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2021-01-08 11:01:30|
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本申请是2015年1月15日提交的同名发明专利申请201580005247.5的分案申请。
发明领域
本发明涉及活化的肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)血清型10a、22f或33f多糖及其制备方法。本发明还涉及包含共价连接于载体蛋白的肺炎链球菌血清型10a、22f或33f多糖的免疫原性缀合物、其制备方法以及包含其的免疫原性组合物和疫苗。
背景
肺炎链球菌为革兰阳性、柳叶刀形球菌，其通常被成对地(双球菌)看见，但也呈短链或作为单个细胞存在。它们容易在血液琼脂板上以闪光菌落生长，并且展示α溶血作用，除非厌氧生长(其中它们显示β溶血作用)。大多数肺炎球菌血清型的细胞具有作为围绕每一个细胞的多糖包衣的荚膜。该荚膜是在人中的毒力的决定子，因为它通过阻止抗体附着于细菌细胞来干扰吞噬作用。目前存在超过90种已鉴定的已知的肺炎球菌荚膜血清型，其中23种最常见的血清型导致世界范围内约90％的侵袭性疾病。作为疫苗，肺炎球菌多糖包衣可在具有发达的或健全的免疫系统的个体中赋予合理程度的针对肺炎链球菌的免疫，但缀合于合适的载体蛋白的荚膜多糖允许在还处于肺炎球菌感染的最高风险的婴儿和老人中产生免疫应答。
由于在2000年引入第一种7-价肺炎球菌缀合物疫苗(pcv7或prevnar)，来自七种血清型(4、6b、9v、14、18c、19f和23f)的侵袭性疾病已几乎消失。血清型1、3、5、6a、7f和19a在prevnar13中的添加进一步减少了侵袭性肺炎球菌疾病的数量。
目前市售的肺炎球菌疫苗均未在人中，尤其是不足2岁的儿童中提供针对血清型10a、22f或33f肺炎链球菌的适当保护。因此，存在对可用于诱导针对血清型10a、22f或33f肺炎链球菌的免疫应答的免疫原性组合物的需要。
发明概述
在一个方面，本公开内容提供了用于制备活化的肺炎链球菌血清型10a、22f或33f荚膜多糖的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将分离的血清型10a、22f或33f荚膜多糖与氧化剂反应；和
(b)通过添加猝灭剂来猝灭氧化反应，从而导致活化的肺炎链球菌血清型10a、22f或33f多糖。
在其它方面，本发明涉及通过或可通过本文中公开的活化方法获得的活化的肺炎链球菌血清型10a、22f或33f荚膜多糖。
在其它方面，本公开内容提供了用于制备包含共价连接于载体蛋白的肺炎链球菌血清型10a、22f或33f多糖的免疫原性缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将通过或可通过本文中公开的方法获得的活化的血清型10a、22f或33f多糖与载体蛋白混合；和，
(b)将混合的活化的血清型10a、22f或33f多糖和载体蛋白与还原剂反应，以形成血清型10a、22f或33f多糖:载体蛋白缀合物。
在其它方面，本公开内容提供了通过或可通过本文中公开的方法获得的血清型10a、22f或33f多糖:载体蛋白缀合物。
在其它方面，本公开内容提供了包含本文中公开的免疫原性缀合物的免疫原性组合物和疫苗。
在其它方面，本公开内容提供了治疗或预防受试者的与血清型10a、22f或33f肺炎链球菌相关的肺炎链球菌感染、疾病或病况的方法，所述方法包括施用治疗或预防有效量的本文中公开的免疫原性组合物或疫苗的步骤。
附图简述
图1显示肺炎链球菌荚膜多糖血清型10a重复单元的结构。
图2显示肺炎链球菌荚膜多糖血清型22f重复单元的结构。
图3显示肺炎链球菌荚膜多糖血清型33f重复单元的结构。
图4显示在23℃下在利用和不利用猝灭步骤的情况下作为氧化剂的量的函数的活化的血清型22f多糖的分子量。
图5显示在4℃下在利用和不利用猝灭步骤的情况下作为氧化剂的量的函数的活化的血清型22f多糖的分子量。
图6显示在2至8℃下在利用或不利用猝灭步骤的情况下或在23℃下在不利用猝灭步骤的情况下作为氧化剂的量的函数的活化的血清型33f多糖的分子量。
发明详述
通过参考本发明的优选实施方案和本文包括的实施例的以下详细描述可更容易地理解本发明。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的领域中的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然可以在本发明的实践或测试中使用与本文所述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但本文中描述了某些优选方法和材料。在描述实施方案和主张本发明中，将按照下文所示的定义使用某些术语。
如本文中所用，除非另有说明，否则单数形式“一个/种(a)”，“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数所指物。因此，例如，对“方法”的引用包括本文所述的和/或在阅读本公开内容后对于本领域普通技术人员来说将变得明显的类型的一个或多个方法和/或步骤。
如本文中所用，术语多糖或载体蛋白-多糖缀合物的“分子量”是指通过与多角度激光散射检测器(malls)组合的尺寸排阻层析(sec)计算的分子量。
如本文中所用，术语“氧化程度”(do)是指当用氧化剂活化分离的多糖时产生的每醛基的糖重复单元的数目。可使用本领域中技术人员已知的常规方法测定多糖的氧化程度。
应当指出的是，在本公开内容中，术语如“包含”、“包括”、“含有”、“具有”、“拥有”等可以具有在美国专利法中赋予它们的含义；例如，它们可意指“包括”、“包含”、“含有”等。这样的术语是指特定成分或成分的组的包含，而不排除任何其它成分。术语诸如“基本上由......组成”和“基本上由……构成”具有在美国专利法中赋予它们的含义，例如，它们允许包含不减损本发明的新型或基本特征的另外的成分或步骤，即，它们排除减损本发明的新型或基本特征的另外的未引述的成分或步骤。术语“由…组成”和“由......构成”具有在美国专利法中赋予它们的含义；即，这些术语是封闭式的。因此，这些术语是指特定成分或成分的组的包含以及排除所有其它组分。
如本文中所用，术语“缀合物”或“糖缀合物”是指共价缀合于载体蛋白的多糖。本发明的糖缀合物和包含其的免疫原性组合物可含有一定量的游离多糖。
如本文所用，术语“血清型10a糖缀合物”或“血清型10a缀合物”是指共价缀合于载体蛋白的分离的肺炎链球菌血清型10a荚膜多糖。
如本文中所用，术语“血清型22f糖缀合物”或“血清型22f缀合物”是指共价缀合于载体蛋白的分离的肺炎链球菌血清型22f荚膜多糖。
如本文中所用，术语“血清型33f糖缀合物”或“血清型33f缀合物”是指共价缀合于载体蛋白的分离的肺炎链球菌血清型33f荚膜多糖。
如本文中所用，术语“血清型10a多糖”是指肺炎链球菌血清型10a荚膜多糖。
如本文中所用，术语“血清型22f多糖”是指肺炎链球菌血清型22f荚膜多糖。
如本文中所用，术语“血清型33f多糖”是指肺炎链球菌血清型33f荚膜多糖。
如本文中所用，术语“游离多糖”意指未共价缀合于载体蛋白，但仍然存在于荚膜多糖-载体蛋白缀合物组合物中的荚膜多糖。游离多糖可与多糖-载体蛋白缀合物非共价地缔合(即，非共价结合于、吸附于或捕捉于或与其非共价结合、吸附或捕捉)。
在血清型10a、22f或33f荚膜多糖-载体蛋白缀合物的最终纯化后，测量游离多糖的百分比。优选地在最终纯化后4周内测定其。将其表达为样品中的总多糖的百分比。
如本文中所用，“缀合”、“被缀合”和“缀合的”是指籍以将肺炎链球菌荚膜多糖籍共价连接于载体蛋白的方法。
术语“受试者”是指哺乳动物，包括人，或指鸟、鱼、爬行类动物、两栖动物或任何其它动物。术语“受试者”还包括家庭宠物或研究动物。家庭宠物和研究动物的非限制性实例包括：狗、猫、猪、兔、大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、豚鼠、雪貂、猴、鸟、蛇、蜥蜴、鱼、龟和蛙。术语“受试者”还包括家畜动物。家畜动物的非限制性例子包括：羊驼、美洲野牛、骆驼、牛、鹿、猪、马、驼马、骡、驴、绵羊、山羊、兔、驯鹿、牦牛、鸡、鹅和火鸡。
在用于预防由生物肺炎链球菌(也称为肺炎球菌)引起的侵袭性疾病的多价缀合肺炎球菌疫苗的制备中，将选定的肺炎链球菌血清型生长以提供产生疫苗所需的多糖。将细胞在发酵罐中生长，在发酵结束时通过添加脱氧胆酸钠或替代裂解剂来诱导裂解。随后收获裂解肉汤以用于下游纯化和包围细菌细胞的荚膜多糖的回收。在活化和与载体蛋白缀合后，多糖被包含在最终的疫苗产品中，并且在疫苗的目标人群中赋予针对所选定的肺炎链球菌血清型的免疫。
多糖:载体蛋白缀合物的免疫原性取决于几个因素，包括多糖的大小。多糖大小是在每一个制备批次中测定的质量属性，并且必须受到适当地控制。高分子量荚膜多糖因存在于抗原表面上的表位的较高效价而能够诱导一定的抗体免疫应答。通常优选在缀合物的制备过程中防止或限制多糖大小的不期望的减小，以保留多糖的免疫原性。此外，重要的是在活化步骤和随后的缀合过程中减小多糖分子量的批次间的变化性，以维持缀合物的质量属性的一致性。
还原胺化化学(rac)已被本发明人证明为用于制备肺炎链球菌血清型10a、22f或33f荚膜多糖-蛋白载体缀合物的合适方法。rac法牵涉通过氧化活化多糖和随后通过还原缀合活化的多糖与蛋白质载体。血清型10a、33f和22f多糖已被证明是特别敏感的多糖并且在缀合物的制备的氧化步骤过程中易受降解和大小减小。另外，迄今已知的活化方法的使用产生了具有可变分子量的活化血清型10a、33f和22f多糖。
因此，存在对用于制备具有受控和一致的分子量的活化的肺炎链球菌血清型10a、22f或33f多糖的方法的重要需要。
本发明的目的是用于制备活化的肺炎链球菌血清型10a、22f或33f多糖的方法。具体地，本发明的目的是用于制备活化的肺炎链球菌血清型10a、22f或33f多糖的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将分离的血清型10a、22f或33f多糖与氧化剂反应；和，
(b)通过添加猝灭剂来猝灭氧化反应，从而导致活化的肺炎链球菌血清型10a、22f或33f多糖。
血清型10a、22f或33f多糖的分离和纯化
血清型10a、22f和33f多糖的结构公开于文献中(参见例如kamerlingjpc.pneumococcalpolysaccharides:achemicalview.in:tomasza,editor.streptococcuspneumoniae,molecularbiologyandmechanismsofdisease.newyork,n.y:maryannliebert,inc.；2000.第81–114页)中。
如在图1中所示，血清型22f的多糖重复单元由分枝多糖骨架(一个葡糖醛酸(glcpa)、一个吡喃葡萄糖(glcp)和一个呋喃半乳糖(galf)以及两个吡喃鼠李糖(rhap))组成，其中αglcp分支连于βrhap45的c3羟基。多糖重复单元中的βrhap残基的约80％的c2羟基是o-乙酰化的。
如在图2中所示，血清型10a的多糖重复单元由两个d-呋喃半乳糖、三个d-吡喃半乳糖、一个n-乙酰半乳糖胺以及通过一个d-核糖醇与糖链连接的磷酸键组成。
如在图3中所示，血清型33f的多糖重复单元由三个d-吡喃半乳糖、二个d-呋喃半乳糖和一个d-吡喃葡萄糖组成。值得注意的是，在约90％的33f多糖重复单元中5-d-呋喃半乳糖残基是o-乙酰化的。
可使用本领域普通技术人员已知的分离方法(参见例如美国专利申请公开号20060228380、20060228381、20070184071、20070184072、20070231340和20080102498或wo2008118752中公开的方法)直接从细菌获得血清型10a、22f和33f荚膜多糖。另外，可使用合成方案产生它们。
用于产生用于本发明的免疫原性缀合物的各自多糖的血清型10a、22f和33f肺炎链球菌菌株可从已建立的培养物保藏或临床样品获得。
纯化的血清型10a、22f和33f多糖通过本领域技术人员公知的方法获得。优选将细菌细胞在基于大豆的培养基中生长。在产生肺炎链球菌血清型10a、22f或33f荚膜多糖的细菌细胞的发酵后，裂解所述细菌细胞以产生细胞裂解物。使用任何裂解剂裂解细菌细胞。“裂解剂”是有助于细胞壁破裂和释放引起细胞裂解的自溶素的任何试剂，包括例如，去垢剂。如本文中所用，“去垢剂”是指能够诱导细菌细胞的裂解的任何阴离子或阳离子去垢剂。用于在本发明的方法内使用的这样的去垢剂的代表性的实例包括脱氧胆酸钠(doc)、n-月桂酰肌氨酸、鹅脱氧胆酸钠和皂苷。
在本发明的一个实施方案中，用于裂解细菌细胞的裂解剂是doc。doc是胆汁酸脱氧胆酸的钠盐，其通常来源于生物来源诸如母牛或牛。doc活化lyta蛋白，所述lyta蛋白为参与肺炎链球菌的细胞壁生长和分裂的自溶素。lyta蛋白在其c末端部分具有胆碱结合结构域，并且已知lyta基因的突变产生抵抗使用doc的裂解的lyta突变体。
在本发明的一个实施方案中，用于裂解细菌细胞的裂解剂是非动物来源的裂解剂。用于在本发明的方法内使用的非动物来源的裂解剂包括来自非动物来源的具有与doc的作用模式(即，影响lyta功能并导致肺炎链球菌细胞的裂解)类似的作用模式的试剂。这样的非动物来源的裂解剂包括，但不限于，doc的类似物、表面活性剂、去垢剂和胆碱的结构类似物。在一个实施方案中，非动物来源的裂解剂选自癸烷磺酸、叔-辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇(例如
随后可使用本领域中已知的纯化技术从细胞裂解物纯化荚膜多糖，所述技术包括离心、深度过滤、沉淀、超滤、利用活性碳的处理、渗滤和/或柱层析的使用(参见例如美国专利申请公开号20060228380、20060228381、20070184071、20070184072、20070231340和20080102498或wo2008118752)。随后可将纯化的血清型10a、22f或33f多糖用于免疫原性缀合物的制备。
优选地，为了产生具有有利的过滤性特征和/或产率的血清型22f缀合物或血清型33f缀合物，在缀合于载体蛋白之前进行多糖至较低分子量(mw)范围的裁剪。有利地，减小纯化的血清型22f多糖或血清型33f多糖的大小，同时保留多糖结构的关键特征，诸如例如o-乙酰基的存在。优选地，纯化的血清型22f多糖或血清型33f多糖的大小通过机械均化来减小。
在优选实施方案中，通过高压均化来减小纯化的多糖的大小。高压均化通过将加工流泵送通过具有足够小的尺寸的流路来实现高剪切率。剪切率通过使用较大的施加的均化压力来增加，并且可通过使进料流再循环通过均化器来增加暴露时间。
高压均化方法特别适合用于减小纯化的血清型22f多糖或血清型33f多糖的大小，同时保留多糖的结构特征，诸如o-乙酰基的存在。
可通过不同的参数(包括例如分子量、每mm血清型22f多糖的醋酸盐的mm数)来表征通过从肺炎链球菌裂解物纯化血清型22f荚膜多糖和任选地裁剪纯化的多糖获得的分离的血清型22f多糖。
在优选实施方案中，经裁剪的血清型22f多糖具有400kda与700kda之间的分子量。
可通过不同的参数(包括例如分子量和每mm血清型33f多糖的醋酸盐的mm数)来表征通过从肺炎链球菌裂解物纯化血清型33f荚膜多糖和任选地裁剪纯化的多糖获得的分离的血清型33f多糖。
可通过本领域已知的任何方法，例如，通过质子nmr(lemercinier和jones(1996)carbohydrateresearch296；83-96,jones和lemercinier(2002)j.pharmaceuticalandbiomedicalanalysis30；1233-1247,wo05/033148或wo00/56357)测定多糖的o-乙酰化的程度。另一种常用的方法描述于hestrin(1949)j.biol.chem.180；249-261中。优选地，o-乙酰基的存在通过离子hplc分析来测定。
在优选实施方案中，通过包括以下步骤的方法获得分离的血清型22f多糖：
-制备血清型22f肺炎链球菌细菌细胞的发酵培养物；
-裂解所述发酵培养物中的细菌细胞；和，
-从发酵培养物纯化血清型22f多糖。
在优选实施方案中，通过包括以下步骤的方法获得分离的血清型22f多糖：
-制备血清型22f肺炎链球菌细菌细胞的发酵培养物；
-裂解所述发酵培养物中的细菌细胞；
-从发酵培养物纯化血清型22f多糖；和，
-通过机械裁剪，优选通过高压均化来裁剪血清型22f多糖。
在优选实施方案中，分离的血清型22f多糖通过包含以下步骤的方法获得：
