DDIT4L及其功能小肽对胶质母细胞瘤的抑制作用的制作方法

本发明属于生物技术和医学领域。具体而言，本发明涉及dna损伤诱导转录本4样(ddit4l)活性物质(如ddit4l及其功能小肽)对胶质瘤(如胶质母细胞瘤)的抑制作用及其相关产品和应用。

背景技术：

胶质瘤(glioma)是源自神经上皮的肿瘤，占颅脑肿瘤的40％～50％，是最常见的原发性颅内肿瘤，年发病率为3～8人/10万人口。胶质瘤中的胶质母细胞瘤(glioblastoma,gbm)是临床上最致命的原发性脑肿瘤。

目前虽然有很多关于胶质瘤的分级系统，但最常用的还是世界卫生组织(who)制定的分级系统。根据这一分级系统，将脑胶质瘤分为低分级胶质瘤(lgg，who1级-2级，分化良好的胶质瘤，虽不属于良性肿瘤，但患者预后相对较好)和高分级胶质瘤(hgg，who3级-4级，低分化胶质瘤，恶性程度较高，预后较差)。其中，传统细胞病理学所谓的间变胶质瘤与who的3级相对应；而胶质母细胞瘤与恶性程度最高的who4级胶质瘤相对应。

肿瘤遗传学的最新研究表明：异柠檬酸脱氢酶(idh)1/2基因在恶性胶质瘤组织经常会出现突变。目前的临床资料显示病理诊断为ii或iii级的胶质瘤约80％存在idh1/2基因突变，iv级的胶质瘤(也称为胶质母细胞瘤)不到10％存在idh1/2基因突变。

野生型的idh是一种代谢酶，催化异柠檬酸氧化脱羧生成α酮戊二酸，α酮戊二酸参与三羧酸循环，通过激活atp合成酶生成atp。在胶质瘤患者组织中，idh1/2基因突变最常见的位点是idh1^r132h。突变的idh是一种新生变形的代谢酶，催化异柠檬酸氧化脱羧生成d-2-羟戊二酸。在突变的idh胶质瘤中，累积的d-2-羟戊二酸可以通过抑制atp合成酶和mtor的活性以及增加rna的n⁶甲基腺苷修饰来抑制肿瘤生长。这些发现给有idh突变的胶质瘤的治疗带来了新的策略。

然而，在胶质母细胞瘤中是否存在具有抑制细胞能量代谢并同时介导细胞凋亡的内源性抑制因子还不得而知。由此，寻找到抑制atp合成酶并能启动细胞凋亡的分子从而对胶质瘤(特别是gbm)产生抑制作用具有重要的意义和迫切性。

dna损伤诱导转录本4样(dnadamage-inducibletranscript4-like,ddit4l)蛋白是一种体内应激蛋白。ddit4l分子最早是在筛选果蝇的tor信号转导途径和影响细胞大小的负性调控因子中发现的，在果蝇中被命名为“charybdis”。在哺乳动物中，它被命名为ddit4l(或称redd2/rtp801l)；它有一个同源蛋白ddit4(或称redd1/rtp801)，其与ddit4l有36％的蛋白序列是相同的。在不同的组织和细胞模型中，这两种蛋白质都被证明为mtor的上游抑制剂。

在人体组织中，ddit4l基因主要表达在骨骼肌中，而ddit4基因则表达在全身各种组织中。在病理状态下，发现超甲基化的ddit4l存在于黑色素瘤中，另一方面，ddit4l也可以抑制病理性的心肌肥大并促进细胞自噬。

然而，本领域中从未揭示ddit4l基因和/或蛋白和/或其活性片段与胶质瘤的相关性。

技术实现要素：

本文中正是提供了ddit4l及其功能小肽对胶质母细胞瘤的抑制作用及其相关产品和应用。

在本发明的第一方面中，提供了dna损伤诱导转录本4样(ddit4l)活性物质在制备用于预防和/或治疗对象中胶质瘤及其相关症状的产品中的应用，其中所述活性物质选自：ddit4l多肽、其活性片段、编码所述多肽或片段的核酸分子、或它们的促进剂。

在一些实施方式中，ddit4l多肽的序列选自：

(a)具有seqidno:2所示氨基酸序列的多肽；或

(b)与seqidno:2所示的氨基酸序列同源或具有序列相同性(例如80％以上同源或具有80％以上序列相同性，如80％、85％、90％、95％、98％、99％)，且具有atp合成酶α亚基结合和抑制活性的多肽；或

(c)(a)或(b)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸、且具有atp合成酶α亚基结合和抑制活性的由(a)或(b)衍生的多肽。

在一些实施方式中，编码ddit4l多肽(例如(a)～(c)中所述ddit4l多肽)的所述核酸分子选自：

(i)具有seqidno:1所示核苷酸序列的核酸分子；或

(ii)在严格条件下与(i)限定的核苷酸序列杂交的分子；

(iii)与seqidno:1所示的核苷酸序列同源或具有序列相同性(例如80％以上同源或具有80％以上序列相同性，如80％、85％、90％、95％、98％、99％)、且编码具有atp合成酶α亚基结合和抑制活性的多肽的核酸分子；

(iv)由(i)或(ii)或(iii)的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸、且编码具有atp合成酶α亚基结合和抑制活性的多肽的核酸分子。

在一些实施方式中，所述活性片段选自：

(a')具有对应于ddit4l多肽v125-p132肽段的片段，例如具有seqidno:4或6所示氨基酸序列的多肽；或

(b')与seqidno:4或6所示的氨基酸序列同源或具有序列相同性(例如80％以上同源或具有80％以上序列相同性，如80％、85％、90％、95％、98％、99％)，且具有atp合成酶α亚基结合和抑制活性的多肽；或

(c')(a')或(b')的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸、且具有atp合成酶α亚基结合和抑制活性的由(a)或(b)衍生的多肽；和/或

编码ddit40l多肽活性片段(例如(a')～(c')中所述活性片段)的所述核酸分子选自：

(i')seqidno:1中所含与活性片段对应的核酸分子；或

(ii')在严格条件下与(i')限定的核苷酸序列杂交的分子；

(iii')与seqidno:3所示的核苷酸序列同源或具有序列相同性(例如80％以上同源或具有80％以上序列相同性，如80％、85％、90％、95％、98％、99％)、且编码具有atp合成酶α亚基结合和抑制活性的多肽的核酸分子；

(iv')由(i')或(ii')或(iii')的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸、且编码具有atp合成酶α亚基结合和抑制活性的多肽的核酸分子。

