最常用的是阳离子型跨膜肽，其富含精氨酸、赖氨酸和组氨酸的残基片段。其中，由微生物合成的天然跨膜多肽ε-聚赖氨酸(epl)，具有良好的生物相容性、生物降解性和广谱抗菌活性。基于epl的生物可降解支架和水凝胶已被用于抗感染、肿瘤治疗、促进伤口愈合和骨再生。由于epl自身与基因的结合能力有限，因此epl直接作为基因载体的应用受到了很大的限制。如果能够通过进一步修饰epl，使其表面电荷得到提高，在机体中的应用将会得到很大的提高。另外，甘油广泛存在于日常用品和人体中，具有良好的水溶性、可生物降解性、良好的生物相容性和低廉的价格，常用于生物材料的改性。到目前为止，基于epl和甘油的非病毒载体的研究还未被报道过。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种基因激活型抗菌生物活性骨修复材料的制备方法，该方法工艺简单，制得的聚合物在体内外均具有良好的生物相容性、稳定性和基因转染效率。

本发明的第二个目的在于提供一种基因激活型抗菌生物活性骨修复材料。

本发明的第三个目的在于所述基因激活型抗菌生物活性骨修复材料在制备促进成骨分化及骨缺损愈合中作为纳米复合物的应用。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种基因激活型抗菌生物活性骨修复材料的制备方法，包括以下步骤：

将甘油溶于氯仿中，加入三乙胺和丙烯酰氯进行取代反应，制得甘油-丙烯酰氯；所述甘油、无水氯仿、三乙胺和丙烯酰氯的摩尔比为1:(3～5):(3～5):(3～5)；

将ε-聚赖氨酸与所述甘油-丙烯酰氯进行迈克尔加成反应，ε-聚赖氨酸与甘油-丙烯酰氯的摩尔比为(3～5):1；反应得到甘油-聚赖氨酸聚合物；

将所述甘油-聚赖氨酸聚合物和mirna基因按照(0.8～50):1的质量比加入到hepes缓冲液中形成稳定的纳米复合物，即得到基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料。

作为本发明的进一步改进，所述取代反应温度为45～55℃，搅拌反应40～60小时。

作为本发明的进一步改进，得到甘油-聚赖氨酸聚合物的后处理方法为：

反应完毕后，依次用hcl、nahco3、h2o对混合物进行洗涤；将洗涤后的甘油-丙烯酰氯溶液进行旋蒸并储存在真空干燥器中。

作为本发明的进一步改进，所述迈克尔加成反应的温度为45～55℃，反应40～60小时。

作为本发明的进一步改进，甘油-聚赖氨酸聚合物采用透析管纯化，冷冻干燥得到。

作为本发明的进一步改进，所述hepes缓冲液的ph为7～7.5；所述纳米复合物是基因适宜温度的水浴中温育形成。

作为本发明的进一步改进，所述mirna基因为mir-29a，mir-29b，mir-26a，antimir-138，mir-21，mir-221，mir-103，mir-27a，mir-335，mir-22，mir-196，mir-17，mir-31，mir-133，mir-135，mir-378或mir-34。

作为本发明的进一步改进，所述甘油-丙烯酰氯的结构式为：

所述甘油-聚赖氨酸聚合物的结构式为：

一种基因激活型抗菌生物活性骨修复材料，由所述的制备方法制得。

所述的基因激活型抗菌生物活性骨修复材料在制备促进成骨分化及骨缺损愈合中作为纳米复合物的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明针对现有基因载体所存在的生物相容性差、稳定性不好，基因转染效率低等缺点，提供了一种基因激活型抗菌生物活性骨修复材料的制备方法，该方法以人体天然代谢产物甘油和丙烯酰氯为单体，通过取代反应得到甘油-丙烯酰氯(gta)；将该聚合物与ε-聚赖氨酸(epl)通过迈克尔加成反应，得到甘油-聚赖氨酸聚合物(gepl)。本发明的制备方法简单，且无有机溶剂残留，所使用的原料绿色环保、操作方便、成本低廉。实验结果证明：该方法制得的基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料(gepl-mirna)在体内外均具有良好的生物相容性，稳定性和较高的基因转染效率，能够有效的携带基因(mirna)进入细胞，并且表现出一定的生物学效应。本发明中所使用的甘油、丙烯酰氯和epl具有良好的生物相容性，抗菌性和降解性，通过引入甘油改性小分子，增加了epl的表面电荷，且甘油对于阳离子跨膜肽(epl)的修饰，可以降低其毒性，从而提高细胞兼容性和转染率，还可以增加阳离子跨膜肽在血浆中的稳定性，并减少复合物被网状内皮系统(res)清除，延长其在血液循环中滞留的时间。