-制备血清型22f肺炎链球菌细菌细胞的发酵培养物；
-裂解所述发酵培养物中的细菌细胞；
-从发酵培养物纯化血清型22f多糖；和
-通过机械裁剪，优选通过高压均化来裁剪血清型22f多糖，
其中所述分离的血清型22f多糖具有400kda与700kda之间的分子量。
在优选实施方案中，通过包括以下步骤的方法获得分离的血清型33f多糖：
-制备血清型33f肺炎链球菌细菌细胞的发酵培养物；
-裂解所述发酵培养物中的细菌细胞；和，
-从发酵培养物纯化血清型33f多糖。
在优选实施方案中，通过包括以下步骤的方法获得分离的血清型33f多糖：
-制备血清型33f肺炎链球菌细菌细胞的发酵培养物；
-裂解所述发酵培养物中的细菌细胞；
-从发酵培养物纯化血清型33f多糖；和，
-通过机械裁剪，优选通过高压均化来裁剪血清型33f多糖。
可通过不同的参数(包括例如分子量)来表征通过从肺炎链球菌裂解物纯化血清型10a荚膜多糖和任选地裁剪纯化的多糖获得的分离的血清型10a多糖。优选地，不裁剪分离的血清型10a多糖。
在优选实施方案中，通过包括以下步骤的方法获得分离的血清型10a多糖：
-制备血清型10a肺炎链球菌细菌细胞的发酵培养物；
-裂解所述发酵培养物中的细菌细胞；和，
-从发酵培养物纯化血清型10a多糖。
血清型10a、22f或33f多糖的活化
通过包括以下步骤的方法来活化分离的血清型10a、22f或33f多糖：
(a)将分离的血清型10a、22f或33f多糖与氧化剂反应；和，
(b)通过添加猝灭剂来猝灭氧化反应，从而导致活化的肺炎链球菌血清型10a、22f或33f多糖。
在优选实施方案中，步骤(a)中的血清型10a、22f或33f多糖的浓度在0.1mg/ml与10mg/ml之间。在优选实施方案中，步骤(a)中的血清型10a、22f或33f多糖的浓度在0.5mg/ml与5mg/ml之间。在优选实施方案中，步骤(a)中的血清型10a、22f或33f多糖的浓度在1mg/ml与3mg/ml之间。在优选实施方案中，步骤(a)中的血清型22f或33f多糖的浓度为约2mg/ml。在优选实施方案中，步骤(a)中的血清型10a多糖的浓度为约2.5mg/ml。
在优选实施方案中，所述氧化剂为高碘酸盐。所述高碘酸盐氧化邻位羟基以形成羰基或醛基，并引起c-c键的断裂。
术语“高碘酸盐”包括高碘酸盐和高碘酸。该术语还包括偏高碘酸盐(io4-)和正高碘酸盐(io65-)。术语“高碘酸盐”还包括高碘酸盐的各种盐，包括高碘酸钠和高碘酸钾。在优选实施方案中，氧化剂为高碘酸钠。在优选实施方案中，用于血清型10a、22f或33f多糖的氧化的高碘酸盐为偏高碘酸盐。在优选实施方案中，用于血清型10a、22f或33f多糖的氧化的高碘酸盐为偏高碘酸钠。
在优选实施方案中，将多糖与0.01至10摩尔当量、0.05至5摩尔当量、0.1至1摩尔当量、0.5至1摩尔当量、0.7至0.8摩尔当量、0.01至0.2摩尔当量、0.05至0.5摩尔当量、0.05至0.2摩尔当量、0.1至0.3摩尔当量的氧化剂反应。在优选实施方案中，将多糖与约0.05摩尔当量、0.1摩尔当量、0.15摩尔当量、0.2摩尔当量、0.25摩尔当量、0.3摩尔当量、0.35摩尔当量、0.4摩尔当量、0.45摩尔当量、0.5摩尔当量、0.55摩尔当量、0.6摩尔当量、0.65摩尔当量、0.7摩尔当量、0.75摩尔当量、0.8摩尔当量的氧化剂反应。在优选实施方案中，将多糖与约0.10摩尔当量的氧化剂反应。在优选实施方案中，将多糖与约0.15摩尔当量的氧化剂反应。在优选实施方案中，将多糖与约0.25摩尔当量的氧化剂反应。在优选实施方案中，将多糖与约0.5摩尔当量的氧化剂反应。在优选实施方案中，将多糖与约0.8摩尔当量的氧化剂反应。
在优选实施方案中，步骤(a)中的反应持续时间在1与50小时之间、1与40小时之间、1与30小时之间、1与25小时之间、1与20小时之间、1与10小时之间、10至50小时、10至40小时、10至30小时、10至20小时。在优选实施方案中，当多糖为血清型10a多糖时，步骤(a)中的反应持续时间在1与10小时之间。在优选实施方案中，当多糖为血清型10a多糖时，步骤(a)中的反应持续时间为约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时。在优选实施方案中，当多糖为血清型10a多糖时，步骤(a)中的反应持续时间为约4小时。在优选实施方案中，当多糖为血清型22f多糖时，步骤(a)中的反应持续时间在10小时与20小时之间。在优选实施方案中，当多糖为血清型22f多糖时，步骤(a)中的反应持续时间为约10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时。在优选实施方案中，当多糖为血清型33f多糖时，步骤(a)中的反应持续时间在15小时与25小时之间。在优选实施方案中，当多糖为血清型33f多糖时，步骤(a)中的反应持续时间为约15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时或25小时。在优选实施方案中，当多糖为血清型33f多糖时，步骤(a)中的反应持续时间为约20小时。
在优选实施方案中，将步骤(a)的反应温度维持在1℃与30℃之间、1℃与10℃之间、10℃与20℃之间、20℃与30℃之间、2℃与8℃之间。在优选实施方案中，将步骤(a)的反应温度维持在约5℃。
在优选实施方案中，在选自磷酸钠、磷酸钾、2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)或bis-tris的缓冲液中进行步骤(a)。在优选实施方案中，在磷酸钾缓冲液中进行步骤(a)。在优选实施方案中，在磷酸钠缓冲液中进行步骤(a)。
在优选实施方案中，所述缓冲液具有在1mm与500mm之间、1mm与300mm之间、50mm与200mm之间的浓度。在优选实施方案中，所述缓冲液具有约100mm的浓度。
在优选实施方案中，步骤(a)中的ph在4与8之间、5与7之间、5.5与6.5之间。在优选实施方案中，步骤(a)中的ph为约6。在优选实施方案中，步骤(a)中的ph为约5.8。
在一个实施方案中，猝灭剂选自邻二醇、1,2-氨基醇、氨基酸、谷胱甘肽、亚硫酸盐、硫酸氢盐、连二亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、硫代硫酸盐、亚磷酸盐、次磷酸盐或亚磷酸。
在一个实施方案中，猝灭剂为下式的1,2-氨基醇
其中r1选自h、甲基、乙基、丙基或异丙基。
在一个实施方案中，猝灭剂选自亚硫酸、硫酸氢、连二亚硫酸、焦亚硫酸、硫代硫酸、亚磷酸、次磷酸或亚磷酸的钠盐和钾盐。
在一个实施方案中，猝灭剂为氨基酸。在一个实施方案中，所述氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和组氨酸。
在一个实施方案中，猝灭剂为亚硫酸盐诸如硫酸氢盐、连二亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、硫代硫酸盐。
在一个实施方案中，猝灭剂为包含两个邻位羟基(即共价连接于两个相邻碳原子的两个羟基)的化合物(邻二醇)。
优选地，猝灭剂为式(ii)的化合物
，其中r1和r2各自独立地选自h、甲基、乙基、丙基或异丙基。
在优选实施方案中，猝灭剂是甘油、乙二醇、丙-1,2-二醇、丁-1,2-二醇或丁-2,3-二醇、抗坏血酸。在优选实施方案中，猝灭剂为丁-2,3-二醇。
在优选实施方案中，通过添加0.1至10摩尔当量、0.5至5摩尔当量、0.5至3摩尔当量、0.5至2摩尔当量的猝灭剂来中和氧化剂。在优选实施方案中，通过添加约0.5摩尔当量、1摩尔当量、1.5摩尔当量、2摩尔当量、2.5摩尔当量、3摩尔当量的猝灭剂来中和氧化剂。在优选实施方案中，通过添加约2摩尔当量的猝灭剂来中和氧化剂。
在优选实施方案中，步骤(b)的持续时间在0.1小时与10小时之间、0.5小时与5小时之间或0.5小时与2小时之间。在优选实施方案中，步骤(b)的持续时间为约0.5小时、1小时、1.5小时、2.5小时或3小时。
在优选实施方案中，将步骤(b)中的反应温度维持在1℃与30℃之间、1℃与25℃之间、1℃与20℃之间、1℃与10℃之间、10℃与20℃之间、2℃与8℃之间。在优选实施方案中，将步骤(b)中的反应温度维持在约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃或8℃。
在优选实施方案中，步骤(b)中的ph在4与8之间、5与7之间、5.5与6.5之间。在优选实施方案中，步骤(a)中的ph为约6。
在优选实施方案中，纯化活化的血清型10a、22f或33f多糖。可按照本领域技术人员已知的方法诸如凝胶渗透层析法(gpc)、透析或超滤/渗滤纯化活化的血清型10a、22f或33f多糖。例如，通过使用超滤装置进行浓缩和渗滤来纯化活化的多糖。
在优选实施方案中，通过包括以下步骤的方法来活化分离的血清型10a多糖：
(a)将分离的血清型10a多糖与高碘酸盐反应；和，
(b)通过添加丁-2,3-二醇来猝灭氧化反应，从而导致活化的血清型10a多糖。
在优选实施方案中，通过包括以下步骤的方法来活化分离的血清型10a多糖：
(a)在2℃与8℃之间的温度下将分离的血清型10a多糖与高碘酸盐反应；和，
(b)通过在2℃与8℃之间的温度下添加丁-2,3-二醇来猝灭氧化反应，从而导致活化的血清型10a多糖。
在优选实施方案中，通过包括以下步骤的方法来活化分离的血清型10a多糖：
(a)在2℃与8℃之间的温度下将分离的血清型10a多糖与0.2至0.3摩尔当量的高碘酸盐反应；和，
(b)通过在2℃与8℃之间的温度下添加0.5至2摩尔当量的丁-2,3-二醇来猝灭氧化反应，从而导致活化的血清型10a多糖。
在优选实施方案中，通过包括以下步骤的方法来活化分离的血清型22f多糖：
(a)将分离的血清型22f多糖与高碘酸盐反应；和，
(b)通过添加丁-2,3-二醇来猝灭氧化反应，从而导致活化的血清型22f多糖。
在优选实施方案中，通过包括以下步骤的方法来活化分离的血清型22f多糖：
(a)在2℃与8℃之间的温度下将分离的血清型22f多糖与高碘酸盐反应；和，
(b)通过在2℃与8℃之间的温度下添加丁-2,3-二醇来猝灭氧化反应，从而导致活化的血清型22f多糖。
在优选实施方案中，通过包括以下步骤的方法来活化分离的血清型22f多糖：
(a)在2℃与8℃之间的温度下将分离的血清型22f多糖与0.05至0.2摩尔当量的高碘酸盐反应；和，
(b)通过在2℃与8℃之间的温度下添加2至3摩尔当量，优选2摩尔当量的丁-2,3-二醇来猝灭氧化反应，从而导致活化的血清型22f多糖。
在优选实施方案中，通过包括以下步骤的方法来活化分离的血清型33f多糖：
(a)将分离的血清型33f多糖与高碘酸盐反应；和，
(b)通过添加丁-2,3-二醇来猝灭氧化反应，从而导致活化的血清型33f多糖。
在优选实施方案中，通过包括以下步骤的方法来活化分离的血清型33f多糖：
(a)在2℃与8℃之间的温度下将分离的血清型33f多糖与高碘酸盐反应；和，
(b)通过在2℃与8℃之间的温度下添加丁-2,3-二醇来猝灭氧化反应，从而导致活化的血清型33f多糖。
在优选实施方案中，通过包括以下步骤的方法来活化分离的血清型33f多糖：
(a)在2℃与8℃之间的温度下将分离的血清型33f多糖与0.05至0.2摩尔当量的高碘酸盐反应；和，
(b)通过在2℃与8℃之间的温度下添加0.5至1.5摩尔当量的丁-2,3-二醇来猝灭氧化反应，从而导致活化的血清型33f多糖。
在优选实施方案中，本发明涉及通过或可通过上文中公开的方法获得的活化的血清型10a荚膜多糖。
在优选实施方案中，本发明涉及通过或可通过上文中公开的方法获得的活化的血清型22f荚膜多糖。
在优选实施方案中，本发明涉及通过或可通过上文中公开的方法获得的活化的血清型33f荚膜多糖。
在优选实施方案中，获自步骤(b)的活化的血清型10a多糖具有步骤(a)中使用的分离的多糖的分子量的20％与100％之间、30％与95％之间、40％与95％之间、60％至95％、85％至95％或约90％的分子量。
在优选实施方案中，获自步骤(b)的活化的血清型10a多糖具有步骤(a)中使用的分离的多糖的分子量的至少20％、25％、30％、35％、40％或45％的分子量。在优选实施方案中，获自步骤(b)的活化的血清型10a多糖具有步骤(a)中使用的分离的多糖的分子量的至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的分子量。
在优选实施方案中，获自步骤(b)的活化的血清型22f多糖具有步骤(a)中使用的分离的多糖的分子量的50％与100％之间、60％至95％、85％至95％或约90％的分子量。
在优选实施方案中，获自步骤(b)的活化的血清型22f多糖具有步骤(a)中使用的分离的多糖的分子量的至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的分子量。
在优选实施方案中，获自步骤(b)的活化的血清型33f多糖具有步骤(a)中使用的分离的多糖的分子量的50％与100％之间、60％至95％、85％至95％或约90％的分子量。
在优选实施方案中，获自步骤(b)的活化的血清型33f多糖具有步骤(a)中使用的分离的多糖的分子量的至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的分子量。
在优选实施方案中，活化的血清型10a、22f或33f多糖的氧化程度在2与30之间、2与25之间、2与20之间、2与15之间、2与10之间、2与5之间、5与30之间、5与25之间、5与20之间、5与15之间、5与10之间、10与30之间、10与25之间、10与20之间、10与15之间、5与25之间、10与30之间、15与30之间、15与25之间、15与20之间、20至30、20至25。在优选实施方案中，活化的血清型10a、22f或33f多糖的氧化程度在2与10之间、4与8之间、4与6之间、6与8之间、6与12之间、8与14之间、9与11之间、10与16之间、12与16之间、14与18之间、16与20之间、16与18之间、18与22之间、18与20之间。
在优选实施方案中，活化的血清型10a多糖具有在50kda与400kda之间、50kda与350kda之间、50kda与300kda之间、50kda与250kda之间、50kda与200kda之间、100kda与300kda之间、100kda与250kda之间或100kda与200kda之间的分子量。在优选实施方案中，活化的血清型10a多糖具有50kda与300kda之间的分子量。在优选实施方案中，活化的血清型10a多糖具有100kda与200kda之间的分子量。在优选实施方案中，活化的血清型10a多糖具有100kda与200kda之间的分子量以及5与20之间、5与15之间、8与14之间、8与12之间或9与11之间的氧化程度。在优选实施方案中，活化的血清型10a多糖具有100kda与200kda之间的分子量以及9与11之间的氧化程度。
在优选实施方案中，活化的血清型22f多糖具有25kda与1000kda之间、100kda与1000kda之间、300kda与800kda之间、300kda与700kda之间、300kda与600kda之间、400kda与1000kda之间、400kda与800kda之间、400kda与700之间或400kda与600kda之间的分子量。在优选实施方案中，活化的血清型22f多糖具有300kda与800kda之间的分子量。在优选实施方案中，活化的血清型22f多糖具有400kda与800kda之间的分子量。在优选实施方案中，活化的血清型22f多糖具有400kda与600kda之间的分子量。在优选实施方案中，活化的血清型22f多糖具有400kda与800kda之间的分子量以及10与25之间、10与20之间、12与20之间或14与18之间的氧化程度。在优选实施方案中，活化的血清型22f多糖具有400kda与800kda之间的分子量以及10与20之间的氧化程度。
在优选实施方案中，活化的血清型22f多糖包含每mm血清型22f多糖至少0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm或0.7mm或约0.8mm的醋酸盐。在优选实施方案中，活化的血清型22f多糖包含每mm血清型22f多糖至少0.5、0.6或0.7mm的醋酸盐。在优选实施方案中，活化的血清型22f多糖包含每mm血清型22f多糖至少0.6mm的醋酸盐。在优选实施方案中，活化的血清型22f多糖包含每mm血清型22f多糖至少0.7mm的醋酸盐。
