一种直写成型3D打印生物墨水及其制备方法与流程

2021-01-08 10:01:06|

226|

起点商标网

本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种直写成型3d打印生物墨水及其制备方法。

背景技术：

直写成型3d打印技术是3d打印技术的一个分支，是将特定成分的墨水材料按照计算机软件设定的结构进行精密成型的技术，具体是将安装在z轴方向上的墨水材料在x-y平台上移动挤出，形成所需要的图形，对图形选择合适的固化工艺进行固化成型，然后通过逐层打印的方式制备出复杂的三维结构。直写成型3d打印技术使用的墨水材料需要具备合适的流变性能和保形性，流变性保证可以将其顺利挤出，保形性保证挤出后可维持基本的形态结构。

在生物医学领域中，直写成型3d打印技术使用的墨水材料位生物墨水，需要具备以下特性：(1)良好生物相容性：打印后细胞在生物墨水支架内部以及表面可以黏附存活，增殖以及分化。(2)良好的机械性能：①黏度可调，比如通过温度变化改变稠度和剪切变稀等。只有黏度可调才能设计适合的打印方式及打印参数。②生物墨水在打印前保持液态，以避免堵塞喷嘴，打印后要能迅速固化，维持预设的目标结构。

纤维素纳米纤维是当前使用最广泛的生物墨水之一，具有黏度可调节、取向性内部结构、来源广泛、机械特性良好等特性，可以自固化保持原有的形态结构。但是，纤维素纳米纤维稳定性较差、易分散于水中，用纤维素纳米纤维打印的结构在液体环境下难以维持自身形态。

因此，针对现有技术不足，提供一种直写成型3d打印生物墨水及其制备方法以克服现有技术不足甚为必要。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于避免现有技术的不足之处而提供一种直写成型3d打印生物墨水，能够通过光固化成型，提高3d打印结构的稳定性，还能够促进细胞粘附，且具有较好的生物相容性。

本发明的上述目的通过以下技术措施实现：

提供一种直写成型3d打印生物墨水，由纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶和含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液混合构成，以质量百分比计，所述纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶和含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液配比为：

纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶60～90％；

含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液10～40％。

优选的，以质量百分比计，所述纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶含有：

纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯1～10％；

lap引发剂0.05～0.5％；

pbs缓冲液89.95～98.95％。

优选的，所述纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯的合成原料为纤维素纳米纤维、甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐、多巴胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺；

其中，纤维素纳米纤维以质量份计，甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐、多巴胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺以摩尔质量份计，纤维素纳米纤维、甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐、多巴胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的混合比例为1：1～10：1～10：2～20：2～20。

优选的，所述含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液使用的生物细胞为小鼠c2c12成肌细胞或小鼠mc3t3成骨细胞。

优选的，所述纤维素纳米纤维为自然状态下的桉木树浆进行脱木质素化后，应用羧基法提取纳米化合成，形成的大分子以β-1-4糖苷键链接的纤维素集合体，所述纤维素纳米纤维的直径为3～40nm、长度为200～3000nm。

优选的，所述甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐、多巴胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺均为优级纯级别。

本发明提供的一种直写成型3d打印生物墨水，由纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶和含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液混合构成，以质量百分比计，纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶和含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液配比为：纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶60～90％，含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液10～40％。该直写成型3d打印生物墨水以纤维素纳米纤维为主体将多巴胺基团与甲基丙烯酸2-氨基乙基酯接枝到主体链段，充分整合了纤维素纳米纤维剪切变稀、多巴胺基团促进细胞粘附以及甲基丙烯酸2-氨基乙基酯聚合物可光固化的特点，具有较好的生物相容性，可以促进细胞粘附，还能够光固化成型，使得制备的3d打印结构具有较好的稳定性。

本发明的另一目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种直写成型3d打印生物墨水的制备方法，制备的生物墨水能够通过光固化成型，提高3d打印结构的稳定性，还能够促进细胞粘附，且具有较好的生物相容性。