本发明中所制备方法的基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料(gepl-mirna)，制备方法过程简单，原料环保，成本低廉可以有效的结合基因(mirna)，并且形成的复合物能够有效的防止基因被机体内的核酸酶降解，在聚阴离子(肝素钠)的作用下，基因又能有效的从材料中释放出来，gepl-mirna在体内外均表现出良好的生物相容性，稳定性以及较高的基因转染效率，同时，gepl-mirna也表现出良好的广谱抗菌性，因此该聚合物在基因治疗中有着很好的应用前景。

附图说明

图1是本发明合成的基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料中各单体以及聚合物的结构式；

图2是制得的gta改性小分子和gepl聚合物的1h-nmr图谱；

图3为本发明制得的基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料(gepl-mirna)的抗菌性能；

图4为本发明制得的基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料(gepl-mirna)对于脂肪间充质干细胞(adsc，图4a)和骨髓间充质干细胞(bmsc，图4b)的细胞毒性测定；

图5为本发明制得的基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料(gepl-mirna)的体外基因转染效果；

图6为本发明制得的基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料(gepl-mirna)的体内基因转染的生物学效果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本发明一种基因激活型抗菌生物活性骨修复材料的制备方法，包括以下步骤：

1)先将甘油加入氯仿中，室温搅拌溶解，再加入三乙胺，然后滴加丙烯酰氯于混合物中,并且四者的摩尔比例为1:(3～5):(3～5):(3～5)。随后将反应温度增加到45～55℃并搅拌40～60小时。反应完毕后，依次用不同的试剂对混合物进行洗涤。最后，将gta溶液进行旋蒸并储存在真空干燥器中，以备进一步使用；

2)将多肽ε-聚赖氨酸添加到45～55℃的去离子水中溶解搅拌，30分钟后，加入gta改性小分子并不断搅拌40～60小时，其中多肽ε-聚赖氨酸与gta的摩尔比例为(3～5):1。最后，用透析管(mwco1000)对得到的gepl聚合物进行3天的纯化。在冷冻干燥后，最终的gepl聚合物被收集和储存以供进一步使用；

3)将gepl聚合物和基因按照(0.8～50):1的质量比加入到10μl，50mm，ph为7～7.5的hepes缓冲液中，在37℃水浴中温育20～40分钟形成稳定的纳米复合物，得到基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料。

其中，聚合物的结构式为：

本发明致力于制备方法一种在体内外均具有良好的生物相容性、稳定性和较高基因转染效率的基因激活型抗菌生物活性骨修复材料，实现其能携带基因进入细胞并产生一定生物学效应。

ε-聚赖氨酸(epl)因为具有的生物降解性、良好的生物相容性、抗菌性以及低成本，已经广泛应用于食品，工业和医学等多个领域。然而epl自身正电荷较弱并且在血清环境中极其不稳定，导致其作为基因载体的应用受到了限制；甘油，是一种无毒性、无刺激性的小分子化合物，具有良好的亲水性和稳定性，如果用甘油修饰epl，就可以改善epl的稳定性，且甘油对于阳离子跨膜肽的修饰，可以降低其毒性和免疫原性，从而提高细胞兼容性和转染率，还可以增加阳离子跨膜肽在血浆中的稳定性，并减少复合物被网状内皮系统(res)清除，延长其在血液循环中滞留的时间；ε-聚赖氨酸(epl)含有氨基，使其具有一定的正电荷，可以与mirna之间微弱的结合，并且在血清环境不稳定，导致其转染效率很低。

因此，在本发明利用改性甘油对ε-聚赖氨酸(epl)的迈克尔加成反应得到gepl聚合物，随后gepl与mirna在适宜的条件下形成了基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料(gepl-mirna)，gepl-mirna不仅在体内外均具有良好的生物相容性，稳定性和较高基因转染效率，而且具有优异的广谱抗菌性能，能够在体内应用时减低感染的风险，是一种用于基因治疗的基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料。

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

1)gta改性小分子的制备方法：将先将10mmol甘油加入40ml无水氯仿中，室温搅拌溶解，再加入45mmol三乙胺。然后冰浴条件下滴加45mmol丙烯酰氯于混合物中。将反应温度增加到50℃并搅拌48小时。反应完毕后，依次用hcl、nahco3、h2o对混合物进行洗涤。最后，将gta溶液进行旋蒸并储存在真空干燥器中，以备进一步使用；