在优选实施方案中，活化的血清型22f多糖具有400kda与800kda之间的分子量并且包含每mm血清型22f多糖至少0.6mm的醋酸盐。
在优选实施方案中，活化的血清型22f多糖具有在400kda与800kda之间的分子量、12与20之间的氧化程度，并且包含每mm血清型22f多糖至少0.6mm的醋酸盐。
在优选实施方案中，活化的血清型33f多糖具有50kda与1250kda之间、200kda与1200kda之间、500kda与1200kda之间、500kda与1000kda之间、700kda与1200kda之间、800kda与1200kda之间、800kda与1100kda之间、900kda与1200kda之间、800kda与1000kda之间的分子量。在优选实施方案中，活化的血清型33f多糖具有500kda与1000kda之间的分子量。在另一个优选实施方案中，活化的血清型33f多糖具有50kda与600kda之间、50kda与500kda之间或50kda与400kda之间的分子量。
在优选实施方案中，活化的血清型33f多糖包含每mm血清型33f多糖至少0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm或0.8或约0.9mm的醋酸盐。在优选实施方案中，活化的血清型33f包含每mm血清型33f多糖至少0.6mm、0.7mm或0.8mm的醋酸盐。在优选实施方案中，活化的血清型33f多糖包含每mm血清型33f多糖至少0.6mm的醋酸盐。在优选实施方案中，活化的血清型33f多糖包含每mm血清型33f多糖至少0.7mm的醋酸盐。
在优选实施方案中，活化的血清型33f多糖具有800kda与1200kda之间的分子量并且包含每mm血清型33f多糖至少0.7mm的醋酸盐。在优选实施方案中，活化的血清型33f多糖具有800kda与1200kda之间的分子量，包含每mm血清型33f多糖至少0.7mm的醋酸盐并且具有10与20之间的氧化程度。
在优选实施方案中，活化的血清型33f多糖具有50kda与200kda之间的分子量并且包含每mm血清型33f多糖至少0.7mm的醋酸盐。
在优选实施方案中，活化的血清型33f多糖具有50kda与200kda之间的分子量，包含每mm血清型33f多糖至少0.7mm的醋酸盐，并且具有10与20之间的氧化程度。
在实施方案中，任选地在冷冻保护剂/冻干保护剂存在的情况下冷冻干燥活化的血清型10a、22f或33f多糖。在优选实施方案中，冷冻保护剂/冻干保护剂选自蔗糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖、松三糖、葡聚糖、甘露醇、乳糖醇和帕拉金糖醇。在优选实施方案中，所述冷冻保护剂/冻干保护剂为蔗糖。随后可将冻干的活化的多糖与包含载体蛋白的溶液混合。
在另一个实施方案中，将活化的血清型10a、22f或33f多糖与载体蛋白混合，并且任选地在冷冻保护剂/冻干保护剂存在的情况下将其冷冻干燥。在优选实施方案中，所述冷冻保护剂/冻干保护剂选自蔗糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖、松三糖、葡聚糖、甘露醇、乳糖醇和帕拉金糖醇。在优选实施方案中，所述冷冻保护剂/冻干保护剂为蔗糖。可随后将共冻干的多糖和载体蛋白重悬浮于溶液中并与还原剂反应。
在实施方案中，本发明涉及冻干的活化的血清型10a多糖。在实施方案中，本发明涉及冻干的活化的血清型22f多糖。在实施方案中，本发明涉及冻干的活化的血清型33f多糖。
在实施方案中，本发明涉及共冻干的活化的血清型10a多糖和蛋白载体。在优选实施方案中，所述蛋白载体为crm197。在实施方案中，本发明涉及共冻干的活化的血清型22f多糖和蛋白载体。在优选实施方案中，所述蛋白载体为crm197。在实施方案中，本发明涉及共冻干的活化的血清型33f多糖和蛋白载体。在优选实施方案中，所述蛋白载体为crm197。
利用载体蛋白缀合活化的血清型10a、22f或33f多糖
可通过包括以下步骤的方法将本文中公开的活化的血清型10a、22f或33f多糖缀合于载体蛋白：
(a)将活化的血清型10a、22f或33f多糖与载体蛋白混合；和,
(b)将混合的活化的血清型10a、22f或33f多糖和载体蛋白与还原剂反应以形成血清型10a、22f或33f多糖:载体蛋白缀合物。
相较于在水相中的还原胺化(其中多糖的o-乙酰化水平被显著降低)，通过在二甲基亚砜(dmso)中进行还原胺化的活化的血清型22f或33f多糖与蛋白质载体的缀合适于保留多糖的o-乙酰基含量。在优选实施方案中，在dmso中进行步骤(a)和步骤(b)。
在优选实施方案中，步骤(a)包括将冻干的血清型10a、22f或33f多糖溶解在包含载体蛋白的水溶液中或包含载体蛋白和dmso的溶液中。在优选实施方案中，步骤(a)包括将共冻干的血清型10a、22f或33f多糖和载体蛋白溶解在水溶液中或dmso中。
当在水溶液中进行步骤(a)和(b)时，所述溶液包含缓冲液，缓冲液优选选自pbs、mes、hepes、bis-tris、ada、pipes.mopso、bes、mops、dipso、mobs、heppso、popso、tea、epps、bicine或hepb，ph在6.0与8.5之间、7与8之间或7与7.5之间。在优选实施方案中，所述缓冲液为pbs。在优选实施方案中，ph为约7.3。
在优选实施方案中，步骤(a)中的活化的血清型10a、22f或33f多糖的浓度在0.1mg/ml与10mg/ml之间、0.5mg/ml与5mg/ml之间、0.5mg/ml与2mg/ml之间。在优选实施方案中，步骤(a)中的活化的血清型10a、22f或33f多糖的浓度为约0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、1.9mg/ml、2mg/ml、2.1mg/ml、2.2mg/ml、2.3mg/ml、2.4mg/ml、2.5mg/ml、2.6mg/ml、2.7mg/ml、2.8mg/ml、2.9mg/ml或3mg/ml。
在优选实施方案中，活化的血清型10a、22f或33f多糖对载体蛋白的初始比率(重量/重量)在5:1与0.1:1之间、2:1与0.1:1之间、2:1与1:1之间、1.5:1与1:1之间、0.1:1与1:1之间、0.3:1与1:1之间、0.6:1与1:1.2之间。在优选实施方案中，活化的血清型10a、22f或33f多糖对载体蛋白的初始比率为约0.6:1和1:1.2。在优选实施方案中，活化的血清型10a、22f或33f多糖对载体蛋白的初始比率为约0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1。
在优选实施方案中，在步骤(b)中，将活化的血清型10a、22f或33f多糖与0.1摩尔当量与10摩尔当量之间、0.5摩尔当量与5摩尔当量之间、0.5摩尔当量与2.5摩尔当量之间的还原剂反应。在优选实施方案中，在步骤(b)中，将活化的血清型10a、22f或33f与约0.5摩尔当量、0.6摩尔当量、0.7摩尔当量、0.8摩尔当量、0.9摩尔当量、1摩尔当量、1.1摩尔当量、1.2摩尔当量、1.3摩尔当量、1.4摩尔当量、1.5摩尔当量、1.6摩尔当量、1.7摩尔当量、1.8摩尔当量、1.9摩尔当量、2摩尔当量、2.1摩尔当量、2.2摩尔当量、2.3摩尔当量、2.4或2.5摩尔当量的还原剂反应。
在实施方案中，所述还原剂为氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、硼氢化钠或锌(在布朗斯台德酸或路易斯酸存在的情况下)、胺硼烷诸如吡啶硼烷、2-甲基吡啶硼烷、2,6-二硼烷-甲醇、二甲胺-硼烷、t-bumeiprn-bh3、苄胺-bh3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(pemb)。在优选实施方案中，所述还原剂是氰基硼氢化钠。
在优选实施方案中，步骤(b)的持续时间在1小时与50小时、5小时与30小时、10小时与30小时、15小时与30小时、20小时与30小时、5小时与25小时、10小时与25小时、15小时与25小时之间。在优选实施方案中，步骤(b)的持续时间为约20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时。
在优选实施方案中，将步骤(b)中的反应温度维持在10℃与40℃之间、15℃与30℃之间、20℃与26℃之间、21℃与25℃之间。在优选实施方案中，将步骤(b)中的反应温度维持在约21℃、22℃、23℃、24℃或25℃。
在优选实施方案中，用于制备包含共价连接于载体蛋白的血清型10a、22f或33f多糖的免疫原性缀合物的方法还包括通过添加nabh4来对未反应的醛加帽(猝灭)的步骤(步骤c)。
在优选实施方案中，在步骤(c)中，通过添加0.1摩尔当量至10摩尔当量、0.5摩尔当量至5摩尔当量或1摩尔当量至3摩尔当量的nabh4来对未反应的醛进行加帽。在优选实施方案中，在步骤(c)中，通过添加约2摩尔当量的nabh4来对未反应的醛进行加帽。
在优选实施方案中，步骤(c)的持续时间在0.1小时与10小时之间、0.5小时与5小时之间或2小时与4小时之间。在优选实施方案中，步骤(c)的持续时间为约3小时。
在优选实施方案中，将步骤(c)中的反应温度维持在10至40℃之间、15至30℃之间或20至26℃之间。在优选实施方案中，将步骤(c)中的反应温度维持在约23℃。
在将血清型10a、22f或33f多糖缀合于载体蛋白之后，可通过本领域技术人员已知的各种技术来纯化(针对多糖-蛋白质缀合物进行富集)多糖-蛋白质缀合物。这些技术包括透析、浓缩/渗滤操作、切向流过滤沉淀/洗脱、柱层析(deae或疏水相互作用层析)和深度过滤。
在优选实施方案中，所述载体蛋白是无毒的和非反应原性的，并且可以以足够的量和纯度获得。载体蛋白应当顺从于标准缀合方法。
在优选实施方案中，将活化的血清型10a、22f或33f多糖缀合于载体蛋白，载体蛋白选自dt(白喉毒素)、tt(破伤风类毒素)或tt的片段c、crm197(白喉毒素的无毒性的但抗原性上相同的变体)、其它dt点突变体，诸如crm176、crm228、crm45(uchida等j.bioi.chem.218；3838-3844,1973)；crm9、crm102、crm103和crm107以及由nicholls和youle在geneticallyengineeredtoxins,ed:frankel,maeceldekkerinc,1992中描述的其它突变；glu-148的缺失或glu-148至asp、gln或ser的突变和/或ala158的缺失或ala158至gly的突变以及us4709017或us4950740中公开的其它突变；至少一个或多个残基lys516、lys526、phe530和/或lys534的突变以及us5917017或us6455673中公开的其它突变；或us5843711中公开的片段，肺炎球菌的肺炎球菌溶血素(kuo等(1995)infectimmun63；2706-13)，包括以一定方式脱毒的ply例如dply-gmbs(wo04081515,pct/ep2005/010258)或dply-甲醛、phtx，包括phta、phtb、phtd、phte(phta,phtb,phtd或phte的序列公开于wo00/37105或wo00/39299中)以及pht蛋白的融合物例如phtde融合物、phtbe融合物、phta-e(wo01/98334,wo03/54007,w02009/000826)、ompc(脑膜炎球菌外膜蛋白-通常从脑膜炎奈瑟球菌血清群b提取的-ep0372501)、porb(来自脑膜炎奈瑟球菌)、pd(流感嗜血杆菌蛋白d–参见，例如，ep0594610b)、或其免疫功能等同物、合成肽(ep0378881,ep0427347)、热休克蛋白(wo93/17712,wo94/03208)、百日咳蛋白(wo98/58668,ep0471177)、细胞因子、淋巴因子、生长因子或激素(wo1091/01146)、包含来自各种病原体来源的抗原的多个人cd4+t细胞表位的人工蛋白(falugi等(2001)eurjimmunol31；3816-3824)诸如n19蛋白(baraldoi等(2004)infectimmun72；4884-7)、肺炎球菌表面蛋白pspa(wo02/091998)、铁摄取蛋白(wo01/72337)、艰难梭菌(c.difficile)的毒素a或b(wo00/61761)。在实施方案中，将活化的血清型10a、22f或33f多糖缀合于dt(白喉类毒素)。在另一个实施方案中，将活化的血清型10a、22f或33f多糖缀合于tt(破伤风类毒素)。在另一个实施方案中，将活化的血清型10a、22f或33f多糖缀合于tt的片段c。在另一个实施方案中，将活化的血清型10a、22f或33f多糖缀合于pd(流感嗜血杆菌蛋白d–参见，例如，ep0594610b)。
在优选实施方案中，将活化的血清型10a、22f或33f多糖缀合于crm197蛋白。所述crm197蛋白为白喉毒素的无毒形式，但其在免疫上与白喉毒素无区别。crm197由被通过产毒β棒状噬菌体的亚硝基胍诱变产生的非产毒噬菌体β197tox-感染的白喉杆菌产生(uchida,t.等1971,naturenewbiology233:8-11)。通过超滤、硫酸铵沉淀和离子交换层析纯化crm197。crm197蛋白具有与白喉毒素相同的分子量但与其相异在于结构基因中的单碱基变化(鸟嘌呤至腺嘌呤)。该单碱基变化在成熟蛋白质中引起氨基酸取代(谷氨酸对甘氨酸的取代)并且消除白喉毒素的毒性性质。crm197蛋白是糖类的安全有效的t细胞依赖性载体。关于cmr197及其生产的其它详细内容可见于例如us5614382中。
在优选实施方案中，通过包括以下步骤的方法将本文中公开的活化的血清型10a、22f或33f多糖缀合于crm197：
(a)将活化的血清型10a、22f或33f多糖与crm197混合；
(b)将混合的活化的血清型10a、22f或33f多糖和crm197与氰基硼氢化钠反应，以形成血清型10a、22f或33f多糖:crm197缀合物。
在优选实施方案中，通过包括以下步骤的方法将本文中公开的活化的血清型10a、22f或33f多糖缀合于crm197:
(a)将活化的血清型10a、22f或33f多糖与crm197混合；
(b)将混合的活化的血清型10a、22f或33f多糖和crm197与氰基硼氢化钠反应，以形成血清型10a、22f或33f多糖:crm197缀合物；
其中在dmso中进行步骤(a)和(b)。
在优选实施方案中，通过包括以下步骤的方法将本文中公开的活化的血清型10a、22f或33f多糖缀合于crm197:
(a)将活化的血清型10a、22f或33f多糖与crm197混合；
(b)将混合的活化的血清型10a、22f或33f多糖和crm197与0.5摩尔当量至2摩尔当量的氰基硼氢化钠反应，以形成血清型10a、22f或33f多糖:crm197缀合物；
其中在dmso中进行步骤(a)和(b)。
在实施方案中，本发明涉及通过或可通过本文中公开的方法获得的免疫原性缀合物。在优选实施方案中，本发明涉及通过或可通过将如本文中公开的血清型10a、22f或33f活化的多糖缀合(通过还原胺化)于载体蛋白获得的免疫原性缀合物。在优选实施方案中，本发明涉及通过或可通过将本文中公开的血清型10a、22f或33f活化的多糖缀合(通过在dmso中进行还原胺化)于载体蛋白获得的免疫原性缀合物。在优选实施方案中，所述载体蛋白为crm197。
血清型10a免疫原性缀合物
在优选实施方案中，血清型10a免疫原性缀合物具有500kda与15000kda之间、500kda与10000kda之间、2000kda与10000kda之间或3000kda与8000kda之间的分子量。在优选实施方案中，血清型10a免疫原性缀合物具有3000kda与8000kda之间的分子量。免疫原性缀合物的分子量通过sec-malls来测量。
在优选实施方案中，血清型10a免疫原性缀合物包含相较于血清型10a多糖的总量少于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或15％的游离血清型10a多糖。在优选实施方案中，血清型10a免疫原性缀合物包含相较于血清型10a多糖的总量少于约25％的游离血清型10a多糖。在优选实施方案中，血清型10a免疫原性缀合物包含相较于血清型10a多糖的总量少于约20％的游离血清型10a多糖。在优选实施方案中，血清型10a免疫原性缀合物包含相较于血清型10a多糖的总量少于约15％的游离血清型10a多糖。