在一些实施方式中，所述促进剂选自：提高ddit4l多肽或其活性片段水平或促进其功能的物质，例如ddit4l或其活性片段或它们的编码序列的过表达载体；外源性ddit4l多肽或活性片段；ddit4l编码序列的裸dna；ddit4l编码序列的脂质体包裹dna；能够在体内转化为ddit4l或其活性片段的前体蛋白或偶联物或复合物。

在一些实施方式中，所述多肽或其活性片段与载体、半衰期延长物、信号肽等连接，例如与穿膜肽tat连接。在一些实施方式中，该连接物为与tat肽连接的ddit4l或其活性片段，如tatddit4lv125-p132小肽。

在一些实施方式中，所述胶质瘤为who1级胶质瘤、who2级胶质瘤、who3级胶质瘤或who4级胶质瘤。

在一些实施方式中，所述胶质瘤为胶质母细胞瘤。

在一些实施方式中，所述胶质瘤为具有野生型idh的胶质瘤(如胶质母细胞瘤)或具有idh1/2突变的胶质瘤(例如idh1^r132h胶质瘤)。

在一些实施方式中，所述胶质瘤为原神经型(proneural，pro)、神经型(neural)、经典型(classical)或间叶型(mesenchymal，mes)胶质瘤。

在一些实施方式中，所述胶质瘤为幕上胶质瘤、幕下胶质瘤或桥脑胶质瘤。

在一些实施方式中，所述胶质瘤相关症状选自胶质瘤导致的：头痛、恶心、呕吐、癫痫、视物模糊、视觉丧失、肢体疼痛、麻木、肌力弱、运动与感觉障碍、语言表达和理解困难。

在一些实施方式中，所述预防和/或治疗包括：阻止或延缓胶质瘤的发生和/或发展、促进胶质瘤的消退或消失、缓解胶质瘤症状(例如上述症状)和/或延长存活期。

在一些实施方式中，所述ddit4l活性物质实现如下一种或多种功能：结合并抑制atp合成酶α亚基；抑制线粒体代谢功能；提高线粒体膜通透性；促进线粒体中细胞色素c和/或半胱天冬酶(如半胱天冬酶3)的释放；诱导肿瘤细胞(如胶质瘤细胞)凋亡；抑制mtor信号途径；抑制肿瘤细胞生长、增殖和/或发展。

在一些实施方式中，所述对象为人或非人哺乳动物，例如猩猩、猿、猴、马、牛、羊、犬、猫或鼠。

在一些实施方式中，所述产品为药物组合物或药盒，例如其形式适于通过选自下组方式给予的药物组合物或药盒：口服、注射(例如直接裸dna或蛋白质注射法、脂质体包裹dna或蛋白质注射法)、金包被基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒dna法、复制缺陷腺病毒携带目的dna法或目的基因所编码蛋白质、电致孔、鼻腔给药、肺部给药、口服给药、透皮给药、颅内给药、瘤内给药。

在一些实施方式中，所述产品还包含用于预防和/或治疗胶质瘤或与胶质瘤相关的征状的其他物质，例如选自下组中的一种或多种：替莫唑胺、贝伐单抗阿瓦斯汀；或者，所述产品与手术、放疗和/或化疗联用。

在本申请的一些方面中，提供了一种用于预防和/或治疗胶质瘤及其相关症状的产品，其包含：

(a)治疗或预防有效量的dna损伤诱导转录本4样(ddit4l)多肽、其活性片段、编码所述多肽或片段的核酸分子、或它们的促进剂，例如如权利要求2中所限定的多肽、其活性片段、编码所述多肽或片段的核酸分子、或促进剂；

(b)药学上可接受的载体或赋形剂；

(c)可任选地，一种或多种预防和/或治疗胶质瘤及其相关征状的其它活性物质，

例如，所述产品的特征如本文中(例如前文中)所描述。

在一些实施方式中，所述产品为药物组合物或药盒，例如其形式适于通过选自下组方式给予的药物组合物或药盒：口服、注射(例如直接裸dna或蛋白质注射法、脂质体包裹dna或蛋白质注射法)、金包被基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒dna法、复制缺陷腺病毒携带目的dna法或目的基因所编码蛋白质、电致孔、鼻腔给药、肺部给药、口服给药、透皮给药、颅内给药、瘤内给药。

在一些实施方式中，所述产品还包括所述其他活性物质，其选自下组中的一种或多种：替莫唑胺、贝伐单抗阿瓦斯汀；或者，所述产品与手术、放疗和/或化疗联用。

在本申请的一些方面中，提供了dna损伤诱导转录本4样(ddit4l)活性物质在制备用于抑制线粒体代谢活性和/或治疗与线粒体代谢活性过高相关的疾病或症状的产品中的应用，其中所述活性物质选自：ddit4l多肽、其活性片段、编码所述多肽或片段的核酸分子、或它们的促进剂。

在一些实施方式中，所述活性物质和/或产品如本文(例如前文)所描述。

在一些实施方式中，与线粒体代谢活性过高相关的疾病或症状选自：肿瘤发生、肿瘤迁移。

在本申请的另一些方面中，提供了一种预防和/或治疗对象中胶质瘤及其相关症状的方法，所述方法包括给予有需要的对象预防和/或治疗有效量的dna损伤诱导转录本4样(ddit4l)活性物质和/或本申请的产品，其中所述活性物质选自：ddit4l多肽、其活性片段、编码所述多肽或片段的核酸分子、或它们的促进剂。

在一些实施方式中，所述方法中的各特征可如本文(例如前文)中所描述。

本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。

图1：ddit4l在胶质瘤中的表达与胶质瘤的恶性程度正相关：

a：利用tcga数据库分析不同分类方式胶质瘤中上调的基因；

b：利用tcga数据库分析gbm和lgg中不同基因的表达水平；

c：ddit4l在gbm中表达的免疫组织化学染色(dab染色)照片(左图：hgbm21359；右图：hlgg14023)；

d～e：免疫荧光双标和细胞流式检测ddit4l与gfap、oligo2、nestin以及cd133的定位。

图2：ddit4l抑制胶质瘤细胞的增殖：

a：gbm患者组织中ddit4l的表达；

b～c：免疫组化和细胞流式检测ddit4l与低氧诱导因子1α(hif1α)以及血管内皮细胞标志物cd31的定位；

d：原代细胞(hgbm11879)中过表达ddit4l对瘤细胞成球生长的影响。

图3：ddit4l结合atp合成酶的α亚基：

a：外转带myc和his-tag的ddit4l的gbm和u87mg细胞的myc免疫共沉淀；

b：免疫染色检测gbm组织中ddit4l与atp合成酶α亚基的定位；

c：共转ddit4l与atp合成酶α亚基或β亚基的hek293t细胞中的免疫共沉淀；

d：gstpull-down实验检测atp合成酶α亚基与ddit4l的结合；

e：纯化的atp合成酶α亚基与ddit4l蛋白的结合；

f：免疫共沉淀检验ddit4l中结合atp合成酶α亚基的部位，其中ddit4lδ1、ddit4lδ2和ddit4lδ3分别对应于缺失s96-c106、v125-p132和k141-r166的ddit4l；