2)gepl聚合物的制备方法：将10mmolε-聚赖氨酸添加到50℃的去离子水中溶解搅拌，30分钟后，加入3mmolgta改性小分子并不断搅拌48小时。最后，用透析管(mwco1000)对得到的gepl聚合物进行3天的纯化。在冷冻干燥后，最终的gepl聚合物被收集和储存以供进一步使用；

3)基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料：将gepl聚合物和基因(mirna)按照30:1的质量比加入到10μl，50mm，ph为7.4的hepes缓冲液中，在37℃水浴中温育30分钟形成稳定的纳米复合物，得到基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料。

本发明所制备方法的基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料(gepl-mirna)可以有效的结合基因(mirna)，并且形成的复合物能够有效的防止基因被机体内的核酸酶降解，在聚阴离子(肝素钠)的作用下，基因又能有效的从材料中释放出来，gepl-mirna不仅在体内外均表现出良好的生物相容性，稳定性以及较高的基因转染效率，同时，gepl-mirna也表现出广谱的抗菌性能，这使得在体内应用基因转染过程大大减少了感染的风险能，下面结合实验数据详细分析。

图1是本发明实施例1合成的基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料中各种单体以及聚合物的结构式，其中a为甘油的结构式，b为丙烯酰氯结构式，c为ε-聚赖氨酸的结构式，d为甘油改性小分子(gta)的结构式，e为gepl聚合物的结构式。

图2是制得的甘油改性小分子(gta)和gepl聚合物的1h-nmr图谱，从图2a中可以看出，次甲基(-ch-)和亚甲基(-ch2)的多重峰分别位于5.4和4.3-4.4ppm归属于甘油，-ch2＝ch-的多重峰分别位于5.9，6.1和6.4ppm归属于丙烯酰氯，这些峰的出现标志成功地合成了gta改性小分子。此外，图2b中，1.2、1.4和1.7ppm的为epl的亚甲基峰(-ch2)，而2.3和2.7ppm的质子峰(-hn-ch2-coo-)的出现说明epl已成功接枝到gta改性小分子上并形成了新的gepl聚合物。

图3为本发明制得的基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料(gepl-mirna)的广谱抗菌性能。从图3可以看出epl和gepl对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌)有99.99％的杀伤率，表明gepl具有良好的广谱抗菌性能。gepl在合成过程中没有破坏epl的抗菌能力。

图4为本发明制得的基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料(gepl-mirna)对于脂肪间充质干细胞(adsc，图4a)和骨髓间充质干细胞(bmsc，图4b)细胞毒性的测定。可以看出，与pei25kd-mirna相比gepl-mirna的细胞毒性特别低，生物相容性较好。

图5为本发明制得的基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料(gepl-mirna)的体外基因转染结果。图5a蓝光表示细胞核，图5b绿光是mirna转染后在细胞中表达的一种绿色荧光蛋白，图5c是图5a和b的合并图，图5d是单细胞放大图。可以看出，gepl聚合物可以携带基因顺利进入细胞并使基因表达，这些结果为gepl聚合物有望作为一种基因载体提供了可能。

图6为本发明制得的基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料(gepl-mirna)的体内转染mir-29b基因的生物学结果。这是大鼠颅骨双侧各3mm缺损处在注射gepl-mir-29b复合物12周后的micro-ct图片。从图片中我们可以清楚的看到gepl-mir-29b复合物这组的缺损几乎已被完全修复，然而空白组，epl和脂质体组还存在明显的缺损。这些结果为gepl聚合物有望作为一种临床使用的基因载体提供了可能。

实施例2

1)gta改性小分子的制备方法：将先将10mmol甘油加入35ml无水氯仿中，室温搅拌溶解，再加入50mmol三乙胺。然后冰浴条件下滴加45mmol丙烯酰氯于混合物中。将反应温度增加到45℃并搅拌60小时。反应完毕后，依次用hcl、nahco3、h2o对混合物进行洗涤。最后，将gta溶液进行旋蒸并储存在真空干燥器中，以备进一步使用；

2)gepl聚合物的制备方法：将10mmolε-聚赖氨酸添加到50℃的去离子水中溶解搅拌，30分钟后，加入2.8mmolgta改性小分子并不断搅拌48小时。最后，用透析管(mwco1000)对得到的gepl聚合物进行3天的纯化。在冷冻干燥后，最终的gepl聚合物被收集和储存以供进一步使用；

3)基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料：将gepl聚合物和基因(mirna)按照20:1的质量比加入到10μl，50mm，ph为7.0的hepes缓冲液中，在37℃水浴中温育30分钟形成稳定的纳米复合物，得到基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料。