在优选实施方案中，缀合物中的血清型10a多糖对载体蛋白的比率(重量/重量)在0.5与3之间。在优选实施方案中，缀合物中的血清型10a多糖对载体蛋白的比率在0.5与2之间、0.5与1.5之间、0.5与1之间、1与1.5之间、1与2之间。在优选实施方案中，缀合物中的血清型10a多糖对载体蛋白的比率在0.8与1.4之间。在优选实施方案中，缀合物中的血清型10a荚膜多糖对载体蛋白的比率在0.8与1.2之间。
大小排阻层析介质(cl-4b)可被用来测定缀合物的相对分子大小分布。将大小排阻层析(sec)用于重力进料柱中以分析缀合物的分子大小分布。从介质中的孔排斥的大分子比小分子更快地洗脱。将级分收集器用于收集柱洗脱液。通过糖类测定来比色测试级分。为了测定kd，将柱校准以确定分子被完全排斥时级分(v0),(kd＝0)，和代表最大持留量的级分(vi),(kd＝1)。达到指定的样品属性时的级分(ve)按照表达式kd＝(ve-v0)/(vi-v0)与kd相关。
在优选实施方案中，至少30％的血清型10a免疫原性缀合物具有在cl-4b柱中低于或等于0.3的kd。在优选实施方案中，至少40％的血清型10a免疫原性缀合物具有在cl-4b柱中低于或等于0.3的kd。在优选实施方案中，至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％的血清型10a免疫原性缀合物具有在cl-4b柱中低于或等于0.3的kd。在优选实施方案中，至少60％的血清型10a免疫原性缀合物具有在cl-4b柱中低于或等于0.3的kd。在优选实施方案中，50％与80％之间的血清型10a免疫原性缀合物具有在cl-4b柱中低于或等于0.3的kd。
缀合程度是载体蛋白中缀合于目标多糖的赖氨酸残基的数目。使用本领域技术人员已知的常规方法，通过氨基酸分析获得因与多糖的共价键联而引起的载体蛋白的赖氨酸修饰的证据。缀合导致相较于用于产生缀合物材料的crm197蛋白起始材料，回收的赖氨酸残基的数目的减少。
在优选实施方案中，免疫原性缀合物的缀合程度在2与15之间、2与13之间、2与10之间、2与8之间、2与6之间、2与5之间、2与4之间、3与15之间、3与13之间、3与10之间、3与8之间、3与6之间、3与5之间、3与4之间、5与15之间、5与10之间、8与15之间、8与12之间、10与15之间或10与12之间。在优选实施方案中，免疫原性缀合物的缀合程度在6与8之间。
血清型22f免疫原性缀合物
在优选实施方案中，免疫原性缀合物包含每mm血清型22f多糖至少0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm或0.7mm或约0.8mm的醋酸盐。在优选实施方案中，免疫原性缀合物包含每mm血清型22f多糖至少0.5mm、0.6mm或0.7mm的醋酸盐。在优选实施方案中，免疫原性缀合物包含每mm血清型22f多糖至少0.6mm的醋酸盐。在优选实施方案中，免疫原性缀合物包含每mm血清型22f多糖至少0.7mm的醋酸盐。
在优选实施方案中，免疫原性缀合物中每mm血清型22f多糖的醋酸盐的mm数对分离的多糖中每mm血清型22f多糖的醋酸盐的mm数的比率为至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9或0.95。在优选实施方案中，免疫原性缀合物中每mm血清型22f多糖的醋酸盐的mm数对分离的多糖中每mm血清型22f多糖的醋酸盐的mm数的比率为至少0.7。在优选实施方案中，免疫原性缀合物中每mm血清型22f多糖的醋酸盐的mm数对分离的多糖中每mm血清型22f多糖的醋酸盐的mm数的比率为至少0.9。
在优选实施方案中，免疫原性缀合物中每mm血清型22f多糖的醋酸盐的mm数对活化的多糖中每mm血清型22f多糖的醋酸盐的mm数的比率为至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9或0.95。在优选实施方案中，免疫原性缀合物中每mm血清型22f多糖的醋酸盐的mm数对活化的多糖中每mm血清型22f多糖的醋酸盐的mm数的比率为至少0.7。在优选实施方案中，免疫原性缀合物中每mm血清型22f多糖的醋酸盐的mm数对活化的多糖中每mm血清型22f多糖的醋酸盐的mm数的比率为至少0.9。
在优选实施方案中，血清型22f免疫原性缀合物具有在400kda与15000kda之间、500kda与10000kda之间、2000kda与10000kda之间、3000kda与8000kda之间或3000kda与5000kda之间的分子量。在优选实施方案中，血清型22f免疫原性缀合物具有在3000kda与5000kda之间的分子量。通过sec-malls测量所述免疫原性缀合物的分子量。
在优选实施方案中，血清型22f免疫原性缀合物包含相较于血清型22f多糖的总量少于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或15％的游离血清型22f多糖。在优选实施方案中，血清型22f免疫原性缀合物包含相较于血清型22f多糖的总量少于约40％的游离血清型22f多糖。在优选实施方案中，血清型22f免疫原性缀合物包含相较于血清型22f多糖的总量少于约25％的游离血清型22f多糖。在优选实施方案中，血清型22f免疫原性缀合物包含相较于血清型22f多糖的总量少于约20％的游离血清型22f多糖。在优选实施方案中，血清型22f免疫原性缀合物包含相较于血清型22f多糖的总量少于约15％的游离血清型22f多糖。
在优选实施方案中，缀合物中的血清型22f多糖对载体蛋白的比率(重量/重量)在0.5与3之间。在优选实施方案中，缀合物中的血清型22f多糖对载体蛋白的比率在0.5与2之间、0.5与1.5之间、0.8与1.2之间、0.5与1之间、1与1.5之间或1与2之间。在优选实施方案中，缀合物中的血清型22f多糖对载体蛋白的比率在0.8与1.2之间。在优选实施方案中，缀合物中的血清型22f荚膜多糖对载体蛋白的比率在0.9与1.1之间。
在优选实施方案中，至少30％的血清型22f免疫原性缀合物具有在cl-4b柱中低于或等于0.3的kd。在优选实施方案中，至少40％的免疫原性缀合物具有在cl-4b柱中低于或等于0.3的kd。在优选实施方案中，至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％,或85％的血清型22f免疫原性缀合物具有在cl-4b柱中低于或等于0.3的kd。在优选实施方案中，至少60％的血清型22f免疫原性缀合物具有在cl-4b柱中低于或等于0.3的kd。在优选实施方案中，50％与80％之间的血清型22f免疫原性缀合物具有在cl-4b柱中低于或等于0.3的kd。在优选实施方案中，65％与80％之间的血清型22f免疫原性缀合物具有在cl-4b柱中低于或等于0.3的kd。
在优选实施方案中，免疫原性缀合物的缀合程度在2与15之间、2与13之间、2与10之间、2与8之间、2与6之间、2与5之间、2与4之间、3与15之间、3与13之间、3与10之间、3与8之间、3与6之间、3与5之间、3与4之间、4与7之间、5与15之间、5与10之间、8与15之间、8与12之间、10与15之间或10与12之间。在优选实施方案中，免疫原性缀合物的缀合程度在4与7之间。
血清型33f免疫原性缀合物
在优选实施方案中，免疫原性缀合物包含每mm血清型33f多糖至少0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm或0.7mm或约0.8mm的醋酸盐。在优选实施方案中，免疫原性缀合物包含每mm血清型33f多糖至少0.5mm、0.6mm或0.7mm的醋酸盐。在优选实施方案中，免疫原性缀合物包含每mm血清型33f多糖至少0.6mm的醋酸盐。在优选实施方案中，免疫原性缀合物包含每mm血清型33f多糖至少0.7mm的醋酸盐。
在优选实施方案中，免疫原性缀合物中每mm血清型33f多糖的醋酸盐的mm数对分离的多糖中每mm血清型33f多糖的醋酸盐的mm数的比率为至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9或0.95。在优选实施方案中，免疫原性缀合物中每mm血清型33f多糖的醋酸盐的mm数对分离的多糖中每mm血清型33f多糖的醋酸盐的mm数的比率为至少0.7。在优选实施方案中，免疫原性缀合物中每mm血清型33f多糖的醋酸盐的mm数对分离的多糖中每mm血清型33f多糖的醋酸盐的mm数的比率为至少0.9。
在优选实施方案中，免疫原性缀合物中每mm血清型33f多糖的醋酸盐的mm数对活化的多糖中每mm血清型33f多糖的醋酸盐的mm数的比率为至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9或0.95。在优选实施方案中，免疫原性缀合物中每mm血清型33f多糖的醋酸盐的mm数对活化的多糖中每mm血清型33f多糖的醋酸盐的mm数的比率为至少0.7。在优选实施方案中，免疫原性缀合物中每mm血清型33f多糖的醋酸盐的mm数对活化的多糖中每mm血清型33f多糖的醋酸盐的mm数的比率为至少0.9。
在优选实施方案中，血清型33f免疫原性缀合物具有在500kda与30000kda之间、500kda与25000kda之间、500kda与20000kda之间、500kda与15000kda之间、500kda与10000kda之间、1000kda与10000kda之间、1000kda与8000kda之间、1000kda与5000kda之间、2000kda与10000kda之间、2000kda与8000kda之间或2000kda与5000kda之间的分子量。在优选实施方案中，血清型33f免疫原性缀合物具有在1000kda与5000kda之间的分子量。通过sec-malls测量所述免疫原性缀合物的分子量。
在优选实施方案中，血清型33f免疫原性缀合物包含相较于血清型33f多糖的总量少于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或15％的游离血清型33f多糖。在优选实施方案中，血清型33f免疫原性缀合物包含相较于血清型33f多糖的总量少于约25％的游离血清型33f多糖。在优选实施方案中，血清型33f免疫原性缀合物包含相较于血清型33f多糖的总量少于约20％的游离血清型33f多糖。在优选实施方案中，血清型33f免疫原性缀合物包含相较于血清型33f多糖的总量少于约15％的游离血清型33f多糖。
在优选实施方案中，缀合物中血清型33f多糖对载体蛋白的比率(重量/重量)在0.4与3之间。在优选实施方案中，缀合物中的血清型33f多糖对载体蛋白的比率在0.5与2之间、0.5与1.5之间、0.5与1之间、1与1.5之间、1与2之间。在优选实施方案中，缀合物中的血清型33f多糖对载体蛋白的比率在0.5与1.5之间。在优选实施方案中，缀合物中的血清型33f荚膜多糖对载体蛋白的比率在0.5与1.2之间。
在优选实施方案中，至少30％的血清型33f免疫原性缀合物具有在cl-4b柱中低于或等于0.3的kd。在优选实施方案中，至少40％的免疫原性缀合物具有在cl-4b柱中低于或等于0.3的kd。在优选实施方案中，至少45％、50％、55％、60％、65％的血清型33f免疫原性缀合物具有在cl-4b柱中低于或等于0.3的kd。在优选实施方案中，至少60％的血清型33f免疫原性缀合物具有在cl-4b柱中低于或等于0.3的kd。在优选实施方案中，40％与80％之间的血清型33f免疫原性缀合物具有在cl-4b柱中低于或等于0.3的kd。在优选实施方案中，45％与65％之间的血清型33f免疫原性缀合物具有在cl-4b柱中低于或等于0.3的kd。
在优选实施方案中，免疫原性缀合物的缀合程度在1与15之间、2与13之间、2与10之间、2与8之间、2与6之间、2与5之间、2与4之间、3与15之间、3与13之间、3与10之间、3与8之间、3与6之间、3与5之间、3与4之间、5与15之间、5与10之间、8与15之间、8与12之间、10与15之间或10与12之间。在优选实施方案中，免疫原性缀合物的缀合程度在3与6之间。
免疫原性组合物
术语“免疫原性组合物”涉及含有抗原例如微生物或其组分的任何药物组合物，所述组合物可用于引发受试者的免疫应答。
如本文中所用，“免疫原性”意指抗原(或抗原的表位)(诸如细菌荚膜多糖)或包含抗原的糖缀合物或免疫原性组合物引发宿主诸如哺乳动物的免疫应答(体液或细胞介导的或两者)的能力。
在优选实施方案中，免疫原性组合物包含通过本文中公开的方法获得的血清型10a、22f或33f缀合物。在优选实施方案中，免疫原性组合物包含可通过本文中公开的方法获得的血清型10a、22f或33f缀合物。
在实施方案中，当向受试者施用时，本文中公开的免疫原性组合物诱导能够结合血清型10a肺炎链球菌的抗体的形成。在实施方案中，当向受试者施用时，本文中公开的免疫原性组合物诱导如通过标准elisa测定测量的能够结合血清型10a肺炎链球菌的抗体的形成。
在实施方案中，当向受试者施用时，本文中公开的免疫原性组合物诱导在如本文公开的调理吞噬测定中能够杀死血清型10a肺炎链球菌的抗体的形成。
在实施方案中，当向受试者施用时，本文中公开的免疫原性组合物诱导能够结合血清型22f肺炎链球菌的抗体的形成。在实施方案中，当向受试者施用时，本文中公开的免疫原性组合物诱导如通过标准elisa测定测量的能够结合血清型22f肺炎链球菌的抗体的形成。
在实施方案中，当向受试者施用时，本文中公开的免疫原性组合物诱导在如本文公开的调理吞噬测定中能够杀死血清型22f肺炎链球菌的抗体的形成。
在实施方案中，当向受试者施用时，本文中公开的免疫原性组合物诱导能够结合血清型33f肺炎链球菌的抗体的形成。在实施方案中，当向受试者施用时，本文中公开的免疫原性组合物诱导如通过标准elisa测定测量的能够结合血清型33f肺炎链球菌的抗体的形成。
在实施方案中，当向受试者施用时，本文中公开的免疫原性组合物诱导在如本文中公开的调理吞噬测定中能够杀死血清型33f肺炎链球菌的抗体的形成。
可使用本领域公认的方法实现本发明的免疫原性组合物的配制。例如，可用生理上可接受的媒介物配制血清型10a、22f或33f缀合物，以制备组合物。这样的媒介物的实例包括，但不限于，水、缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)和葡萄糖溶液。
在优选实施方案中，免疫原性组合物可包含至少一种另外的抗原。在优选实施方案中，免疫原性组合物可包含至少一种另外的肺炎链球菌荚膜多糖。
在优选实施方案中，免疫原性组合物可包含至少一种另外的缀合于载体蛋白的肺炎链球菌荚膜多糖。在优选实施方案中，所述载体蛋白为crm197。
在某些实施方案中，免疫原性组合物包含一种或多种佐剂。如本文中所定义的，“佐剂”为用于增强本发明的免疫原性组合物的免疫原性的物质。因此，佐剂通常被给予来加强免疫应答，并且对于本领域技术人员来说是公知的。增强组合物的功效的合适的佐剂包括，但不限于：
(1)铝盐(明矾)，诸如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；
(2)水包油乳液制剂(具有或不具有其它特定的免疫刺激剂诸如胞壁酰肽(下文中定义的)或细菌细胞壁组分)，诸如，例如，
(a)mf59(pct公开号wo90/14837)，其含有5％角鲨烯,0.5％5tween80和0.5％span85(任选地含有不同量的mtp-pe(参见下文，尽管不是必需的))，通过使用微流化器诸如model11oy微流化器(microfluidics,newton,ma)配制成亚微米颗粒，
(b)saf，其含有10％角鲨烯,0.4％tween80,5％pluronic-嵌段聚合物l121和thr-mdp(参见下文)，其被微流化成亚微米乳剂或经涡旋以产生较大粒径的乳剂，和
(c)ribitm佐剂系统(ras),(corixa,hamilton,mt)，其含有2％角鲨烯,0.2％tween80和一种或多种细菌细胞壁组分，所述细菌细胞壁组分来自由美国专利no.4,912,094(corixa)中描述的3-o-脱酰基单磷酰脂质a(mpltm)、海藻糖二霉菌酸酯(tdm)和细胞壁骨架(cws)，优选为mpl+cws(detoxtm)；
(3)皂苷佐剂，诸如可使用quila或stimulontmqs-21(antigenics,framingham,ma)(美国专利no.5,057,540)或从其产生的颗粒诸如iscom(免疫刺激复合物)；
(4)细菌脂多糖、合成的脂质a类似物诸如氨基烷基氨基葡糖胺磷酸盐化合物(agp)，或其衍生物或类似物，其可获自corixa，并且其描述于美国专利no.6,113,918中；一种这样的agp为2-[(r)-3-十四酰氧基十四酰氨基]乙基2-脱氧-4-o膦酰基-3-o-[(r)-3-十四酰氧基十四酰]-2-[(r)-3-十四酰氧基十四酰氨基]-b-d-吡喃葡萄糖苷，其也被称为529(先前称为rc529)，其被配制为含水形式或稳定的乳剂，合成的多核苷酸诸如含cpg基序的寡核苷酸(美国专利no.6,207,646)；