g：gstpull-down实验检验atp合成酶α亚基上的结合区域，其中atp5aδ1～δ5分别对应于缺失v118-v131、k132-i158、i179-g192、l471-a486和g491-i504的atp合成酶α亚基；

h：同源蛋白结构建模和in-silicondocking模型分析ddit4l与atp合成酶α亚基的结合部位。

图4：ddit4l抑制atp合成酶活性并介导胶质瘤细胞凋亡：

a：转染ddit4l对细胞atp合成的影响；

b：转染ddit4l对线粒体膜电位超极化的影响；

c：转染ddit4l对肿瘤细胞基础耗氧率和atp合成酶诱发的耗氧率的影响；

d：免疫染色检测ddit4l转染对线粒体融合的影响，下图中fragmented、intermediate和tubular分别表示小片段、中间状态和长管状；

e：电镜观察转染ddit4l对线粒体融合以及线粒体内、外膜的断裂和消退的影响；

f：转染ddit4l对u87mg细胞中线粒体和胞浆中细胞色素c和活化的半胱天冬酶3水平的影响；图中tom20是特异性定位于线粒体的一种蛋白质，其高表达代表成功分离出线粒体组分；

g：tunel染色检测转染ddit4l对胶质瘤细胞凋亡的诱导作用；

h：转染ddit4l对s6k磷酸化的影响。

图5：ddit4l和tat-ddit4l^v125-p132抑制胶质瘤生长：

a～c：转染ddit4l或静脉给予ddit4l蛋白对人源性gbm肿瘤原位异种移植免疫缺陷小鼠模型肿瘤生长和存活时间的影响；

d：tat-ddit4l^v125-p132和tat-ddit4l^k141-r166对u87mg肿瘤细胞生长的影响；

e：tat-ddit4l^v125-p132对u87mg肿瘤细胞atp合成酶诱发的耗氧率的影响；

f～g：tat-ddit4l^v125-p132对人源性gbm肿瘤原位异种移植免疫缺陷小鼠模型中肿瘤生长和小鼠存活时间的影响。

以上图中，*表示p值<0.05；**表示p值<0.01；***表示p值<0.001。

具体实施方式

在本申请前，在胶质母细胞瘤(glioblastoma,gbm)中是否存在具有抑制细胞能量代谢并同时介导其自身细胞凋亡的内源性抑制因子还不得而知。推测在idh没有突变的胶质瘤(特别是gbm)中存在针对线粒体功能的内源性抑制剂。通过本申请的相关研究发现：体内应激蛋白dna损伤诱导转录本4样(ddit4l)蛋白，可以通过拮抗线粒体功能同时启动细胞凋亡，来抑制胶质瘤生长和发展。

具体而言，众所周知，在有氧条件下，线粒体上的atp合成酶几乎合成所有细胞所需的atp。通过分析atp合成酶的蛋白结构发现：atp合成酶包含f1和f0两个部分。其中f1包含α和β亚基，主要作用是催化合成atp；而f0则可形成一个氢离子通道。

已有的研究表明atp合成酶的抑制剂：atp酶抑制因子1(if1)，可以结合β亚基抑制atp的产生，但if1通过激活nf-κb途径增强胶质瘤细胞的迁移和侵袭。突变的idh胶质瘤中，d-2-羟戊二酸也可以结合β亚基从而拮抗atp合成酶的活性并抑制肿瘤生长。在本研究中，ddit4l可以直接结合α亚基拮抗atp合成酶活性并诱发细胞凋亡，从而抑制胶质瘤生长。

在本研究中发现dna损伤诱导转录本4样(dnadamage-inducibletranscript4-like,ddit4l)蛋白是一个内源性gbm瘤体生长的抑制剂，其可以直接结合atp合成酶的α亚基并抑制线粒体的代谢功能。ddit4l基因在胶质母细胞瘤病人组织中高表达。ddit4l蛋白可以明显抑制gbm细胞的增殖。通过免疫共沉淀、蛋白质谱及功能分析，ddit4l可以直接结合atp合成酶的α亚基，从而抑制atp合成酶的活性，并且使线粒体中的细胞色素c被释放到细胞浆中，最终导致细胞凋亡的启动。进一步对ddit4l的功能片段进行细致筛选，发现ddit4l^v125-p132可以明显抑制胶质瘤的生长。因此，ddit4l及ddit4l^v125-p132可以通过拮抗线粒体活动，启动细胞凋亡，从而抑制胶质母细胞瘤的生长。

gbm作为最致命的原发性脑肿瘤，组织学上的主要特征是瘤体组织中出现大量缺氧坏死区域。有研究表明低氧条件可以诱导ddit4l基因的表达。在本研究中，我们发现相比lgg，ddit4l在gbm组织中的表达有明显升高。我们推测gbm的组织中，因肿瘤细胞大量增殖，导致局部缺氧从而诱导ddit4l的表达升高；ddit4l则通过抑制线粒体功能并启动细胞凋亡来抑制肿瘤生长的。因此，临床上胶质母细胞瘤的线粒体的形态学的变化倾向于发生线粒体自噬和细胞凋亡，从而导致局部组织坏死。在肿瘤细胞上给予外源性ddit4l的时候，ddit4l与线粒体膜上的atp5a结合，抑制atp合成酶的活性。在这一过程中，ddit4l结合线粒体内膜上的cypd，从而使线粒体通透性转换孔(mitochondrialpermeabilitytransitionpore,mptp)通透性增强，导致细胞色素c从线粒体释放到细胞质中，从而激活程序性细胞死亡的执行者半胱天冬酶(caspase)。另一方面，ddit4l与14-3-3家族蛋白结合，抑制mtor信号，抑制细胞增殖，诱导自噬。因此，外源性ddit4l或肽ddit4l^v125-p132加入gbm细胞或肿瘤后，出现了明显的细胞凋亡和肿瘤抑制。由此，ddit4l或肽ddit4l^v125-p132可成为gbm的一种新的治疗方法。