本发明的上述目的通过以下技术措施实现：

提供一种直写成型3d打印生物墨水的制备方法，包含以下步骤：

s1：制备纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯前体。

s2：制备纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维。

具体为，将步骤s1中制备的纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯前体用分子量为5000～14000的透析袋在25～40℃的通风条件下用超纯水透析3～7天，取出透析产物后先在-60～-80℃预冻12～48h，然后在-40～60℃用冻干机冷冻干燥2～6天，获得纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维。

s3：制备纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶。

s4：制备含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液。

具体为，在培养至85～95％融合度的生物细胞中加入1～2ml胰酶，然后将生物细胞置于细胞培养箱内消化1～5min，当生物细胞变圆分散时加入含fbs的dmem完全培养基终止消化，将消化完成后获得的产物置于50ml的离心管中以800～1000rpm/min转速离心5min，弃上清，然后加入含fbs的dmem完全培养基重悬，获得含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液，所述含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液细胞计数为1×10⁶～1×10⁸个/ml。

s5：将步骤s4制备的纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶和步骤s5制备的含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液混合，并用搅拌器以20～100rpm/min的转速搅拌5～10min，获得直写成型3d打印生物墨水。

优选的，步骤s1具体为：

s11：将纤维素纳米纤维分散于温度为4～50℃的去离子水中，用搅拌器以200～1000r/min的转速搅拌30～120min，待纤维素纳米纤维在去离子水中分散均匀后在4～25℃水浴条件下继续搅拌12～24h，获得浓度为1～5％的纤维素纳米纤维分散液。

s12：在纤维素纳米纤维分散液中加入甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐、多巴胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺，反应5～20min后调节反应体系的ph值至4.0～6.0继续反应6～24小时，获得纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯前体。

优选的，步骤s3具体为：

s31：将步骤s2中制备的纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维在265nm的紫外光下消毒杀菌2～4h。

s32：将lap引发剂加入到pbs缓冲液中，在常温下磁力搅拌20～40min，获得lap引发剂和pbs缓冲液的混合溶液。

s33：将消毒杀菌后的纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维加入lap引发剂和pbs缓冲液的混合溶液中以5000～8000rpm/min的转速离心搅拌1～3h，获得纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶。

优选的，所述直写成型3d打印生物墨水在光照强度为10～180mw/cm²的365nm或者405nm紫外光下照射10～45s后形成水凝胶固化成型。

所述直写成型3d打印生物墨水的打印条件包括，温度为4～25℃、压力为0.5～1.0bar、打印速度为8～15mm/s、打印直径为100～1000μm。

本发明提供的一种直写成型3d打印生物墨水的制备方法，包含以下步骤：s1：制备纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯前体；s2：制备纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维；s3：制备纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶；s4：制备含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液；s5：将步骤s4制备的纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶和步骤s5制备的含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液混合，并用搅拌器以20～100rpm/min的转速搅拌5～10min，获得直写成型3d打印生物墨水。该方法简单易行，制备出的直写成型3d打印生物墨水以纤维素纳米纤维为主体将多巴胺基团与甲基丙烯酸2-氨基乙基酯接枝到主体链段，充分整合了纤维素纳米纤维剪切变稀、多巴胺基团促进细胞粘附以及甲基丙烯酸2-氨基乙基酯聚合物可光固化的特点，具有较好的生物相容性，可以促进细胞粘附，还能够光固化成型，使得制备的3d打印结构具有较好的稳定性。

附图说明

利用附图对本发明作进一步的说明，但附图中的内容不构成对本发明的任何限制。

图1是纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯合成示意图，其中图1(b)和图1(c)是图1(a)中r所代表的化学结构式。

具体实施方式

结合以下实施例对本发明作进一步说明。

实施例1。

一种直写成型3d打印生物墨水，由纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶和含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液混合构成，以质量百分比计，纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶和含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液配比为：

纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶60～90％；

含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液10～40％。

其中，含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液使用的生物细胞为小鼠c2c12成肌细胞或小鼠mc3t3成骨细胞，均购自于中科院细胞库。dmem完全培养基和fbs为细胞培养基常用试剂，购自于美国gibco公司。需要说明的是，含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液使用的生物细胞不局限于小鼠c2c12成肌细胞或小鼠mc3t3成骨细胞，可以根据需要选用的生物组织具体选择。