(5)细胞因子，诸如白细胞介素(例如，il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-7、il-12、il-15、il-18等)、干扰素(例如，γ干扰素)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、肿瘤坏死因子(tnf)、共刺激分子87-1和87-2等；
(6)野生型或突变体形式的细菌adp-核糖基化毒素诸如霍乱毒素(ct)的脱毒突变体，例如，其中氨基酸位置29上的谷氨酸被另一种氨基酸优选组氨酸替代(根据公开的国际专利申请号wo00/18434(也参见wo02/098368和wo02/098369))，百日咳毒素(pt)或大肠杆菌(e.coli)不耐热毒素(lt)，尤其是lt-k63、lt-r72、ct-s109、pt-k9/g129(参见，例如，wo93/13302和wo92/19265)；和
(7)用作增强组合物的功效的免疫刺激剂的其它物质。
胞壁酰肽包括，但不限于，n-乙酰基-胞壁酰-l-苏氨酰-d-异谷酰胺(thr-mdp)、n-乙酰基-正胞壁酰-l-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(mtp-pe)等。
在本发明的实施方案中，如本文公开的免疫原性组合物包含cpg寡核苷酸作为佐剂。如本文所用的cpg寡核苷酸是指免疫刺激性cpg寡脱氧核苷酸(cpgodn)，因此，除非另有所指，否则这些术语可互换使用。免疫刺激性cpg寡脱氧核苷酸含有(任选地在某些优选的碱基背景中)一个或多个为未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸的免疫刺激性cpg基序。所述cpg免疫刺激性基序的甲基化状态通常是指二核苷酸中的胞嘧啶残基。含有至少一个未甲基化的cpg二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸为含有通过磷酸键连接于3'鸟嘌呤的5'未甲基化的胞嘧啶，并且通过结合于toll-样受体9(tlr-9)激活免疫系统的寡核苷酸。在另一个实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸可含有一个或多个甲基化的cpg二核苷酸，其将通过tlr9激活免疫系统，但不如cpg基序未被甲基化那样强。cpg免疫刺激性寡核苷酸可包含一个或多个回文序列，所述回文序列继而可包含cpg二核苷酸。已在许多颁布的专利、公开的专利申请以及其它出版物，包括美国专利no.6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116和6,339,068中描述了cpg寡核苷酸。
在本发明的实施方案中，如本文公开的免疫原性组合物包含在wo2010/125480的第3页第22行至第12页第36行描述的cpg寡核苷酸的任一个。
已鉴定了不同种类的cpg免疫刺激性寡核苷酸。这些种类被称为a、b、c和p类，并且更详细地描述于wo2010/125480的第3页第22行至第12页第36行。本发明的方法包括这些不同种类的cpg免疫刺激性寡核苷酸的使用。
在本发明的实施方案中，如本文公开的免疫原性组合物包含a类cpg寡核苷酸。优选地，本发明的“a类”cpg寡核苷酸具有以下核酸序列：5’ggggacgacgtcgtggggggg3’(seqidno:1)。a-类寡核苷酸的一些非限制性实例包括：5’g*g*g_g_a_c_g_a_c_g_t_c_g_t_g_g*g*g*g*g*g3’(seqidno:2)；其中*是指硫代磷酸酯键，_是指磷酸二酯键。
在本发明的实施方案中，如本文公开的免疫原性组合物包含b类cpg寡核苷酸。在一个实施方案中，用于本发明的cpg寡核苷酸为由至少下式代表的b类cpg寡核苷酸：
5'x1x2cgx3x43’,其中x1、x2、x3和x4为核苷酸。在一个实施方案中，x2为腺嘌呤、鸟嘌呤或胸腺嘧啶。在另一个实施方案中，x3为胞嘧啶、腺嘌呤或胸腺嘧啶。
本发明的b类cpg寡核苷酸序列是上文中广泛描述的美国专利no.6,194,388、6,207,646、6,214,806、6,218,371、6,239,116和6,339,068中的那些。示例性序列包括但不限于后面这些的申请和专利中公开的那些序列。
在实施方案中，本发明的“b类”cpg寡核苷酸具有以下核酸序列：
5’tcgtcgtttttcggtgctttt3’(seqidno:3),或
5’tcgtcgtttttcggtcgtttt3’(seqidno:4),或
5’tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt3’(seqidno:5),或
5’tcgtcgtttcgtcgttttgtcgtt3’(seqidno:6),或
5’tcgtcgttttgtcgtttttttcga3’(seqidno:7)。
在任何这些序列中，所有键联可以均为硫代磷酸酯键。在另一个实施方案中，在任何这些序列中，一个或多个键联可以是磷酸二酯键，优选在产生半软cpg寡核苷酸的cpg基序的“c”与“g”之间。在任何这些序列中，乙基-尿苷或卤素可取代5't；卤素取代的实例包括但不限于：溴-尿苷或碘-尿苷取代。
b-类寡核苷酸的一些非限制性实例包括：
5’t*c*g*t*c*g*t*t*t*t*t*c*g*g*t*g*c*t*t*t*t3’(seqidno:8)，或
5’t*c*g*t*c*g*t*t*t*t*t*c*g*g*t*c*g*t*t*t*t3’(seqidno:9)，或
5’t*c*g*t*c*g*t*t*t*t*g*t*c*g*t*t*t*t*g*t*c*g*t*t3’(seqidno:10)，或
5’t*c*g*t*c*g*t*t*t*c*g*t*c*g*t*t*t*t*g*t*c*g*t*t3’(seqidno:11)，或
5’t*c*g*t*c*g*t*t*t*t*g*t*c*g*t*t*t*t*t*t*t*c*g*a3’(seqidno:12)，
其中*是指硫代磷酸酯键。
在本发明的实施方案中，如本文公开的免疫原性组合物包含c类cpg寡核苷酸。在实施方案中，本发明的“c类”cpg寡核苷酸具有以下核酸序列：
5’tcgcgtcgttcggcgcgcgccg3’(seqidno:13)，或
5’tcgtcgacgttcggcgcgcgccg3’(seqidno:14)，或
5’tcggacgttcggcgcgcgccg3’(seqidno:15)，或
5’tcggacgttcggcgcgccg3’(seqidno:16)，或
5’tcgcgtcgttcggcgcgccg3’(seqidno:17)，或
5’tcgacgttcggcgcgcgccg3’(seqidno:18)，或
5’tcgacgttcggcgcgccg3’(seqidno:19)，或
5’tcgcgtcgttcggcgccg3’(seqidno:20)，或
5’tcgcgacgttcggcgcgcgccg3’(seqidno:21)，或
5’tcgtcgttttcggcgcgcgccg3’(seqidno:22)，或
5’tcgtcgttttcggcggccgccg3’(seqidno:23)，或
5’tcgtcgttttacggcgccgtgccg3’(seqidno:24)，或
5’tcgtcgttttcggcgcgcgccgt3’(seqidno:25)。
在任何这些序列中，所有键联可以均为硫代磷酸酯键。在另一个实施方案中，在任何这些序列中，一个或多个键联可以是磷酸二酯键，优选在产生半软cpg寡核苷酸的cpg基序的“c”与“g”之间。
c-类寡核苷酸的一些非限定性实例包括：
5’t*c_g*c_g*t*c_g*t*t*c_g*g*c*g*c_g*c*g*c*c*g3’(seqidno:26)，或
5’t*c_g*t*c_g*a*c_g*t*t*c_g*g*c*g*c_g*c*g*c*c*g3’(seqidno:27)，或
5’t*c_g*g*a*c_g*t*t*c_g*g*c*g*c_g*c*g*c*c*g3’(seqidno:28)，或
5’t*c_g*g*a*c_g*t*t*c_g*g*c*g*c*g*c*c*g3’(seqidno:29)，或
5’t*c_g*c_g*t*c_g*t*t*c_g*g*c*g*c*g*c*c*g3’(seqidno:30)，或
5’t*c_g*a*c_g*t*t*c_g*g*c*g*c_g*c*g*c*c*g3’(seqidno:31)，或
5’t*c_g*a*c_g*t*t*c_g*g*c*g*c*g*c*c*g3’(seqidno:32)，或
5’t*c_g*c_g*t*c_g*t*t*c_g*g*c*g*c*c*g3’(seqidno:33)，或
5’t*c_g*c_g*a*c_g*t*t*c_g*g*c*g*c_g*c*g*c*c*g3’(seqidno:34)，或
5’t*c*g*t*c*g*t*t*t*t*c*g*g*c*g*c*g*c*g*c*c*g3’(seqidno:35)，或
5’t*c*g*t*c*g*t*t*t*t*c*g*g*c*g*g*c*c*g*c*c*g3’(seqidno:36)，或
5’t*c*g*t*c_g*t*t*t*t*a*c_g*g*c*g*c*c_g*t*g*c*c*g3’(seqidno:37)，或
5’t*c_g*t*c*g*t*t*t*t*c*g*g*c*g*c*g*c*g*c*c*g*t3’(seqidno:38)，
其中*是指硫代磷酸酯键，_是指磷酸二酯键。
在任何这些序列中，乙基-尿苷或卤素可取代5't；卤素取代的实例包括但不限于溴-尿苷或碘-尿苷取代。
在本发明的实施方案中，如本文公开的免疫原性组合物包含p类cpg寡核苷酸。在实施方案中，用于本发明的cpg寡核苷酸为p类cpg寡核苷酸，其含有5'tlr活化结构域和至少2个回文区，一个回文区为长度为至少6个核苷酸的5'回文区，其直接或通过间隔子连接至长度为至少8个核苷酸的3'回文区，其中所述寡核苷酸包括至少一个ypr二核苷酸。在实施方案中，所述寡核苷酸不是t*c_g*t*c_g*a*c_g*t*t*c_g*g*c*g*c_g*c*g*c*c*g(seqidno:27)。在一个实施方案中，p类cpg寡核苷酸包括至少一个未甲基化的cpg二核苷酸。在另一个实施方案中，所述tlr活化结构域为tcg、ttcg、tttcg、typr、ttypr、tttypr、ucg、uucg、uuucg、ttt或tttt。在另一个实施方案中，所述tlr活化结构域在5'回文区内。在另一个实施方案中，所述tlr活化结构域紧接所述5'回文区的5'。
在实施方案中，本发明的“p类”cpg寡核苷酸具有以下核酸序列：5’tcgtcgacgatcggcgcgcgccg3’(seqidno:39)。
在所述序列中，所有键联可以均为硫代磷酸酯键。在另一个实施方案中，一个或多个键联可以是磷酸二酯键，优选在产生半软cpg寡核苷酸的cpg基序的“c”与“g”之间。在任何这些序列中，乙基-尿苷或卤素可取代5't；卤素取代的实例包括但不限于溴-尿苷或碘-尿苷取代。
p-类寡核苷酸的非限制性实例包括：
5’t*c_g*t*c_g*a*c_g*a*t*c_g*g*c*g*c_g*c*g*c*c*g3’(seqidno:40)
，其中*是指硫代磷酸酯键，_是指磷酸二酯键。
在一个实施方案中，寡核苷酸包括至少一个硫代磷酸酯键联。在另一个实施方案中，寡核苷酸的所有核苷酸间键联为硫代磷酸酯键联。在另一个实施方案中，寡核苷酸包括至少一个磷酸二酯样键联。在另一个实施方案中，所述磷酸二酯样键联为磷酸二酯键联。在另一个实施方案中，将亲脂性基团缀合于所述寡核苷酸。在一个实施方案中，所述亲脂性基团为胆固醇。
在实施方案中，本文公开的cpg寡核苷酸的所有核苷酸间键联为磷酸二酯键(“软”寡核苷酸，如pct申请wo2007/026190中描述的)。在另一个实施方案中，使本发明的cpg寡核苷酸被赋予对降解的抗性(例如，被稳定化)。“稳定化的寡核苷酸”是指对体内降解(例如经由外切或内切核酸酶)相对耐受的寡核苷酸。可通过主链修饰实现核酸稳定化。具有硫代磷酸酯键联的寡核苷酸提供了最大活性并且保护寡核苷酸免受细胞内外切和内切核酸酶的降解。
免疫刺激性寡核苷酸可具有嵌合主链，其具有磷酸二酯键联与硫代磷酸酯键联的组合。为本发明的目的，嵌合主链是指部分稳定化的主链，其中至少一个核苷酸间键联是磷酸二酯或磷酸二酯样键联，其中至少一个其它的核苷酸间键联是稳定化的核苷酸间键联，其中所述至少一个磷酸二酯键联或磷酸二酯样键联和所述至少一个稳定化的键联是不同的。当所述磷酸二酯键联优选位于cpg基序内时，这样的分子被称为“半软的”，如pct申请wo2007/026190中描述的。
cpg寡核苷酸的大小(即，沿着寡核苷酸的长度的核苷酸残基的数目)也可贡献寡核苷酸的刺激活性。为了有利于至细胞内的摄取，本发明的cpg寡核苷酸优选具有6个核苷酸残基的最小长度。如果存在足够的免疫刺激性基序，则具有大于6个核苷酸的任何大小(甚至许多kb长)的寡核苷酸能够诱导免疫应答，因为较大的寡核苷酸在细胞内被降解。在某些实施方案中，所述cpg寡核苷酸为6至100个核苷酸长，优选8至30个核苷酸长。在重要的实施方案中，本发明的核酸和寡核苷酸不是质粒或表达载体。
在实施方案中，本文公开的cpg寡核苷酸包含诸如在碱基和/或糖中的取代或修饰，如在wo2007/026190的段落134至147中描述的。
在实施方案中，本发明的cpg寡核苷酸被化学修饰。化学修饰的实例对于本领域技术人员来说是已知的，并且描述于例如uhlmanne.等(1990),chem.rev.90:543,s.agrawal,ed.,humanapress,totowa,usa1993；crooke,s.t.等(1996)annu.rev.pharmacol.toxicol.36:107-129；和hunzikerj.等,(1995),mod.synth.methods7:331-417中。根据本发明的寡核苷酸可具有一个或多个修饰，其中相较于由天然dna或rna组成的相同序列的寡核苷酸，每一个修饰位于特定的磷酸二酯核苷间桥上和/或特定的β-d-核糖单元上和/或在特定的天然核苷碱基位置上。
在本发明的一些实施方案中，可按照本领域技术人员已知的方法将含cpg的核酸与免疫原性载体简单地混合(参见，例如，wo03/024480)。
在本发明的具体实施方案中，本文公开的任何免疫原性组合物包含2μg至100mg的cpg寡核苷酸，优选0.1mg至50mgcpg寡核苷酸，优选0.2mg至10mgcpg寡核苷酸，优选0.3mg至5mgcpg寡核苷酸，优选0.5至2mgcpg寡核苷酸，优选0.75至1.5mgcpg寡核苷酸。在优选实施方案中，本文公开的免疫原性组合物包含约1mgcpg寡核苷酸。
在优选实施方案中，佐剂为选自磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝的基于铝的佐剂。在一个实施方案中，本文所述的免疫原性组合物包含佐剂磷酸铝。
在优选实施方案中，本发明的免疫原性组合物还包含缓冲剂、冷冻保护剂、盐、二价阳离子、非离子去垢剂、自由基氧化的抑制剂、稀释剂或载体的至少一种。
免疫原性组合物任选地可包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体包括用于动物(包括人以及非人动物)的由联邦监管机构、州政府或其它管理机构批准的，或美国药典或其它通常公认的药典中所列的载体。术语载体可用于指与药物组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。可将水、盐水溶液以及含水葡萄糖和甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。在e.w.martin的"remington'spharmaceuticalsciences"中描述了合适的药物载体的实例。所述制剂应当适应于施用模式。
免疫原性组合物任选地可包含选自但不限于tris(三甲胺)、磷酸盐、醋酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、组氨酸和琥珀酸盐的一种或多种生理上可接受的缓冲剂。在某些实施方案中，将制剂缓冲至约5.0至约7.0，优选约5.5至约6.5的ph范围内。