众所周知，ddit4l和ddit4被证实是mtor信号途径的抑制剂。ddit4的研究有证实其可抑制mtor从而调控肿瘤细胞自噬来抵抗化疗药物或缺氧环境引起的细胞凋亡，而针对ddit4l的研究主要在心肌损伤研究中发现其抑制mtor来调控心肌细胞病理损伤进程的。以上研究提示的ddit4l作用与本申请的研究结果相反。有研究报道在急性骨髓性白血病、乳腺癌、胶质母细胞瘤、结肠癌、皮肤癌和肺癌的肿瘤组织中，ddit4的表达会上调，提示预后比较差。ddit4调控肿瘤生长的机制主要通过ddit4结合胞浆中14-3-3蛋白，从而导致结节性硬化的肿瘤抑制蛋白(tsc2)与14-3-3蛋白形成的复合体解离，游离的tsc2会抑制mtorc1，从而对肿瘤细胞的生长形成抑制作用。

ddit4l在一些病理状态下，也存在和ddit4相似的分子调控机制，但它在肿瘤生长中的作用，目前还研究甚少。在本研究中，发现ddit4l可以明显抑制idh野生型的gbm细胞生长。而且证实ddit4l通过抑制线粒体上atp合成酶的活性并诱导细胞凋亡。这种调控的分子机制主要有ddit4l结合atp5a从而介导对atp合成酶的调控作用。ddit4l结合atp5a的氨基酸序列不存在于ddit4的蛋白序列中，与ddit4和ddit4l结合14-3-3蛋白的序列(arg-x-x-x-ser/thr-x-pro)也不一致。因此，ddit4l结合atp5a是ddit4l的特异性作用。

通过蛋白结构结合模型预测并通过实验证实：ddit4l上的v125-p132小肽可以完整的嵌入atp5a上k132-i158形成的凹槽中。这种结合发生后，atp合成酶的f1部分的旋转效率明显降低，导致atp合成显著减少。因此，增加ddit4l的蛋白量可导致atp合成酶的活性降低，ddit4l同时结合线粒体膜上的cypd(mptp的重要组成蛋白)，导致mptp开放，细胞色素c从线粒体释放到胞浆中从而启动半胱天冬酶的细胞凋亡程序导致细胞凋亡。

总之，ddit4l是一个通过作用于线粒体atp合成酶上的内源性gbm抑制因子；而且对理解线粒体功能和细胞凋亡的关系给出了一个新的视角。并且，我们鉴定出多肽ddit4l^v125-p132可以模拟ddit4l的功能，这给研发gbm治疗药物提出了一个很好的方向。

本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

ddit4l活性物质

如本文所用，术语“ddit4l活性物质”或“dna损伤诱导转录本4样活性物质”或“本申请的活性物质”是指ddit4l多肽、其活性片段、编码所述多肽或片段的核酸分子、或它们的促进剂等可通过结合atp合成酶α亚基特定区域，抑制线粒体代谢，和/或发挥肿瘤(例如胶质瘤，如胶质母细胞瘤)抑制作用的ddit4l相关物质。

如本文所用，术语“ddit4l多肽”或“ddit4l蛋白”可互换使用，是指dna损伤诱导转录本4样蛋白，其为通过作用于线粒体atp合成酶的内源性胶质瘤(尤其是gbm)抑制因子。本文的ddit4l蛋白可选自：(a)具有seqidno:2所示氨基酸序列的多肽；或(b)与seqidno:2所示的氨基酸序列同源或具有序列相同性(例如80％以上同源或具有80％以上序列相同性，如80％、85％、90％、95％、98％、99％)，且具有atp合成酶α亚基结合和抑制活性的多肽；或(c)(a)或(b)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸、且具有atp合成酶α亚基结合和抑制活性的由(a)或(b)衍生的多肽。

本文的蛋白质或多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等动物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。ddit4l蛋白或多肽优选由人ddit4l基因或其同源基因或家族基因编码。

本文ddit4l蛋白或多肽的变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能，例如ddit4l蛋白质或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有活性。

可采用辐射或暴露于诱变剂下来产生随机诱变，也可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术来获得上述(b)中的蛋白质或多肽。

根据重组生产方案所用的宿主，本文的蛋白质或多肽可包含一定的修饰，例如其可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。该术语还包括ddit4l蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与ddit4l蛋白编码序列杂交的序列所编码的蛋白、以及利用抗ddit4l蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还可使用其它多肽，如包含ddit4l蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了ddit4l蛋白的活性片段或功能性片段。

如本文所用，术语ddit4l多肽或蛋白的“活性片段”或“功能性片段”是指ddit4l中所包含的具有atp合成酶α亚基结合和抑制活性的氨基酸片段。

本文的ddit4l活性片段可选自例如：(a')具有对应于ddit4l多肽v125-p132肽段的片段，例如具有seqidno:4或6所示氨基酸序列的多肽；或(b')与seqidno:4或6所示的氨基酸序列同源或具有序列相同性(例如80％以上同源或具有80％以上序列相同性，如80％、85％、90％、95％、98％、99％)，且具有atp合成酶α亚基结合和抑制活性的多肽；或(c')(a')或(b')的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸、且具有atp合成酶α亚基结合和抑制活性的由(a)或(b)衍生的多肽。可采用本领域所知的任何方法来获得所述活性片段，例如可通过人工合成等方式。

例如活性片段至少具有ddit4l蛋白的v125-p132区段，或可在一端或两端包含ddit4l中相对于的其他氨基酸残基，或可连接有增强v125-p132活性(例如穿膜肽、信号肽)或靶向性(例如靶向部分)或延长其体内稳定性和效应的其他部分(例如半衰期延长物)，例如tat肽段。所述活性片段可包含以v125-p132区段为核心区段的至少8个、10个、15个、20个、30个连续氨基酸直至全长ddit4l蛋白。

如本文所用，术语“ddit4l基因”、“ddit4l多肽编码序列”或“编码ddit4l多肽的核酸分子”可互换使用，均是指编码本文所述的ddit4l蛋白或多肽的序列，其可为(i)具有seqidno:1所示核苷酸序列的核酸分子；或(ii)在严格条件下与(i)限定的核苷酸序列杂交的分子；(iii)与seqidno:1所示的核苷酸序列同源或具有序列相同性(例如80％以上同源或具有80％以上序列相同性，如80％、85％、90％、95％、98％、99％)、且编码具有atp合成酶α亚基结合和抑制活性的多肽的核酸分子；(iv)由(i)或(ii)或(iii)的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸、且编码具有atp合成酶α亚基结合和抑制活性的多肽的核酸分子。

如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×ssc，0.1％sds，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。例如，所述序列可为(a)中所限定序列的互补序列。

本文的ddit4l基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可文本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