本实施例中，以质量百分比计，纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶含有：

纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯1～10％；

lap引发剂0.05～0.5％；

pbs缓冲液89.95～98.95％。

其中，lap引发剂为一种蓝光引发剂，在波长为365～405nm的蓝光作用下，lap迅速引发光敏水凝胶材料固化，本实施例用于纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶固化，lap引发剂购自于江阴司特易生物技术公司。pbs缓冲液为磷酸缓冲盐溶液，购自于美国gibco公司

如图1所示，纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯的合成原料为纤维素纳米纤维、甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐、多巴胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺；

本实施例中，甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐、多巴胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺均为优级纯级别。纤维素纳米纤维具有取向性，对于体内植入细胞的粘附以及生长分化具有较好的促进作用，为后期体内植入物的选择提供了良好的借鉴，例如：横纹肌肌肉组织的取向性；皮肤组织中网状组织的严密性等。甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐形成的甲基丙烯酸2-氨基乙基酯聚合物能够光固化，提高生物墨水打印的3d结构的稳定性。多巴胺是贻贝蛋白来源，能够促进细胞的粘附和增值。甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐购自于北京百灵威科技有限公司，多巴胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺均购自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

本实施例中，纤维素纳米纤维为自然状态下的桉木树浆进行脱木质素化后，应用羧基法提取纳米化合成，形成的大分子以β-1-4糖苷键链接的纤维素集合体，纤维素纳米纤维的直径为3～40nm、长度为200～3000nm。

该直写成型3d打印生物墨水，以纤维素纳米纤维为主体将多巴胺基团与甲基丙烯酸2-氨基乙基酯接枝到主体链段，充分整合了纤维素纳米纤维剪切变稀、多巴胺基团促进细胞粘附以及甲基丙烯酸2-氨基乙基酯聚合物可光固化的特点，具有较好的生物相容性，还可以促进细胞粘附和光固化成型，使得制备的3d打印结构具有较好的稳定性。

实施例2。

一种直写成型3d打印生物墨水，其它特征与实施例1相同，不同之处在于：以质量百分比计，纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶和含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液配比为：

纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶70～80％；

含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液20～30％。

以质量百分比计，纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶含有：

纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯3～7％；

lap引发剂0.15～0.35％；

pbs缓冲液92.65～96.85％。

纤维素纳米纤维、甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐、多巴胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的混合比例为1：3～7：3～7：5～17：5～17。

实施例3。

纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶60％；

含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液40％。

以质量百分比计，纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶含有：

纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯1％；

lap引发剂0.05％；

pbs缓冲液98.95％。

纤维素纳米纤维、甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐、多巴胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的混合比例为1：1：1：2：2。

实施例4。

纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶90％；

含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液10％。

以质量百分比计，纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶含有：

纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯10％；

lap引发剂0.5％；

pbs缓冲液89.95％。

纤维素纳米纤维、甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐、多巴胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的混合比例为1：10：10：20：20。

实施例5。

纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶75％；

含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液25％。

以质量百分比计，纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶含有：

纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯5％；

lap引发剂0.25％；

pbs缓冲液94.75％。

纤维素纳米纤维、甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐、多巴胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的混合比例为1：5：5：11：11。

实施例6。

一种直写成型3d打印生物墨水的制备方法，包括以下步骤：

s1：制备纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯前体，具体为：

s11：将纤维素纳米纤维分散于温度为4～50℃的去离子水中，用搅拌器以200～1000r/min的转速搅拌30～120min，待纤维素纳米纤维在去离子水中分散均匀后在4～25℃水浴条件下继续搅拌12～24h，获得浓度为1～5％的纤维素纳米纤维分散液；

s12：在纤维素纳米纤维分散液中加入甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐、多巴胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺，反应5～20min后调节反应体系的ph值至4.0～6.0继续反应6～24小时，获得纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯前体。本实施例中使用0.1～5mol/l的盐酸溶液调节反应体系的ph值但不限于盐酸溶液。