免疫原性组合物任选地可包含一种或多种非离子性表面活性剂，包括但不限于聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、聚山梨醇酯-80(tween80)、聚山梨醇酯-60(tween60)、聚山梨醇酯-40(tween40)和聚山梨醇酯-20(tween20)、聚氧乙烯烷基醚，包括但不限于brij58、brij35以及其它物质诸如tritonx-100；tritonx-114、np40、span85和非离子性表面活性剂的pluronic系列(例如，pluronic121)，其中优选的组分聚山梨醇酯-80的浓度为约0.001％至约2％(高至约0.25％是优选的)或聚山梨醇酯-40的浓度为约0.001％至1％(高至约0.5％是优选的)。
本发明还涉及包含本发明的免疫原性组合物的疫苗。
用于诱导免疫应答和保护免受感染的方法
本公开内容还包括用于本文所述的免疫原性组合物的使用方法。例如，本公开内容的一个实施方案提供了诱导针对肺炎链球菌的免疫应答的方法，其包括向受试者施用免疫原性量的本文所述的任何免疫原性组合物。
本公开内容的一个实施方案提供了保护受试者免受肺炎链球菌感染的方法，或预防肺炎链球菌感染的方法，或减轻与由肺炎链球菌引起的感染相关的至少一个症状的严重度或延迟其发作的方法，所述方法包括向受试者施用免疫原性量的本文所述的任何免疫原性组合物。
本公开内容的一个实施方案提供了保护受试者免受血清型10a肺炎链球菌感染的方法，或预防血清型10a肺炎链球菌感染的方法，或减轻与由血清型10a肺炎链球菌引起的感染相关的至少一个症状的严重度或延迟其发作的方法，所述方法包括向受试者施用产生免疫原性的量的本文所述的任何免疫原性组合物。
本公开内容的一个实施方案提供了治疗或预防受试者的与血清型10a肺炎链球菌相关的肺炎链球菌感染、疾病或病况的方法，所述方法包括向受试者施用治疗或预防有效量的本文所述的免疫原性组合物的步骤。另一个实施方案提供了治疗或预防受试者的与血清型10a肺炎链球菌相关的肺炎链球菌感染、疾病或病况的方法，所述方法包括从本文所述的免疫原性组合物产生多克隆或单克隆抗体制剂，和使用所述抗体制剂以给受试者赋予被动免疫。
在一个实施方案中，本公开内容涉及本文公开的免疫原性缀合物或免疫原性组合物用于制造药剂的用途，所述药剂用于保护受试者免受肺炎链球菌感染，和/或预防肺炎链球菌感染，和/或减轻与由肺炎链球菌引起的感染相关的至少一个症状的严重度或延迟其发作，和/或保护受试者免受血清型10a肺炎链球菌感染和/或预防血清型10a肺炎链球菌感染，和/或减轻与由血清型10a肺炎链球菌引起的感染相关的至少一个症状的严重度或延迟其发作。
本公开内容的一个实施方案提供了保护受试者免受血清型22f肺炎链球菌感染的方法，或预防血清型22f肺炎链球菌感染的方法，或减轻与由血清型22f肺炎链球菌引起的感染相关的至少一个症状的严重度或延迟其发作的方法，所述方法包括向受试者施用免疫原性量的本文所述的任何免疫原性组合物。
本公开内容的一个实施方案提供了治疗或预防受试者的与血清型22f肺炎链球菌相关的肺炎链球菌感染、疾病或病况的方法，所述方法包括向受试者施用治疗或预防有效量的本文所述的免疫原性组合物的步骤。另一个实施方案提供了治疗或预防受试者的与血清型22f肺炎链球菌相关的肺炎链球菌感染、疾病或病况的方法，所述方法包括从本文所述的免疫原性组合物产生多克隆或单克隆抗体制剂，以及使用所述抗体制剂以给受试者赋予被动免疫。
在一个实施方案中，本公开内容涉及本文公开的免疫原性缀合物或免疫原性组合物用于制造药剂的用途，所述药剂用于保护受试者免受肺炎链球菌感染，和/或预防肺炎链球菌感染，和/或减轻与由肺炎链球菌引起的感染相关的至少一个症状的严重度或延迟其发作，和/或保护受试者免受血清型22f肺炎链球菌感染和/或预防血清型22f肺炎链球菌感染，和/或减轻与由血清型22f肺炎链球菌引起的感染相关的至少一个症状的严重度或延迟其发作。
本公开内容的一个实施方案提供了保护受试者免受血清型33f肺炎链球菌感染的方法，或预防血清型33f肺炎链球菌感染的方法，或减轻与由血清型33f肺炎链球菌引起的感染相关的至少一个症状的严重度或延迟其发作的方法，所述方法包括向受试者施用免疫原性量的本文所述的任何免疫原性组合物。
本公开内容的一个实施方案提供了治疗或预防受试者的与血清型33f肺炎链球菌相关的肺炎链球菌感染、疾病或病况的方法，所述方法包括向受试者施用治疗或预防有效量的本文所述的免疫原性组合物的步骤。另一个实施方案提供了治疗或预防受试者的与血清型33f肺炎链球菌相关的肺炎链球菌感染、疾病或病况的方法，所述方法包括从本文所述的免疫原性组合物产生多克隆或单克隆抗体制剂，以及使用所述抗体制剂以给受试者赋予被动免疫。
在一个实施方案中，本公开内容涉及本文公开的免疫原性缀合物或免疫原性组合物用于制造药剂的用途，所述药剂用于保护受试者免受肺炎链球菌感染，和/或预防肺炎链球菌感染，和/或减轻与由肺炎链球菌引起的感染相关的至少一个症状的严重度或延迟其发作，和/或保护受试者免受血清型33f肺炎链球菌感染和/或预防血清型33f肺炎链球菌感染，和/或减轻与由血清型33f肺炎链球菌引起的感染相关的至少一个症状的严重度或延迟其发作。
针对免疫原性组合物的“免疫应答”是受试者中针对存在于目标免疫原性组合物或疫苗组合物中的分子的体液和/或细胞介导的免疫应答的发生。为了本公开内容的目的，“体液免疫应答”是抗体介导的免疫应答，并且牵涉诱导和产生识别本公开内容的免疫原性组合物或疫苗中的抗原并以一定的亲和力与其结合的抗体，而“细胞介导的免疫应答”是由t细胞和/或其它白血细胞介导的免疫应答。“细胞介导的免疫应答”通过与主要组织相容性复合物(mhc)的i类或ii类分子、cd1或其它非经典的mhc-样分子缔合的抗原性表位的呈递引发。这活化抗原特异性cd4+t辅助细胞或cd8+细胞毒性t淋巴细胞(“ctl”)。ctl具有针对与由经典或非经典mhc编码并在细胞表面上表达的蛋白质缔合呈递的肽抗原的特异性。ctl帮助诱导和促进细胞内微生物的细胞内破坏，或被这样的微生物感染的细胞的裂解。细胞免疫的另一个方面牵涉通过辅助t细胞的抗原特异性应答。辅助t-细胞用于帮助刺激针对在其表面上展示与经典或非经典mhc分子缔合的肽或其它抗原的细胞的非特异性效应细胞的功能和聚焦其活性。“细胞介导的免疫应答”还指细胞因子、趋化因子以及由活化的t细胞和/或其它白细胞(包括来源于cd4+和cd8+t细胞的那些白细胞)产生的其它这样的分子的产生。特定抗原或组合物刺激细胞介导的免疫应答的能力可通过许多测定，诸如通过淋巴细胞增殖(淋巴细胞活化)测定、ctl细胞毒性细胞测定，通过测定致敏受试者中特异于抗原的t淋巴细胞，或通过测量由t细胞响应于利用抗原的再刺激产生的细胞因子来测定。这样的测定在本领域中公知的。参见，例如，erickson等(1993)j.immunol.151:4189-4199和doe等(1994)eur.j.immunol.24:2369-2376。
如本文中所用，“治疗”(包括其变型，例如，“医治”或“治疗的”)意指以下的任一个或多个：(i)感染或再感染的预防，如在常规疫苗中，(ii)症状的严重度的减轻或症状消除，和(iii)所涉及的病原体或病症的基本或完全消除。因此，可预防性(在感染前)或治疗性(在感染后)实现治疗。在本公开内容中，预防性治疗是优选模式。根据本公开内容的具体实施方案，提供了治疗(包括预防性和/或治疗性免疫)宿主动物对抗血清型10a肺炎链球菌感染的组合物和方法。根据本发明的具体实施方案，提供了治疗(包括预防性和/或治疗性免疫)宿主动物对抗血清型22f肺炎链球菌感染的组合物和方法。根据本公开内容的具体实施方案，提供了治疗(包括预防性和/或治疗性免疫)宿主动物对抗血清型33f肺炎链球菌感染的组合物和方法。本公开内容的方法用于赋予受试者预防性和/或治疗性免疫。还可对受试者实施本公开内容的方法以进行生物医学研究应用。
“免疫原性量”和“免疫上有效的量”这两者在本文中可互换使用，是指足以引发免疫应答(细胞(t-细胞)或体液(b-细胞或抗体)应答，或两者)的抗原或免疫原性组合物的量，如通过本领域技术人员已知的标准测定测量的。
在优选实施方案中，所述受试者为人。在最优选实施方案中，所述受试者是新生儿(即小于3个月)、婴儿(从3个月至1岁)或幼儿(即从1岁至4岁)。
在实施方案中，本文公开的免疫原性组合物用作疫苗。
在这样的实施方案中，待接种的受试者可小于1岁。例如，待接种的受试者可为约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月大。在实施方案中，待接种的受试者为约2、4或6个月大。在另一个实施方案中，待接种的受试者小于2岁。例如，待接种的受试者可为约12-15个月大。在一些情况下，需要少至一个剂量的根据本发明的免疫原性组合物，但在一些情况下，可给予第二、第三或第四剂量(参见方案部分)。
在本发明的实施方案中，待接种的受试者为50岁或更老的成年人，更优选55岁或更老的成年人。在实施方案中，待接种的受试者为65岁或更老、70岁或更老、75岁或更老或80岁或更老的成年人。
在实施方案中，待接种的受试者为免疫力低下个体，特别是人。免疫力低下个体通常被定义为表现出减弱的或降低的引发针对感染原攻击的正常体液或细胞防御的能力的人。
在本发明的实施方案中，待接种的免疫力低下受试者患有削弱免疫系统并导致不足以保护免受肺炎球菌疾病或治疗肺炎球菌疾病的抗体应答的疾病或病况。
在实施方案中，所述疾病为原发性免疫缺陷病症。优选地，所述原发性免疫缺陷病症选自：组合的t和b细胞免疫缺陷、抗体缺乏、明确定义的综合征、免疫失调疾病、吞噬细胞紊乱、固有免疫缺陷、自身炎症性病症以及补体缺陷。在实施方案中，所述原发性免疫缺陷病症选自pct申请wo2010/125480的第24页第11行至第25页第19行中公开的原发性免疫缺陷症。
在本发明的具体实施方案中，待接种的免疫力低下受试者患有选自下列的疾病：hiv感染、获得性免疫缺陷综合症(aids)、癌症、慢性心脏或肺病症、充血性心脏衰竭、糖尿病、慢性肝病、酒精中毒、肝硬化、脊髓液渗漏、心肌病、慢性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺疾病(copd)、脾功能障碍(诸如镰状细胞病)、脾功能缺乏(无脾)、血液恶性肿瘤、白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金病、淋巴瘤、肾功能衰竭、肾病综合征和哮喘。
在本发明的实施方案中，待接种的免疫力低下受试者患有营养不良。
在本发明的具体实施方案中，待接种的免疫力低下受试者正在服用降低身体对感染的抗性的药物或进行降低身体对感染的抗性的治疗。在实施方案中，所述药物选自pct申请wo2010/125480的第26页第33行至第26页第40行中公开的药物。
在本发明的具体实施方案中，待接种的免疫力低下受试者是吸烟者。
在本发明的具体实施方案中，待接种的免疫力低下受试者具有低于5x109个细胞/升，或低于4x109个细胞/升，或低于3x109个细胞/升，或低于2x109个细胞/升，或低于1x109个细胞/升，或低于0.5x109个细胞/升，或低于0.3x109个细胞/升，或低于0.1x109个细胞/升的白血细胞计数(白细胞计数)。
白血细胞计数(白细胞计数)：血液中的白血细胞(wbc)的数目。wbc通常被测量为cbc(全血计数)的部分。白血细胞是血液中的抗感染细胞，并且与被称为红细胞的红(载氧)血细胞不同。存在不同类型的白血细胞，包括嗜中性粒细胞(多形核白细胞；pmn)、杆状核细胞(轻度未成熟嗜中性粒细胞)、t型淋巴细胞(t细胞)、b型淋巴细胞(b细胞)、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。所有类型的白血细胞反映于白血细胞计数中。白血细胞计数的正常范围通常在每立方毫米血液4300个细胞与10800个细胞之间。这也可被称为白细胞计数，并且可以以国际单位表示为4.3-10.8x109个细胞/升。
在本发明的具体实施方案中，待接种的免疫力低下受试者患有嗜中性粒细胞减少症。在本发明的具体实施方案中，待接种的免疫力低下受试者具有低于2x109个细胞/升，或低于1x109个细胞/升，或低于0.5x109个细胞/升，或低于0.1x109个细胞/升，或低于0.05x109个细胞/升的嗜中性粒细胞计数。
低白血细胞计数或“嗜中性粒细胞减少症”是特征在于循环血液中异常低水平的嗜中性粒细胞的病况。嗜中性粒细胞是帮助预防和抵抗感染的特殊类型的白血细胞。癌症患者经历嗜中性粒细胞减少症的最常见原因是作为化疗的副作用。化疗诱导的嗜中性粒细胞减少症增加了患者的感染风险并使癌症治疗中断。
在本发明的具体实施方案中，待接种的免疫力低下受试者具有低于500/mm3的cd4+细胞计数，或低于300/mm3的cd4+细胞计数，或低于200/mm3cd4+细胞计数，低于100/mm3的cd4+细胞计数，低于75/mm3的cd4+细胞计数，或低于50/mm3的cd4+细胞计数。
cd4细胞测试通常被报告为1mm3中的细胞的数目。正常cd4计数在500个与1600个之间，cd8计数在375个与1100个之间。cd4计数在患有hiv的患者中急剧下降。
在本发明的实施方案中，本文公开的任何免疫力低下受试者为男人或女人。
组合物中缀合物的量通常基于针对该缀合物是缀合的和非缀合的总多糖来计算。例如，具有20％游离多糖的缀合物将在100mcg多糖剂量中具有约80mcg缀合的多糖和约20mcg非缀合的多糖。当计算缀合物的剂量时，通常不考虑蛋白质对缀合物的贡献。通常地，每一个剂量将包含0.1至100mcg，具体地0.1至10mcg，更具体地1至10mcg以及更具体地1至5μg的多糖。优选地，每一个剂量将包含约1.1、2、2.2、3、3.3、4、4.4μg多糖。
可通过牵涉观察受试者中适当的免疫应答的标准研究来确定特定免疫原性组合物或疫苗的组分的最佳量。在初始接种后，受试者可接受一次或数次适当间隔的加强免疫。
可通过增殖测定，通过测量t细胞裂解其特定靶细胞的能力的细胞溶解测定诸如铬释放测定，或通过测量b细胞活性的水平(通过测量血清中特异于抗原的循环抗体的水平)来测量抗原作为免疫原的功效。还可通过测量在施用抗原后诱导的抗原特异性抗体的血清水平，和更具体地，通过测量所诱导的抗体增强特定白血细胞的调理吞噬能力的能力来检测免疫应答，如本文中所描述的。免疫应答的保护水平可通过用已被施用的抗原攻击经免疫的宿主来测量。例如，如果针对其的免疫应答是期望的抗原为细菌，则由免疫原性量的抗原诱导的保护水平通过在用所述细菌细胞攻击动物后检测百分比存活率或百分比死亡率来测量。在一个实施方案中，可通过测量至少一个与细菌感染相关的症状，例如与感染相关的发热来测量保护量。多抗原或多组分疫苗或免疫原性组合物中的每一种抗原的量可相对每一种其它组分而变化，并且可通过本领域技术人员已知的方法来测定。这样的方法可包括用于测量免疫原性和/或体内功效的方法。
本公开内容还提供了特异性和选择性结合本公开内容的荚膜多糖或糖缀合物的抗体和抗体组合物。在一些实施方案中，在对受试者施用本公开内容的荚膜多糖或糖缀合物后产生抗体。在一些实施方案中，本公开内容提供了针对本公开内容的一种或多种荚膜多糖或糖缀合物的纯化的或分离的抗体。在一些实施方案中，本公开内容的抗体具有功能，如通过在动物功效模型中杀死细菌或经由调理吞噬杀死测定测量的。在一些实施方案中，本公开内容的抗体给受试者赋予被动免疫。通过使用本领域技术人员公知的技术，本公开内容还提供编码本公开内容的抗体或抗体片段的多核苷酸分子，以及产生本公开内容的抗体或抗体组合物的细胞、细胞系(诸如用于抗体的重组产生的杂交瘤细胞或其它工程细胞系)或转基因动物。
实施例
实施例1:血清型22f多糖–crm197缀合物的制备
1.1.分离的肺炎链球菌血清型22f多糖的制备
可使用本领域普通技术人员已知的分离方法直接从细菌获得血清型22f荚膜多糖。(参见例如美国专利申请公开号20060228380,20060228381,20070184071,20070184072,20070231340和20080102498或wo2008118752中公开的方法)。将血清型22f肺炎链球菌生长在接种瓶中，随后转移至接种发酵罐。一旦达到靶向光学密度，就将细胞转移至生产发酵罐中。发酵肉汤通过添加n-月桂酰基肌氨酸灭活和通过超滤和渗滤纯化。
使用panda2k均化器
1.2.分离的肺炎链球菌血清型22f荚膜多糖的氧化
在通过连续添加计算的量的500mm磷酸钾缓冲液(ph5.8)和wfi(以提供2.0g/l的多糖终浓度)获得的100mm磷酸钾缓冲液(ph5.8±0.2)中进行多糖的氧化。必要时，将反应ph调整至大致5.8。在ph调整后，将反应温度降至5±3℃。通过添加0.10±0.02摩尔当量(meq)的高碘酸钠来起始氧化。靶氧化反应时间为在5±3℃下16±1小时。
通过在5±3℃连续搅拌1-2小时，用2meq的2,3-丁二醇猝灭氧化反应。