应理解，本发明的ddit4l基因优选获自人，获自其它动物的与人ddit4l基因高度同源(如具有50％以上，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上，更优选85％以上如85％、90％、95％、98％甚至99％或以上的序列相同性)的其它基因也在本文考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如blast。

类似地，本文的活性物质还包括了编码本文ddit4l活性片段的核酸分子。该活性片段编码分子可选自：(i')具有seqidno:1中与活性片段对应的核苷酸序列的核酸分子；或(ii')在严格条件下与(i')限定的核苷酸序列杂交的分子；(iii')与seqidno:3所示的核苷酸序列同源或具有序列相同性(例如80％以上同源或具有80％以上序列相同性，如80％、85％、90％、95％、98％、99％)、且编码具有atp合成酶α亚基结合和抑制活性的多肽的核酸分子；(iv')由(i')或(ii')或(iii')的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸、且编码具有atp合成酶α亚基结合和抑制活性的多肽的核酸分子。所述活性片段可通过重组表达产生，或通过人工合成获得。

本文中还涉及ddit4l促进剂。术语“促进剂”是指可提高ddit4l多肽、活性片段或其编码分子的水平和/或活性的物质。可用于本文中的促进剂包括但不限于：ddit4l或其活性片段的表达载体、外源性ddit4l多肽或其活性片段、其编码序列的裸dna、其编码序列的脂质体包裹dna、能够在体内转化为ddit4l或其活性片段的前体蛋白或偶联物或复合物。在一些实施方式中，其可为与tat肽连接的ddit4l或其活性片段，如tatddit4lv125-p132小肽。

本文的ddit4l活性物质可实现如下一种或多种功能：结合并抑制atp合成酶α亚基；抑制线粒体代谢功能；促进线粒体中细胞色素c和/或半胱天冬酶(如半胱天冬酶3)的释放；诱导肿瘤细胞(如胶质瘤细胞)凋亡；抑制mtor信号途径；抑制肿瘤细胞生长、增殖和/或发展。由此，本文的ddit4l活性物质具有广泛的应用前景。

产品及其应用

本文中还提供了包含ddit4l活性物质的产品及其应用。例如，本文中提供了一种药物、药物组合物或试剂盒，其中可含有有效量本文的ddit4l活性物质，以及药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，所述产品可用于预防或治疗胶质瘤及其相关症状。例如，本文的产品可用于预防和/或治疗选自下组的胶质瘤：who1级胶质瘤、who2级胶质瘤、who3级胶质瘤或who4级胶质瘤，如胶质母细胞瘤；具有野生型idh的胶质瘤或具有idh1/2突变的胶质瘤(例如idh1^r132h胶质瘤)；原神经型(proneural，pro)、神经型(neural)、经典型(classical)或间叶型(mesenchymal，mes)胶质瘤；幕上胶质瘤、幕下胶质瘤或桥脑胶质瘤。在一些实施方式中，本文的产品可用于缓解或消除胶质瘤相关症状，例如选自下组的一种或多种由胶质瘤导致的症状：头痛、恶心、呕吐、癫痫、视物模糊、视觉丧失、肢体疼痛、麻木、肌力弱、运动与感觉障碍、语言表达和理解困难。在一些实施方式中，所述预防和/或治疗包括：阻止或延缓胶质瘤的发生和/或发展、促进胶质瘤的消退或消失、缓解胶质瘤症状(例如上述症状)和/或延长存活期。

在一些实施方式中，所述产品可用于预防或治疗与线粒体功能过高相关的疾病或症状。例如，本文的产品可用于预防和/或治疗：肿瘤发生、肿瘤迁移。

如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。如本文所用，术语“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》(remington’spharmaceuticalsciences，mackpub.co.，n.j.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。

在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、ph缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5-8，较佳地，ph约为6-8。

本发明的组合物中的活性物质占组合物总重量的0.001～99.9wt％；优选为组合物总重量的1～95wt％，较优选为5～90wt％，更优选10～80wt％。余量为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。

如本文所用，术语“单位剂型”是指为了服用方便，将本发明的组合物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。

在本发明的另一优选实施方式中，所述组合物为单位剂型或多剂型，且其中活性物质的含量为0.01～2000mg/剂，优选0.1～1500mg/剂，更优选1～1000mg/剂。在本发明的另一个优选例中，每天施用1～6剂本发明的组合物，优选施用1～3剂；最优选的，每天服用的剂量为1剂。

应理解，所用ddit4l蛋白或其编码序列等活性物质的有效剂量可随待施用或治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据对象的个体情况(例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果)来决定，这在熟练医师可以判断的范围内。

本发明的组合物，可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液)或其它合适的形状。给药途径可采用：(1)直接裸dna或者蛋白质注射法；(2)将ddit4l的cdna、mrna和蛋白质与转铁蛋白/多聚l-赖氨酸复合物连接，以增强其生物效应；(3)cdna、mrna和蛋白质与带正电荷的脂类形成复合物，以克服磷酸骨架负电荷所致的穿越细胞膜的困难；(4)用脂质体包裹cdna、mrna和蛋白质后介导进入细胞，既有利于大分子的顺利进入又免受细胞外各种酶的水解作用；(5)cdna、mrna和蛋白质与胆固醇结合使其胞浆保持时间增加10倍；(6)用免疫脂质体转运cdna、mrna和蛋白质可使其特异性转运至靶组织和靶细胞；(7)将cdna、mrna和蛋白质体外转染给转载细胞(如成纤维细胞)也可较好地将ddit4l相关药物载入靶细胞内；(8)电打孔(electroporation)，即借助于电流将cdna、mrna和蛋白质导入靶细胞。

此外，本文的产品中还可含有预防和/或治疗胶质瘤或与胶质瘤相关的征状的其他物质，这些物质包括但不限于：替莫唑胺、贝伐单抗阿瓦斯汀等。本文的不同ddit4l活性物质(例如核酸和肽)相互间可以联合应用，还可以与其它药物和治疗手段(例如手术、放疗和/或化疗)联合。

相应地，本文中还提供了预防和/或治疗胶质瘤或其相关症状的方法，所述方法包括给予有需要的对象本文的ddit4l活性物质或产品。本文中还提供了预防和/或治疗与线粒体活性过高相关的疾病或症状的方法，所述方法包括给予有需要的对象本文的ddit4l活性物质或产品。

序列表信息

本申请序列表中序列信息所对应分子如下：

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)或按照供应商所建议的条件。dna的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.ddit4l在胶质瘤中的表达与胶质瘤的恶性程度正相关