s2：制备纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维；

s3：制备纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶，具体为：

s31：将步骤s2中制备的纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维在265nm的紫外光下消毒杀菌2～4h；

s32：将lap引发剂加入到pbs缓冲液中，在常温下磁力搅拌20～40min，获得lap引发剂和pbs缓冲液的混合溶液；

s4：制备含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液；

具体为，在培养至85～95％融合度的生物细胞中加入1～2ml胰酶，然后将生物细胞置于细胞培养箱内消化1～5min，当生物细胞变圆分散时加入含fbs的dmem完全培养基终止消化，将消化完成后获得的产物置于50ml的离心管中以800～1000rpm/min转速离心5min，弃上清，然后加入含fbs的dmem完全培养基重悬，获得含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液，含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液细胞计数为1×10⁶～1×10⁸个/ml。

本实施例中，直写成型3d打印生物墨水在光照强度为10～180mw/cm²的365nm或者405nm紫外光下照射10～45s后形成水凝胶固化成型。直写成型3d打印生物墨水的打印条件包括，温度为4～25℃、压力为0.5～1.0bar、打印速度为8～15mm/s、打印直径为100～1000μm。

该直写成型3d打印生物墨水的制备方法，简单易行，制备出的直写成型3d打印生物墨水以纤维素纳米纤维为主体将多巴胺基团与甲基丙烯酸2-氨基乙基酯接枝到主体链段，充分整合了纤维素纳米纤维剪切变稀、多巴胺基团促进细胞粘附以及甲基丙烯酸2-氨基乙基酯聚合物可光固化的特点，具有较好的生物相容性，还可以促进细胞粘附和光固化成型，使得制备的3d打印结构具有较好的稳定性。

实施例7。

一种直写成型3d打印生物墨水的制备方法，其它特征与实施例6相同，不同之处在于，包括以下步骤：

s1：制备纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯前体，具体为：

s11：将纤维素纳米纤维分散于温度为10～40℃的去离子水中，用搅拌器以500～1500125℃水浴条件下继续搅拌16～20h，获得浓度为2～4％的纤维素纳米纤维分散液；

s12：在纤维素纳米纤维分散液中加入甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐、多巴胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺，反应10～15min后调节反应体系的ph值至4.5～5.5继续反应12～18小时，获得纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯前体。本实施例中使用1～4mol/l的盐酸溶液调节反应体系的ph值但不限于盐酸溶液。

s2：制备纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维；

具体为，将步骤s1中制备的纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯前体用分子量为8000～11000的透析袋在30～35℃的通风条件下用超纯水透析4～6天，取出透析产物后先在-60～-80℃预冻12～48h，然后在-55～-45℃用冻干机冷冻干燥3～5天，获得纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维。纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维如棉花轻盈且无冰晶，且存放于常温下避光的干燥容器中。

s3：制备纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶，具体为：

s31：将步骤s2中制备的纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维在265nm的紫外光下消毒杀菌2.5～3.5h；

s32：将lap引发剂加入到pbs缓冲液中，在常温下磁力搅拌25～35min，获得lap引发剂和pbs缓冲液的混合溶液；

s33：将消毒杀菌后的纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维加入lap引发剂和pbs缓冲液的混合溶液中以6000～7000rpm/min的转速离心搅拌1.5～2.5h，获得纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶。

s4：制备含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液；

具体为，在培养至87～92％融合度的生物细胞中加入1.2～1.8ml胰酶，然后将生物细胞置于细胞培养箱内消化2～4min，当生物细胞变圆分散时加入含fbs的dmem完全培养基终止消化，将消化完成后获得的产物置于50ml的离心管中以850～950rpm/min转速离心5min，弃上清，然后加入含fbs的dmem完全培养基重悬，获得含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液，含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液细胞计数为1×10⁶～1×10⁸个/ml。

s5：将步骤s4制备的纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶和步骤s5制备的含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液混合，并用搅拌器以50～70rpm/min的转速搅拌6～8min，获得直写成型3d打印生物墨水。