使用100kmwco超滤盒进行活化的多糖的浓缩和渗滤。针对35倍渗滤体积的wfi进行渗滤。将纯化的活化的多糖于5±3℃下贮存。纯化的活化的糖通过除其它以外(i)通过sec-malls测量的分子量，(ii)o-乙酰基的存在和(iii)氧化程度来表征。
sec-malls用于测定多糖和多糖-蛋白质缀合物的分子量。sec用于通过流体力学体积分离多糖。折射率(ri)和多角度激光光散射(malls)检测器用于测定分子量。当光与物质相互作用时，其散射，并且散射光的量与浓度、dn/dc(特定的折射率增量)的平方和物质的摩尔质量相关。基于来自malls检测器的散射光信号和来自ri检测器的浓度信号的读数计算分子量测量值。
如下测定活化的多糖的氧化程度(do＝糖重复单元的摩尔数/醛的摩尔数)：
通过各种比色法，诸如例如通过使用蒽酮法测定糖重复单元的摩尔数。首先通过硫酸和热的作用将多糖分解成单糖。蒽酮测糖试剂与己糖反应以形成黄绿色复合物，其吸光度在625nm处通过分光光度计读取。在测定的范围内，吸光度直接与存在的己糖的量成比例。
还同时使用mbth比色法测定醛的摩尔数。mbth测定牵涉通过将醛基团(来自给定的样品)与3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(mbth测定试剂)反应来形成吖嗪化合物。过量的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙氧化以形成反应性阳离子。所述反应性阳离子与吖嗪反应以形成蓝色生色团。随后在650nm处通过分光光度计读取所形成的发色团。
1.3.活化的肺炎链球菌血清型22f多糖与crm197的缀合
缀合方法由以下步骤组成：
a.与蔗糖赋形剂混合，并冷冻干燥。
b.重建冻干的多糖和crm197。
c.将活化的多糖缀合于crm197并加帽
d.纯化缀合物。
a.与蔗糖混合和冷冻干燥
将活化的多糖与蔗糖(50％w/v，于wfi中)混合至每克活化的多糖25克蔗糖的比率。随后冻干瓶装的混合的混合物。在冻干后，将装有冻干的活化的多糖的瓶子在-20±5℃下贮存。分别地壳式冷冻和冻干计算的量的crm197蛋白(靶s/p输入比率＝1)。将冻干的crm197于-20±5℃下贮存。
b.冻干的活化的多糖和crm197蛋白的重建
在无水二甲基亚砜(dmso)中重建冻干的活化的多糖。在多糖完全溶解后，将等量的无水dmso添加至冻干的crm197以进行重建。
c.将活化的多糖缀合于crm197并加帽
将重建的crm197(于dmso中)与重建的活化的多糖在缀合反应容器中组合。反应溶液中的多糖终浓度为1g/l。通过向反应混合物中添加1.5±0.1meq氰基硼氢化钠来起始缀合，将反应在23±2℃下温育20±2小时。通过添加2meq硼氢化钠来终止缀合反应。将加帽反应于23±2℃温育3±1小时。
d.纯化缀合物
在制剂中用冰冷的5mm琥珀酸盐-0.9％盐水(ph6.0)以1:5稀释缀合物溶液，以用于使用100kmwco膜通过切向流过滤来纯化，使用5mm琥珀酸盐-0.9％盐水(ph6.0)作为介质进行20x渗滤。在完成渗滤后，进一步稀释缀合物渗余物，将其通过0.22μm滤器过滤，并于2-8℃下贮存。
表1包含通过本发明的方法获得的血清型22f多糖-crm197缀合物的表征数据。具体地，如实施例1中所公开的获得表中的缀合物5和6。
相较于通过rac-含水法产生的缀合物，通过rac-dmso法产生的血清型22f多糖-crm197缀合物提供了更好的产率，并且在mw上表现出更好的批间一致性，以及显著更低的游离糖百分比水平和较高的载体蛋白(赖氨酸)修饰，如表1中显示的。
如下计算缀合物产率百分比：(缀合物中的多糖的量x100)/活化的多糖的量。
实施例2:血清型10a多糖–crm197缀合物的制备
2.1.分离的肺炎链球菌血清型10a多糖的制备
除不裁剪纯化的多糖外，如实施例1.1中所公开的获得分离的血清型10a多糖。
2.2.分离的肺炎链球菌血清型10a荚膜多糖的氧化
将计算的体积的0.1m磷酸钾缓冲液(ph6.0)和注射用水(wfi)添加至多糖溶液以获得2.5g/l的多糖终浓度和25mm终浓度的磷酸钾缓冲液，必要时，将ph调整至大致6.0。随后将稀释的多糖冷却至5±3℃。通过添加0.25±0.02摩尔当量(meq)的高碘酸钠溶液起始氧化。氧化反应时间为在5±3℃约4小时。通过在5±3℃连续搅拌1-2小时，用1meq的2,3-丁二醇猝灭氧化反应。
在达到靶反应时间后，使用30kmwcomillipore超滤盒浓缩活化的多糖。随后针对20倍渗滤体积的wfi进行渗滤。将纯化的活化的多糖于5±3℃下贮存。纯化的活化的多糖通过除其它以外(i)通过sec-malls测量的分子量，和(ii)氧化程度来表征。
2.3活化的肺炎链球菌血清型10a多糖与crm197的缀合
缀合反应由以下步骤组成：
a.与蔗糖赋形剂混合，并冷冻干燥。
b.重建冻干的多糖和crm197。
c.将活化的多糖缀合于crm197并加帽
d.纯化缀合物。
a.与蔗糖混合
将活化的多糖与蔗糖混合至每克活化的多糖25±2.5克蔗糖的比率。随后冻干瓶装的混合的混合物。在冻干后，将装有冻干的活化的多糖的瓶子在-20±5℃下贮存。
b.冻干的活化的多糖和crm197蛋白的重建
在无水二甲基亚砜(dmso)中重建冻干的活化的多糖。在多糖完全溶解后，将等量的无水dmso添加至计算的crm197以进行重建。
c.将活化的多糖缀合于crm197并加帽
将重建的crm197(于dmso中)于缀合反应容器中添加至重建的活化的多糖。多糖终浓度为1g/l。通过向反应混合物中添加1.2±0.1meq的氰基硼氢化钠来进行缀合。将反应在23±2℃下温育24±2小时。通过添加2meq硼氢化钠来终止缀合反应。将加帽反应于23±2℃温育3±1小时。
通过添加2meq的硼氢化钠来终止缀合反应。将此加帽反应在23±2℃进行3±1小时。
d.缀合物的纯化
随后将缀合物溶液稀释至5x(按体积)冰冷的5mm琥珀酸盐-0.9％盐水(ph6.0)中并且使用5mm琥珀酸盐-0.9％盐水(ph6.0)进行20x渗滤。在完成初始渗滤后，将缀合物渗余物转移通过0.22μm过滤器。用5mm琥珀酸盐/0.9％盐水(ph6)进一步稀释缀合物，并在最终的0.22μm过滤步骤后，将其于2-8℃下贮存。
表2包含通过本发明的方法获得的血清型10a多糖-crm197缀合物的表征数据。具体地，如实施例2中所公开的获得表2中的缀合物4至6。
相较于通过rac-含水法产生的缀合物，通过rac-dmso法产生的血清型10a多糖-crm197缀合物提供了更好的产率，并且在mw上表现出更好的批间一致性，以及显著更低的游离糖百分比水平和较高的载体蛋白(赖氨酸)修饰，如表2中显示的。
实施例3:血清型33f多糖–crm197缀合物的制备
3.1.分离的肺炎链球菌血清型33f多糖的制备
如实施例1.1中公开的，获得分离的血清型33f多糖。
3.2.分离的肺炎链球菌血清型33f荚膜多糖的氧化
将计算的体积的0.1m磷酸钾缓冲液(ph6.0)和注射用水(wfi)添加至多糖溶液以获得2g/l的多糖终浓度。必要时，将ph调整至大致6.0。随后将稀释的多糖冷却至5±3℃。通过添加0.1摩尔当量(meq)的高碘酸钠溶液起始氧化。氧化反应时间为在5±3℃约20小时。通过在5±3℃连续搅拌约1小时，用1meq的2,3-丁二醇猝灭氧化反应。在达到靶反应时间后，使用100kmwcomillipore超滤盒浓缩活化的多糖。随后针对40倍渗滤体积的wfi进行渗滤。将纯化的活化的多糖于5±3℃贮存。纯化的活化的糖通过除其它以外(i)通过sec-malls测量的分子量和(ii)氧化程度来表征。
3.3活化的肺炎链球菌血清型33f多糖与crm197的缀合
使用实施例3.2中获得的活化的33f多糖，通过与实施例1.3的方法类似的方法获得血清型33f多糖-crm197缀合物。
相较于通过rac-含水法产生的缀合物，通过rac-dmso法产生的血清型33f多糖-crm197缀合物提供更好的产率并且在o-乙酰基水平的保持上表现出更好的批间一致性以及总体更低的游离糖百分比水平和较高的载体蛋白(赖氨酸)修饰，如表3中显示的。
loq＝定量限
实施例4:猝灭对活化的血清型22f和33f多糖的分子量的影响
在4℃或22℃进行22f和33f多糖的活化。两个温度均给出相似的do值。然而，由于升高的温度导致活化的多糖较快分解，从而降低活化的多糖的mw(如当例如比较图4(22℃)与图5(4℃)时显示的)，4℃对于活化反应通常是优选的。另外，活化数据显示在氧化后未反应的naio4的猝灭对于活化，尤其是对于使用较高量的naio4的活化是必需步骤。图6中显示的图表明当将递增浓度的高碘酸盐用于活化时(具有猝灭)活化的33f多糖的mw是相对稳定的，而当不使用猝灭步骤时，这样的mw是高度可变的。在设置来获得靶向的氧化程度的特定条件下，当使用猝灭步骤时，活化的多糖的分子量是较少可变的。氧化后猝灭剂的添加帮助保持活化的多糖的结构完整性，直至例如通过超滤和渗滤完成纯化。
实施例5:调理吞噬活性测定(opa)
可使用下述调整吞噬测定(opa)评估通过本文公开的方法获得的缀合物的免疫原性。
在第0周通过皮下途径利用0.001μg、0.01μg或0.1μg的测试缀合物免疫30只6-7周龄雌性swisswebster小鼠的组。在第3周利用相同剂量的缀合物加强免疫小鼠，随后在第4周取血。对第4周血清样品进行血清型特异性opa。
将经验证的调整吞噬活性(opa)测定用于测量鼠血清中的特异于肺炎链球菌血清型10a、22f或33f的功能性抗体。在测量荚膜多糖特异性免疫球蛋白调理细菌、触发补体沉积，从而促进吞噬作用和吞噬细胞对细菌的杀死的能力的测定反应中建立测试血清。opa滴度被定义为导致相对于无测试血清的对照孔细菌计数的50％减少的稀释度倒数。从包含该50％杀死截断值的两个稀释度内插opa滴度。
opa法基于hu等,clindiagnlabimmunol2005；12(february(2)):287–95中描述的方法并进行了以下修饰。将测试血清进行2.5倍系列稀释，并添加至微量滴定测定板。将活的血清型10a、22f和33f靶细菌菌株添加至孔中，并在25℃(血清型22f)或37℃(血清型10a和33f)下摇动板，进行30分钟。将分化的hl-60细胞(吞噬细胞)和幼兔血清(3至4周龄，
在上述公开的opa测定中测试如实施例1至3中所公开的获得的血清型10a多糖-crm197缀合物、血清型22f多糖-crm197缀合物和血清型33f多糖-crm197缀合物，并发现其是免疫原性的。
本说明书还包括下列内容：
1.一种用于制备活化的肺炎链球菌血清型10a、22f或33f荚膜多糖的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将分离的血清型10a、22f或33f荚膜多糖与氧化剂反应；和
(b)通过添加猝灭剂来猝灭氧化反应，从而导致活化的肺炎链球菌血清型10a、22f或33f多糖。
2.实施方式1的方法，其中步骤(a)中的血清型10a、22f或33f多糖的浓度在0.5mg/ml与5mg/ml之间。
3.实施方式1或2的方法，其中在步骤(a)中将所述多糖与0.01至10摩尔当量、0.05至5摩尔当量、0.1至1摩尔当量、0.5至1摩尔当量、0.7至0.8摩尔当量、0.01至0.2摩尔当量、0.05至0.5摩尔当量、0.05至0.2摩尔当量、0.1至0.3摩尔当量的氧化剂反应。
4.实施方式1至3的任一项的方法，其中在步骤(a)中将所述多糖与0.05至0.3摩尔当量的氧化剂反应。
5.实施方式1至4的任一项的方法，其中所述氧化剂为高碘酸盐。
6.实施方式1至4的任一项的方法，其中所述氧化剂为偏高碘酸钠。
7.实施方式1至6的任一项的方法，其中将步骤(a)中的反应温度维持在1℃与10℃之间。
8.实施方式1至7的任一项的方法，其中步骤(a)中的反应温度为约℃或约5℃。
9.实施方式1至8的任一项的方法，其中步骤(a)的持续时间在约1小时与25小时之间。
10.实施方式1至9的任一项的方法，其中所述猝灭剂选自邻二醇、1,2-氨基醇、氨基酸、谷胱甘肽、亚硫酸盐、硫酸氢盐、连二亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、硫代硫酸盐、亚磷酸盐、次磷酸盐或亚磷酸。
11.实施方式1至9的任一项的方法，其中所述猝灭剂为式(ii)的化合物
，其中r1和r2各自独立地选自h、甲基、乙基、丙基或异丙基。
12.实施方式1至9的任一项的方法，其中所述猝灭剂选自甘油、乙二醇、丙-1,2-二醇、丁-1,2-二醇或丁-2,3-二醇。
13.实施方式1至9的任一项的方法，其中所述猝灭剂为丁-2,3-二醇。
14.实施方式1至13的任一项的方法，其中通过添加0.1至10、0.5至5、0.5至3或0.5至2摩尔当量的猝灭剂来猝灭氧化反应。
15.实施方式1至13的任一项的方法，其中通过添加0.5至2摩尔当量的猝灭剂来猝灭氧化反应。
16.实施方式1至15的任一项的方法，其中将步骤(b)中的反应温度维持在1℃与10℃之间。
17.实施方式1至16的任一项的方法，其中步骤(b)中的反应温度为约4℃。
18.实施方式1至17的任一项的方法，其中步骤(b)的持续时间在0.5与2小时之间。
19.实施方式1至18的任一项的方法，其中在步骤(b)后纯化所述活化的多糖。
20.实施方式1至19的任一项的方法，其中所述分离的多糖为分离的肺炎链球菌血清型10a多糖。
21.实施方式20的方法，其中通过包含以下步骤的方法获得所述分离的肺炎链球菌血清型10a多糖：
(a)制备血清型10a肺炎链球菌细菌细胞的发酵培养物；
(b)裂解所述发酵培养物中的细菌细胞；和
(c)从所述发酵培养物纯化血清型10a多糖。
22.一种活化的肺炎链球菌血清型10a荚膜多糖，其通过实施方式1至21的任一项的方法获得。
23.一种活化的肺炎链球菌血清型10a荚膜多糖，其可通过实施方式1至21的任一项的方法获得。
24.实施方式22或23的任一项的活化的肺炎链球菌血清型10a荚膜多糖，其中所述多糖具有50kda与400kda之间、50kda与350kda之间、50kda与300kda之间、50kda与250kda之间、50kda与200kda之间、100kda与300kda之间、100kda与250kda之间、或100kda与200kda之间的分子量。
25.实施方式22或23的任一项的活化的肺炎链球菌血清型10a荚膜多糖，其中所述多糖具有50kda与300kda之间的分子量。
26.实施方式22或23的任一项的活化的肺炎链球菌血清型10a荚膜多糖，其中所述多糖具有100kda与200kda之间的分子量。
27.实施方式22至26的任一项的活化的肺炎链球菌血清型10a荚膜多糖，其中所述多糖具有5与20之间、5与15之间、8与14之间、8与12之间或9与11之间的氧化程度。
28.实施方式22至26的任一项的活化的肺炎链球菌血清型10a荚膜多糖，其中所述多糖具有9与11之间的氧化程度。
29.实施方式1至19的任一项的方法，其中所述分离的多糖为分离的肺炎链球菌血清型22f多糖。
30.实施方式29的方法，其中通过包含以下步骤的方法获得所述分离的肺炎链球菌血清型22f多糖：
(a)制备血清型22f肺炎链球菌细菌细胞的发酵培养物；
(b)裂解所述发酵培养物中的细菌细胞；
(c)从所述发酵培养物纯化血清型22f多糖；和
(d)通过机械裁剪，优选通过高压均化来裁剪所述血清型22f多糖。
31.一种活化的肺炎链球菌血清型22f荚膜多糖，其通过实施方式1至19或29或30的任一项的方法获得。
32.一种活化的肺炎链球菌血清型22f荚膜多糖，其可通过实施方式1至19或29或30的任一项的方法获得。
33.实施方式31或32的任一项的活化的肺炎链球菌血清型22f荚膜多糖，其中所述多糖具有25kda与1000kda之间、100kda与1000kda之间、300kda与800kda之间、300kda与700kda之间、300kda与600kda之间、400kda与1000kda之间、400kda与800kda之间、400kda与700kda之间或400kda与600kda之间的分子量。
34.实施方式31或32的任一项的活化的肺炎链球菌血清型22f荚膜多糖，其中所述多糖具有300kda与800kda之间的分子量。
35.实施方式31或32的任一项的活化的肺炎链球菌血清型22f荚膜多糖，其中所述多糖具有400kda与600kda之间的分子量。
36.实施方式31至35的任一项的活化的肺炎链球菌血清型22f荚膜多糖，其中所述多糖具有10与25之间、10与20之间、12与20之间或14与18之间的氧化程度。
37.实施方式31至35的任一项的活化的肺炎链球菌血清型22f荚膜多糖，其中所述多糖具有10与20之间的氧化程度。
38.实施方式31至37的任一项的活化的肺炎链球菌血清型22f荚膜多糖，其中所述多糖包含每mm血清型22f多糖至少0.6mm的醋酸盐。