材料与方法

组织标本：肿瘤手术切除标本获自复旦大学附属华山医院，组织学检查为胶质母细胞瘤(gbm)、星形胶质细胞瘤和少突胶质瘤(lgg)。

测序数据获取：利用r语言包“tcgabiolinks”中的函数来从美国国家研究所建立的数据库下载，网址为：https://portal.gdc.cancer.gov/。下载数据包括tcga-gbm和tcga-lgg的rna-seq的fkpm值，以及相关临床资料。

免疫组织化学：取出肿瘤组织石蜡切片，经二甲苯、酒精梯度脱蜡复水，过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3％h2o2，室温10分钟(避光)，蒸馏水洗5分钟2次，抗原修复，pbs：5分钟2次，加入含有1％bsa的pbst封闭室温0.5小时，在切片的一端吸去玻片上的pbs，并从另一端加上适当稀释的一抗(ddit4l，购自sigma)，盖上加湿盒，4℃孵育过夜。以pbs洗玻片3次(5min/次)，从切片一端加入新的pbs缓冲液，由另一端吸去旧的缓冲液。将有hrp标记的第二抗体(hrp标记山羊抗兔二抗igg，购自jackson)加于切片上，置加湿盒中室温孵育1小时，以pbs洗玻片3次(5min/次)，dab显色，镜下观察，适时终止，自来水(细水)充分冲洗，苏木素复染，室温30秒，自来水冲洗，自来水冲洗返蓝15分钟，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片常温避光保存待镜检。

组织免疫荧光：从-80℃冰箱取出冰冻切片切好的肿瘤组织切片，室温复温后用pbs清洗一遍，之后用阻水笔圈出组织切片范围，加入含有1％bsa的pbst封闭室温1小时，在切片的一端吸去玻片上的pbs，并从另一端加上适当稀释的一抗(ddit4l，购自sigma；gfap，购自cst；olig2，购自santacruz；nestin，购自stemcell；cd133，购自merk)，盖上加湿盒，4℃孵育过夜。以pbs洗玻片3次(5min/次)，从切片一端加入新的pbs缓冲液，由另一端吸去旧的缓冲液。将有不同荧光基团标记的第二抗体(alex-488标记或alex-647标记的山羊抗兔/鼠的二抗，购自jackson)加于切片上，置加湿盒中室温孵育1小时，以pbs洗玻片3次(5分钟/次)。将盖玻片放于纸巾上，滴加1滴荧光封片剂于盖玻片中央。翻过载玻片放于盖玻片上，再用指甲油封片，-20℃保存待镜检。

流式细胞术实验：通过0.05％的胰酶细胞原代细胞或细胞系成单细胞，计数，按照每管5x10⁵的细胞数分装，800g5分钟离心收集细胞，加入4％pfa固定10分钟，pbs洗2次(2分钟/次)，加入透化缓冲液(permeabilizationbuffer)混匀，4℃孵育30分钟，pbs洗2次(2分钟/次)，加入不同物种来源的一抗或同型对照抗体(ddit4l，购自sigma；nestin，购自stemcell；cd133，购自merk；无免疫兔血清来源igg或小鼠血清来源igg)，4℃孵育60分钟，pbs洗2次(2分钟/次)，加入二抗(alex-488标记或alex-647标记的山羊抗兔/鼠的二抗，购自jackson)，4℃孵育30分钟，冰上避光，上机。

试验结果与讨论

在临床病人中，gbm的预后通常都比低级别的胶质瘤lgg要差。idh没有突变(idhwt)的gbm预后比有idh突变(idhmut)的gbm也要差。近年来，基于特异性基因的表达，对gbm又进行了一种功能性分类：原神经型(proneural，pro)、神经型(neural)、经典型(classical)和间叶型(mesenchymal，mes)。这四种类型分别有不同的预后，其中原神经型gbm的预后最好，而间叶型gbm的预后最差。

为了筛选对gbm的预后或治疗有潜在功能意义的分子，我们通过tcga(thecancergenomeatlas)数据库通过三种分类方式(即gbmvs.lgg、idhwtvs.idh突变以及间叶型vs.神经前型)比较了预后有明显差别的胶质瘤的rna-seq数据。

通过比较，我们一共发现有53个表达明显上调的基因(图1a)，而ddit4l是在gbm中上调最明显的分子之一(图1b)。

在组织染色试验显示：相比低级别的胶质瘤，ddit4l在gbm中表达明显增强(图1c)。通过免疫荧光双标和细胞流式检测表明：ddit4l与胶质纤维酸性蛋白(gfap，星形胶质细胞活化的标志物)或少突胶质细胞转录因子-2(oligo2)有共标(图1d)。同时ddit4l与肿瘤干细胞的标志物cd133和巢蛋白(nestin)都有一定的共标(图1e)。

以上结果表明ddit4l的表达水平与胶质瘤恶性程度和预后存在正相关，即ddit4l表达水平越高，胶质瘤恶性程度越高，预后更为不良。ddit4l在组织中与gfap(星形胶质细胞的标志物)、oligo2(少突胶质细胞的标志物)、cd133(肿瘤干细胞的标志物)和nestin(肿瘤干细胞的标志物)有共标分别表明ddit4l定位于星形或少突胶质细胞，且可定位于肿瘤干细胞，证明了其与胶质瘤的密切相关性。

实施例2.ddit4l抑制胶质瘤细胞的增殖

材料和方法

组织标本：肿瘤手术切除标本，来自复旦大学附属华山医院，组织学检查为胶质母细胞瘤(gbm)、星形胶质细胞瘤和少突胶质瘤(lgg)。

组织中总蛋白的提取：将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。加400μl蛋白裂解液裂ripa(含pmsf)于匀浆器中，进行冰上匀浆。之后4℃缓慢旋转混匀裂解2小时，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。

westernblot实验：按照sds-page电泳、转膜、免疫反应和化学发光的步骤完成westernblot实验。

肿瘤干细胞成球实验：通过0.05％的胰酶消化分别感染了ddit4l过表达慢病毒和对照慢病毒的原代细胞或细胞系成单细胞，计数，按照1x10⁴的细胞数接种于低粘附培养板中，培养8-10天，每3-4天添加50％的新鲜培养基，每隔一天在倒置相差显微镜下拍照。最终通过imagej软件统计成球的大小和个数。

试验结果与讨论

前期有研究报道低氧可以诱导ddit4l基因表达。

在gbm的患者组织中，ddit4l高表达于胶质母细胞瘤中，且gbm细胞在1％o2的培养24小时后，ddit4l的表达量明显增多(图2a)。通过免疫组化和细胞流式标记：发现ddit4l主要与低氧诱导因子1α(hif1α)共标，而与血管内皮细胞的标志物cd31没有共标(图2b和2c)。在原代细胞(来自华山医院神经外科的患者(11879))中通过重组了ddit4l基因的zsgreen-puro-luc标记的慢病毒(购自汉恒生物科技(上海)有限公司)感染肿瘤细胞来过表达ddit4l，可以明显抑制瘤细胞的成球生长(图2d)。