实施例3

1)gta改性小分子的制备方法：将先将10mmol甘油加入45ml无水氯仿中，室温搅拌溶解，再加入40mmol三乙胺。然后冰浴条件下滴加40mmol丙烯酰氯于混合物中。将反应温度增加到55℃并搅拌40小时。反应完毕后，依次用hcl、nahco3、h2o对混合物进行洗涤。最后，将gta溶液进行旋蒸并储存在真空干燥器中，以备进一步使用；

2)gepl聚合物的制备方法：将10mmolε-聚赖氨酸添加到55℃的去离子水中溶解搅拌，30分钟后，加入2.5mmolgta改性小分子并不断搅拌40小时。最后，用透析管(mwco1000)对得到的gepl聚合物进行3天的纯化。在冷冻干燥后，最终的gepl聚合物被收集和储存以供进一步使用；

3)基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料：将gepl聚合物和基因(mirna)按照10:1的质量比加入到10μl，50mm，ph为7.5的hepes缓冲液中，在37℃水浴中温育30分钟形成稳定的纳米复合物，得到基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料。

实施例4

1)gta改性小分子的制备方法：将先将10mmol甘油加入40ml无水氯仿中，室温搅拌溶解，再加入35mmol三乙胺。然后冰浴条件下滴加35mmol丙烯酰氯于混合物中。将反应温度增加到50℃并搅拌48小时。反应完毕后，依次用hcl、nahco3、h2o对混合物进行洗涤。最后，将gta溶液进行旋蒸并储存在真空干燥器中，以备进一步使用；

2)gepl聚合物的制备方法：将10mmolε-聚赖氨酸添加到50℃的去离子水中溶解搅拌，30分钟后，加入2.2mmolgta改性小分子并不断搅拌48小时。最后，用透析管(mwco1000)对得到的gepl聚合物进行3天的纯化。在冷冻干燥后，最终的gepl聚合物被收集和储存以供进一步使用；

3)基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料：将gepl聚合物和基因(mirna)按照0.8:1的质量比加入到10μl，50mm，ph为7.2的hepes缓冲液中，在37℃水浴中温育25分钟形成稳定的纳米复合物，得到基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料。

实施例5

1)gta改性小分子的制备方法：将先将10mmol甘油加入50ml无水氯仿中，室温搅拌溶解，再加入45mmol三乙胺。然后冰浴条件下滴加50mmol丙烯酰氯于混合物中。将反应温度增加到50℃并搅拌48小时。反应完毕后，依次用hcl、nahco3、h2o对混合物进行洗涤。最后，将gta溶液进行旋蒸并储存在真空干燥器中，以备进一步使用；

2)gepl聚合物的制备方法：将10mmolε-聚赖氨酸添加到50℃的去离子水中溶解搅拌，30分钟后，加入2mmolgta改性小分子并不断搅拌48小时。最后，用透析管(mwco1000)对得到的gepl聚合物进行3天的纯化。在冷冻干燥后，最终的gepl聚合物被收集和储存以供进一步使用；

3)基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料：将gepl聚合物和基因(mirna)按照50:1的质量比加入到10μl，50mm，ph为7.3的hepes缓冲液中，在37℃水浴中温育20分钟形成稳定的纳米复合物，得到基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料。

本发明中所制备方法的基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料(gepl-mirna)，制备方法过程简单，原料环保，成本低廉可以有效的结合基因(mirna)，并且形成的复合物能够有效的防止基因被机体内的核酸酶降解，在聚阴离子(肝素钠)的作用下，基因又能有效的从材料中释放出来，gepl-mirna在体内外均表现出良好的生物相容性，稳定性以及较高的基因转染效率，同时，gepl-mirna也表现出良好的广谱抗菌性，因此该聚合物体在基因治疗中有着很好的应用前景。

本发明还具有以下优点：

(1)本发明所使用的甘油是一种广泛应用于食品，工业和医疗的添加剂，其生物相容性良好，环境友好且廉价易得。

(2)本发明中ε-聚赖氨酸(epl)的与甘油接枝后，能够有效的提高ε-聚赖氨酸通过静电作用结合基因(mirna)，并且稳定地进入细胞内，最终达到较高的基因转染效果。

(4)本发明中制备方法的基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料(gepl-mirna)具有广谱的抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的能力。

(5)本发明中使用的溶剂为去离子水，所制备方法的基因激活型抗菌生物活性材料骨修复材料(gepl-mirna)不存在任何的有机溶剂。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除