39.实施方式1至19的任一项的方法，其中所述分离的多糖是分离的肺炎链球菌血清型33f多糖。
40.实施方式39的方法，其中所述分离的肺炎链球菌血清型33f多糖通过包含以下步骤的方法获得：
(a)制备血清型33f肺炎链球菌细菌细胞的发酵培养物；
(b)裂解所述发酵培养物中的细菌细胞；
(c)从发酵培养物纯化血清型33f多糖；和
(d)通过机械裁剪，优选通过高压均化来裁剪所述血清型33f多糖。
41.一种活化的肺炎链球菌血清型33f荚膜多糖，其通过实施方式1至19或39或40的任一项的方法获得。
42.一种活化的肺炎链球菌血清型33f荚膜多糖，其可通过实施方式1至19或39或40的任一项的方法获得。
43.实施方式39或40的活化的肺炎链球菌血清型33f荚膜多糖，其中所述多糖具有50kda与1250kda之间、200kda与1200kda之间、500kda与1200kda之间、500kda与1000kda之间、700kda与1200kda之间、800kda与1200kda之间、800kda与1100kda之间、900kda与1200kda之间或800kda与1000kda之间的分子量。
44.实施方式39或40的活化的肺炎链球菌血清型33f荚膜多糖，其中所述多糖具有500kda与1000kda之间的分子量。
45.实施方式39或40的活化的肺炎链球菌血清型33f荚膜多糖，其中所述多糖具有50kda与400kda之间的分子量。
46.实施方式41至45的任一项的活化的肺炎链球菌血清型33f荚膜多糖，其中所述多糖具有10与20之间的氧化程度。
47.实施方式41至34的任一项的活化的肺炎链球菌血清型33f荚膜多糖，其中所述多糖包含每mm血清型33f多糖至少0.7mm的醋酸盐。
48.实施方式1至47的任一项的方法，其中在步骤(b)后冷冻干燥所述活化的多糖。
49.一种用于制备包含共价连接于载体蛋白的肺炎链球菌血清型10a、22f或33f多糖的免疫原性缀合物的方法，所述方法包括步骤：
(a)将通过或可通过实施方式1至19的任一项的方法获得的活化的血清型10a、22f或33f多糖与载体蛋白混合；和，
(b)将混合的活化的血清型10a、22f或33f多糖和载体蛋白与还原剂反应，以形成血清型10a、22f或33f多糖:载体蛋白缀合物。
50.实施方式49的方法，所述方法还包括步骤：
(c)将所述血清型10a、22f或33f多糖:载体蛋白缀合物中的未反应的醛加帽。
51.实施方式49或50的方法，其中在dmso中进行步骤(a)和(b)。
52.实施方式49或50的方法，其中在水溶液中进行步骤(a)和(b)。
53.实施方式49至52的任一项的方法，其中在步骤(a)后共同冷冻干燥所述活化的多糖和蛋白质载体。
54.实施方式53的方法，其中在dmso中进行步骤(b)。
55.实施方式53的方法，其中在水溶液中进行步骤(b)。
56.实施方式49至55的任一项的方法，其中步骤(b)中的活化的多糖的浓度在0.1mg/ml与10mg/ml之间、0.5mg/ml与5mg/ml之间或0.5mg/ml与2mg/ml之间。
57.实施方式49至55的任一项的方法，其中步骤(b)中的活化的多糖的浓度在0.5mg/ml与2mg/ml之间。
58.实施方式49至57的任一项的方法，其中活化的血清型10a、22f或33f多糖对载体蛋白的初始比率在5:1与0.1:1之间、2:1与0.1:1之间、2:1与1:1之间、1.5:1与1:1之间、0.1:1与1:1之间、0.3:1与1:1之间或0.6:1与1.2:1之间。
59.实施方式49至57的任一项的方法，其中活化的血清型10a、22f或33f多糖对载体蛋白的初始比率在0.6:1与1.2:1之间。
60.实施方式49至59的任一项的方法，其中在步骤(b)中，将所述活化的多糖与0.5与2.5摩尔当量之间的还原剂反应。
61.实施方式49至60的任一项的方法，其中所述还原剂为氰基硼氢化钠。
62.实施方式49至61的任一项的方法，其中步骤(d)的持续时间在20小时与30小时之间。
63.实施方式49至62的任一项的方法，其中将步骤d中的反应温度维持在20℃与26℃之间。
64.实施方式53的方法，其中通过添加约2摩尔当量的nabh4来使未反应的醛加帽。
65.实施方式49至64的任一项的方法，其还包括纯化所述多糖:载体蛋白缀合物的步骤。
66.实施方式49至65的任一项的方法，其还包括通过切向流过滤和渗滤纯化所述多糖:载体蛋白缀合物的步骤。
67.一种包含共价连接于载体蛋白的肺炎链球菌血清型10a多糖的免疫原性缀合物，其通过实施方式49至66的任一项的方法获得。
68.一种包含共价连接于载体蛋白的肺炎链球菌血清型10a多糖的免疫原性缀合物，其可通过实施方式49至66的任一项的方法获得。
69.实施方式67或68的免疫原性缀合物，其中所述缀合物具有500kda与15000kda之间、500kda与10000kda之间、2000kda与10000kda之间或3000kda与8000kda之间的分子量。
70.实施方式67或68的免疫原性缀合物，其中所述缀合物具有3000kda与8000kda之间的分子量。
71.实施方式67至70的任一项的免疫原性缀合物，其中所述缀合物包含相较于血清型10a多糖的总量少于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或15％的游离血清型10a多糖。
72.实施方式67至70的任一项的免疫原性缀合物，其中所述缀合物包含相较于血清型10a多糖的总量少于约20％的游离血清型10a多糖。
73.实施方式67至72的任一项的免疫原性缀合物，其中所述缀合物中的血清型10a多糖对载体蛋白的比率在0.5与3之间。
74.实施方式67至72的任一项的免疫原性缀合物，其中所述缀合物中的血清型10a多糖对载体蛋白的比率在0.8与1.4之间。
75.实施方式67至74的任一项的免疫原性缀合物，其中至少40％的所述免疫原性缀合物具有在cl-4b柱中低于或等于0.3的kd。
76.实施方式67至74的任一项的免疫原性缀合物，其中50％与80％之间的所述血清型10a免疫原性缀合物具有在cl-4b柱中低于或等于0.3的kd。
77.实施方式67至76的任一项的免疫原性缀合物，其中所述免疫原性缀合物的缀合程度在2与15之间、2与13之间、2与10之间、2与8之间、2与6之间、2与5之间、2与4之间、3与15之间、3与13之间、3与10之间、3与8之间、3与6之间、3与5之间、3与4之间、5与15之间、5与10之间、8与15之间、8与12之间、10与15之间或10与12之间。
78.实施方式67至76的任一项的免疫原性缀合物，其中所述免疫原性缀合物的缀合程度在6与8之间。
79.一种包含共价连接于载体蛋白的肺炎链球菌血清型22f多糖的免疫原性缀合物，其通过实施方式49至66的任一项的方法获得。
80.一种包含共价连接于载体蛋白的肺炎链球菌血清型22f多糖的免疫原性缀合物，其可通过实施方式49至66的任一项的方法获得。
81.实施方式79或80的免疫原性缀合物，其中所述缀合物包含每mm血清型22f多糖至少0.5、0.6或0.7mm的醋酸盐。
82.实施方式79或80的免疫原性缀合物，其中所述免疫原性缀合物中每mm血清型22f多糖的醋酸盐的mm数对分离的多糖中每mm血清型22f多糖的醋酸盐的mm数的比率为至少0.7。
83.实施方式79至82的任一项的免疫原性缀合物，其中所述免疫原性缀合物中每mm血清型22f多糖的醋酸盐的mm数对活化的多糖中每mm血清型22f多糖的醋酸盐的mm数的比率为至少0.7。
84.实施方式79至83的任一项的免疫原性缀合物，其中所述缀合物具有400kda与15000kda之间、500kda与10000kda之间、2000kda与10000kda之间、3000kda与8000kda之间或3000kda与5000kda之间的分子量。
85.实施方式79至83的任一项的免疫原性缀合物，其中所述缀合物具有3000kda与5000kda之间的分子量。
86.实施方式79至85的任一项的免疫原性缀合物，其中所述缀合物包含相较于血清型22f多糖的总量少于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或15％的游离血清型22f多糖。
87.实施方式79至83的任一项的免疫原性缀合物，其中所述缀合物包含相较于血清型22f多糖的总量少于约20％的游离血清型22f多糖。
88.实施方式79至87的任一项的免疫原性缀合物，其中所述缀合物中血清型22f多糖对载体蛋白的比率在0.5与2之间。
89.实施方式79至87的任一项的免疫原性缀合物，其中所述缀合物中血清型22f多糖对载体蛋白的比率在0.8与1.2之间。
90.实施方式79至89的任一项的免疫原性缀合物，其中至少40％的所述免疫原性缀合物具有在cl-4b柱中低于或等于0.3的kd。
91.实施方式79至89的任一项的免疫原性缀合物，其中50％与80％之间的所述血清型22f免疫原性缀合物具有在cl-4b柱中低于或等于0.3的kd。
92.实施方式79至91的任一项的免疫原性缀合物，其中所述免疫原性缀合物的缀合程度在2与15之间、2与13之间、2与10之间、2与8之间、2与6之间、2与5之间、2与4之间、3与15之间、3与13之间、3与10之间、3与8之间、3与6之间、3与5之间、3与4之间、4与7之间、5与15之间、5与10之间、8与15之间、8与12之间、10与15之间或10与12之间。
93.实施方式79至91的任一项的免疫原性缀合物，其中所述免疫原性缀合物的缀合程度在4与7之间。
94.一种包含共价连接于载体蛋白的肺炎链球菌血清型33f多糖的免疫原性缀合物，其通过实施方式49至66的任一项的方法获得。
95.一种包含共价连接于载体蛋白的肺炎链球菌血清型33f多糖的免疫原性缀合物，其可通过实施方式49至66的任一项的方法获得。
96.实施方式94或95的免疫原性缀合物，其中所述缀合物包含每mm血清型33f多糖至少0.5mm、0.6mm或0.7mm的醋酸盐。
97.实施方式94或95的免疫原性缀合物，其中所述免疫原性缀合物中每mm血清型33f多糖的醋酸盐的mm数对分离的多糖中每mm血清型33f多糖的醋酸盐的mm数的比率为至少0.7。
98.实施方式94至97的任一项的免疫原性缀合物，其中所述免疫原性缀合物中每mm血清型33f多糖的醋酸盐的mm数对活化的多糖中每mm血清型33f多糖的醋酸盐的mm数的比率为至少0.7。
99.实施方式94至98的任一项的免疫原性缀合物，其中所述缀合物具有500kda与30000kda之间、500kda与25000kda之间、500kda与20000kda之间、500kda与15000kda之间、500kda与10000kda之间、1000kda与10000kda之间、1000kda与8000kda之间、1000kda与5000kda之间、2000kda与10000kda之间、2000kda与8000kda之间或2000kda与5000kda之间的分子量。
100.实施方式94至98的任一项的免疫原性缀合物，其中所述缀合物具有1000kda与5000kda之间的分子量。
101.实施方式94至100的任一项的免疫原性缀合物，其中所述缀合物含有相较于血清型33f多糖的总量少于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或15％的游离血清型33f多糖。
102.实施方式94至100的任一项的免疫原性缀合物，其中所述缀合物包含相较于血清型22f多糖的总量少于约20％的游离血清型22f多糖。
103.实施方式94至102的任一项的免疫原性缀合物，其中所述缀合物中血清型33f多糖对载体蛋白的比率在0.5与2之间。
104.实施方式94至102的任一项的免疫原性缀合物，其中所述缀合物中血清型22f多糖对载体蛋白的比率在0.5与1.5之间。
105.实施方式94至104的任一项的免疫原性缀合物，其中至少40％的所述免疫原性缀合物具有在cl-4b柱中低于或等于0.3的kd。
106.实施方式94至104的任一项的免疫原性缀合物，其中40％与80％之间的所述血清型33f免疫原性缀合物具有在cl-4b柱中低于或等于0.3的kd。
107.实施方式94至106的任一项的免疫原性缀合物，其中所述免疫原性缀合物的缀合程度在2与15之间、2与13之间、2与10之间、2与8之间、2与6之间、2与5之间、2与4之间、3与15之间、3与13之间、3与10之间、3与8之间、3与6之间、3与5之间、3与4之间、5与15之间、5与10之间、8与15之间、8与12之间、10与15之间或10与12之间。
108.实施方式94至106的任一项的免疫原性缀合物，其中所述免疫原性缀合物的缀合程度在4与6之间。
109.实施方式67至108的任一项的免疫原性缀合物，其中所述载体蛋白为crm197。
110.实施方式49至66的任一项的方法，其中所述载体蛋白为crm197。
111.实施方式49至66的任一项的方法，其中所述活化的多糖为血清型10a。
112.实施方式49至66的任一项的方法，其中所述活化的多糖为血清型22f。
113.实施方式49至66的任一项的方法，其中所述活化的多糖为血清型33f。
114.实施方式49至66和110至113的任一项的方法，其中所述方法还包括在多价疫苗中配制所述缀合物的步骤。
115.一种免疫原性组合物，其包含实施方式67至109的任一项的免疫原性缀合物和生理上可接受的媒介物。
116.实施方式115的免疫原性组合物，其还包含至少一种另外的抗原。
117.实施方式115或116的免疫原性组合物，其还包含佐剂。
118.实施方式117的免疫原性组合物，其中所述佐剂为磷酸铝。
119.一种疫苗，其包含实施方式115至118的任一项的免疫原性组合物。
120.一种治疗或预防受试者的与血清型10a、22f或33f肺炎链球菌相关的肺炎链球菌感染、疾病或病况的方法，所述方法包括施用治疗或预防有效量的实施方式115至118的任一项的免疫原性组合物或实施方式119的疫苗的步骤。
序列表
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<120>肺炎链球菌荚膜多糖及其缀合物
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<213>人工序列
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<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>c-类寡核苷酸
<400>33
tcgcgtcgttcggcgccg18
<210>34
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>c-类寡核苷酸
<400>34
tcgcgacgttcggcgcgcgccg22
<210>35
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>c-类寡核苷酸
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tcgtcgttttcggcgcgcgccg22
<210>36
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
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<223>c-类寡核苷酸
<400>36
tcgtcgttttcggcggccgccg22
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<213>人工序列
<220>
<223>c-类寡核苷酸
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<213>人工序列
<220>
<223>c-类寡核苷酸
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<211>23
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<213>人工序列
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<211>23
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>p类cpg寡核苷酸
<400>40
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