以上结果表明：ddit4l高表达于胶质母细胞瘤中，且与低氧诱导因子1α(hif1α)共标，表明该肿瘤环境的低氧诱导了ddit4l基因表达。并且，ddit4l的过表达可抑制瘤细胞的增殖和形态变化。

实施例3.ddit4l直接结合atp合成酶的α亚基

材料与方法

质粒构建方法：将人ddit4l的cdna克隆到pcdna3.1/myc-his(+)a载体中以表达ddit4l-myc。使用kod-plus诱变试剂盒(toyobo)从ddit4l-myc质粒中修饰表达ddit4lδ1-myc、ddit4lδ2-myc和ddit4lδ3-myc的质粒。人atp5a的cdna在调节的pcdna3.1/ha-his(+)a载体中构建，因为ha标签取代了pcdna3.1/myc-his(+)a载体中的myc标签。使用kod-plus诱变试剂盒(toyobo)从atp5a-ha质粒修饰表达atp5aδ1-ha，atp5aδ2-ha，atp5aδ3-ha，atp5aδ4-ha和atp5aδ5-ha的质粒。将带有ha标签的人ddit4l和人atp5a的cdna克隆到pgex载体中，以构建gst-ddit4l和gst-atp5a-ha质粒。

免疫共沉淀实验：收获细胞，加入适量细胞ip裂解液，4℃旋转裂解30分钟，12000g离心30分钟后取上清，取少量裂解液以备westernblot分析，剩余裂解液将1μg相应抗体和10-40μl的proteing-beads加入到细胞裂解液，4℃缓慢旋转过夜，4℃3000g离心5分钟，缓慢吸弃上清，用400μl裂解液洗4-5次，加入1×上样缓冲液，100℃10分钟，之后同westernblot步骤。

gstpull-down实验：在含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌bl21菌株中iptg诱导表达gst-ddit4l，获得裂解液后加入谷胱甘肽琼脂糖(glutathionesepharose)结合gst，洗涤纯化后留一部分加入1×上样缓冲液100℃10分钟，以备westernblot检测；atp5a(或不同缺失体)-ha融合蛋白在293t细胞中通过转染相应质粒的方式过表达，ripa裂解；将结合了sepharose的gst-ddit4l悬浮到适量裂解液中，加入20-30μlatp5a(或不同缺失体)-ha融合蛋白裂解液；4℃水平摇晃4-8小时，加裂解液洗涤3次，吸干加入1上样缓冲液，100℃10分钟，以备westernblot检测。

质粒构建实验：将人ddit4l的cdna克隆到pcdna3.1/myc-his(+)a载体中以表达ddit4l-myc。使用kod-plus诱变试剂盒(toyobo)从ddit4l-myc质粒修饰表达ddit4l1-myc、ddit4l2-myc和ddit4l3-myc的质粒。人atp5a的cdna在调节的pcdna3.1/ha-his(+)a载体中构建，因为ha标签取代了pcdna3.1/myc-his(+)a载体中的myc标签。使用kod-plus诱变试剂盒(toyobo)从atp5a-ha质粒修饰表达atp5a1-ha、atp5a2-ha、atp5a3-ha、atp5a4-ha和atp5a5-ha的质粒。将带有ha标签的人ddit4l和人atp5a的cdna克隆到pgex载体中，以构建gst-ddit4l和gst-atp5a-ha质粒。

组织免疫荧光实验：同实施例2。

试验结果与讨论

因ddit4l可以明显抑制瘤细胞的增殖，我们将研究重心聚焦在ddit4l的作用靶点上。为了研究这个问题，我们选用了非常近似gbm细胞的u87mg细胞系(购自中科院细胞所)。

考虑ddit4l在gbm和u87mg细胞的内源性表达比较少，因此在实验中我们通过lippo3000试剂外转带myc和his-tag的ddit4l质粒(同上)，然后用myc的抗体进行免疫共沉淀的实验。实验发现myc抗体可以免疫共沉淀一条50kda大小的蛋白条带(图3a)。将这条蛋白纯化后进行蛋白质谱分析显示其中有5-16肽段序列与人源性atp合成酶α亚基的氨基酸序列吻合，三次实验结果所得到序列可以匹配37％atp合成酶α亚基的氨基酸序列。免疫共沉淀实验证实ddit4l-myc可以和atp合成酶α亚基结合(图3a)。免疫染色也表明在gbm组织中ddit4l与atp合成酶α亚基几乎完全共标(图3b)。

在hek293t细胞上，通过lippo3000试剂共转ddit4l与atp合成酶α亚基或β亚基，然后进行免疫共沉淀发现：只有atp合成酶α亚基可以与ddit4l结合(图3c)。同样我们应用gstpull-down实验也证实atp合成酶α亚基可以与ddit4l结合(图3d)。进一步我们应用纯化好的atp合成酶α亚基和ddit4l蛋白直接作用，发现二者可以直接结合(图3e)。

为了进一步确定ddit4l与atp合成酶α亚基结合的蛋白结构区域，通过结合同源蛋白结构建模和in-silicondocking模型(所用工具为zdock)，我们首先对ddit4l上可能的结合区域进行了分析。分析发现ddit4l上的s96-c106(seqidno:3)、v125-p132(seqidno:4)和k141-r166(seqidno:5)三个结构域可能会结合atp合成酶α亚基。我们构建了三个分别缺失上述结构域的重组蛋白(通过质粒构建的方式过表达在细胞上；除缺失以上结构域，其他均与野生型ddit4l相同；图中ddit4lδ1、ddit4lδ2和ddit4lδ3分别缺失ddit4l编码蛋白的s96-c106、v125-p132和k141-r166)，通过免疫共沉淀实验证实v125-p132、k141-r166(分别对应于ddit4lδ2、ddit4lδ3)是结合atp合成酶α亚基的部位(图3f)。

通过相同的方法对atp合成酶α亚基(seqidno:8)上的结合区域也进行了分析，并找到了5个可能的区域(seqidno:9～13)：v118-v131、k132-i158、i179-g192、l471-a486和g491-i504。通过构建5个分别缺失上述结构域的atp合成酶α亚基(构建方法同上)，然后通过gstpull-down实验证实k132-i158结构域是最重要的结合区域(图3g)。进一步应用同源蛋白结构建模和in-silicondocking模型分析，ddit4l上的v125-p132结构域应该是一个功能结合部位(图3h)。

通过上述结果证明了ddit4l可直接结合atp合成酶的α亚基，结合的关键区域在于ddit4l的v125-p132功能结合区段。

实施例4.ddit4l抑制atp合成酶活性并介导细胞凋亡

由于ddit4l可以直接结合atp合成酶α亚基，接下来我们检测了ddit4l对线粒体功能的影响。

材料与方法

atp含量检测：将u87细胞以每孔5×10⁴个细胞的密度接种在96孔板中，并一式三份用ddit4l和对照载体转染30小时。使用atplite1step常规测定法(perkinelmer，6016739)测量atp水平。使用spectramax@id3(moleculardevices)读取发光，最终将od值利用细胞数进行标准化。

线粒体膜电位检测：从abcam(112134)购买的jc-10线粒体膜电位测定试剂盒，并根据制造商的规程进行了测定。用ddit4l和对照载体转染细胞30小时，然后用spectramax@id3(moleculardevices)测量线粒体膜电位。

氧耗量检测：根据制造商的使用手册，用seahorsebioscience仪器(xf24/xf96，安捷伦)对氧耗量进行了测量，细胞融合80-90％。简而言之，在细胞接种后的第二天，将细胞在缺少co2的37℃恒温箱中平衡1小时。在基础条件下依次添加化合物和肽后，测量培养基中的氧气浓度。使用的化合物和肽的浓度为：oligomycina(1μm，线粒体atp合成酶抑制剂)；fccp(1μm，线粒体氧化磷酸化的解偶联剂)；鱼藤铜(rotenone，500nm，线粒体氧化呼吸链中电子传递抑制剂)和抗霉素(antimycina，500nm，线粒体氧化呼吸链中电子传递抑制剂)。每种条件至少利用三个复孔来计算ocr。

透射电镜实验：用3μg的ddit4l过表达或对照质粒转染48小时后，收集5×10⁵个细胞。然后，将细胞首先在2.5％戊二醛中固定2小时。将样品在避光条件下用1％oso4固定1.5小时。样品用浓度为30％、50％、70％、80％、95％和100％的乙醇进行脱水，然后再进行两次丙酮脱水(100％)。最后，将样品用丙酮：epon812(1：1)处理2小时，然后用epon812(100％)处理过夜。然后，获得超薄切片(70nm)，用乙酸铀和柠檬酸铅染色，并在tem下以80kv(feitecnaig2spirit)照相。

试验结果与讨论

实验发现转染ddit4l可以明显抑制细胞atp的合成并使线粒体膜电位超极化(图4a和4b)。转染ddit4l可以明显抑制肿瘤细胞的基础耗氧率和atp合成酶诱发的耗氧率(图4c)。应用免疫染色发现转染ddit4l可以明显增强线粒体的融合(图4d)。电镜的结果也提示转染ddit4l可以促进线粒体的融合以及线粒体内、外膜的断裂和消退(图4e)。

进一步研究表明，在u87mg细胞上转染ddit4l胞浆中的细胞色素c以及活化的半胱天冬酶3明显增加(图4f)。应用tunel染色发现转染ddit4l可以明显促进gbm细胞凋亡(图4g)。

另一方面，mtor信号通路是细胞生长与自噬的一个关键信号途径。以前的研究表明ddit4和ddit4l通过结合14-3-3蛋白，从而抑制mtor的活性。转染ddit4l可以明显抑制s6k的磷酸化，应用mtor的激动剂3bdo可以部分反转转染ddit4l抑制s6k磷酸化的现象(图4h)。

这些结果表明ddit4l抑制mtor的活性部分参与了ddit4l抑制u87mg细胞的生长的过程。

实施例5.ddit4l和tat-ddit4l^v125-p132抑制胶质瘤生长

材料与方法

人来源gbm细胞原代培养条件：患者来源的原代gbm细胞保存在神经球培养基(dmem/f12，thermofisher，11330032)中，并补充了b27(0.5x，thermofisher，17504044)、n2(0.5x，thermofisher，17504048)、bfgf(20ng/ml，peprotech，100-18b)和egf(20ng/ml，peprotech，100-47)、bsa(0.5mg/ml，sigma-aldrich，a9418)。

pdx模型构建方法：zsgreen-puro-luc标记的慢病毒(moi＝2；购自汉恒生物科技(上海)有限公司)感染后48小时，将2×10⁵原代gbm细胞(11879，来自于华山医院脑外科患者)植入雄性nod-scid或nude小鼠的左cpu区域(来自前reg，向侧面注射2.0mm，向尾部0mm，向腹侧注射2.75mm)。将8周龄的雄性同窝仔用于移植并随机接受表达ddit4l或对照载体的原代gbm细胞。生存实验，将动物维持直到神经学症状出现或移植后120天。为了监测肿瘤的生长，使用ivis100生物发光成像系统通过生物发光成像监测了稳定表达萤火虫荧光素酶的原代gbm细胞移植的小鼠。为了分析肽对体内gbm细胞生长的影响，使用皮下植入渗透泵(1002)的方法，将对照肽(seqidno:14)或tat-ddit4lv125-p132肽(由吉尔生化(上海)有限公司合成)(溶于pbs)直接递送至注射部位颅内肿瘤部位。

试验结果与讨论

在人源性gbm肿瘤原位异种移植免疫缺陷小鼠模型中，转染ddit4l或静脉给予ddit4l蛋白可以明显减少肿瘤的大小并显著延长小鼠的存活时间(图5a、b、c)。

如前实施例3中已证实ddit4l上的结构域v125-p132和k141-r166是结合atp合成酶α亚基的部位(图3f)。我们合成了(吉尔生化(上海)有限公司)连接穿膜肽tat(transcriptionalactivatorprotein)的tat-ddit4l^v125-p132和tat-ddit4l^k141-r166，检测它们对肿瘤细胞生长的影响。

实验发现仅tat-ddit4l^v125-p132对u87mg肿瘤细胞的生长呈现剂量依赖性的抑制作用(图5d)。tat-ddit4l^v125-p132可以明显抑制u87mg肿瘤细胞的atp合成酶诱发的耗氧率(图5e)。最后在人源性gbm肿瘤原位异种移植免疫缺陷小鼠模型中，tat-ddit4l^v125-p132同样可以明显减少肿瘤的大小并显著延长小鼠的存活时间(图5f,g)。

以上结果证明了ddit4l和tat-ddit4l^v125-p132可有效抑制胶质瘤生长，延长小鼠生存时间。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海联慧脑智工程中心

<120>ddit4l及其功能小肽对胶质母细胞瘤的抑制作用

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