本实施例中，直写成型3d打印生物墨水在光照强度为50～120mw/cm²的365nm或者405nm紫外光下照射15～40s后形成水凝胶固化成型。直写成型3d打印生物墨水的打印条件包括，温度为10～15℃、压力为0.7～0.9bar、打印速度为10～13mm/s、打印直径为300～800μm。

实施例8。

一种直写成型3d打印生物墨水的制备方法，其它特征与实施例6相同，不同之处在于，包括以下步骤：

s1：制备纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯前体，具体为：

s11：将纤维素纳米纤维分散于温度为4℃的去离子水中，用搅拌器以200r/min的转速搅拌30min，待纤维素纳米纤维在去离子水中分散均匀后在4℃水浴条件下继续搅拌12h，获得浓度为1％的纤维素纳米纤维分散液；

s12：在纤维素纳米纤维分散液中加入甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐、多巴胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺，反应5～20min后调节反应体系的ph值至4.0继续反应6小时，获得纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯前体。需要说明的是，本实施例中使用0.1mol/l的盐酸溶液调节反应体系的ph值，但调节反应体系ph的溶液不限于盐酸溶液。

s2：制备纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维；

具体为，将步骤s1中制备的纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯前体用分子量为5000的透析袋在25℃的通风条件下用超纯水透析3天，取出透析产物后先在-60～-80℃预冻12～48h，然后在-60℃用冻干机冷冻干燥2天，获得纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维。纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维如棉花轻盈且无冰晶，且存放于常温下避光的干燥容器中。

s3：制备纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶，具体为：

s31：将步骤s2中制备的纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维在265nm的紫外光下消毒杀菌2h；

s32：将lap引发剂加入到pbs缓冲液中，在常温下磁力搅拌20min，获得lap引发剂和pbs缓冲液的混合溶液；

s33：将消毒杀菌后的纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维加入lap引发剂和pbs缓冲液的混合溶液中以5000rpm/min的转速离心搅拌1h，获得纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶。

s4：制备含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液；

具体为，在培养至85％融合度的生物细胞中加入1ml胰酶，然后将生物细胞置于细胞培养箱内消化1min，当生物细胞变圆分散时加入含fbs的dmem完全培养基终止消化，将消化完成后获得的产物置于50ml的离心管中以800rpm/min转速离心5min，弃上清，然后加入含fbs的dmem完全培养基重悬，获得含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液，含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液细胞计数为1×10⁶～1×10⁸个/ml。

s5：将步骤s4制备的纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶和步骤s5制备的含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液混合，并用搅拌器以20rpm/min的转速搅拌5min，获得直写成型3d打印生物墨水。

该直写成型3d打印生物墨水的制备方法，简单易行，制备出的直写成型3d打印生物墨水以纤维素纳米纤维为主体将多巴胺基团与甲基丙烯酸2-氨基乙基酯接枝到主体链段，充分整合了纤维素纳米纤维剪切变稀、多巴胺基团促进细胞粘附以及甲基丙烯酸2-氨基乙基酯聚合物可光固化的特点，具有较好的生物相容性，还可以促进细胞粘附，能够光固化成型和制备的3d打印结构具有较好的稳定性。

实施例9。

一种直写成型3d打印生物墨水的制备方法，其它特征与实施例6相同，不同之处在于，包括以下步骤：

s1：制备纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯前体，具体为：

s11：将纤维素纳米纤维分散于温度为50℃的去离子水中，用搅拌器以1000r/min的转速搅拌120min，待纤维素纳米纤维在去离子水中分散均匀后在25℃水浴条件下继续搅拌24h，获得浓度为5％的纤维素纳米纤维分散液；

s12：在纤维素纳米纤维分散液中加入甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐、多巴胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺，反应20min后调节反应体系的ph值至6.0继续反应24小时，获得纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯前体。本实施例中使用5mol/l的盐酸溶液调节反应体系的ph值但不限于盐酸溶液。

s2：制备纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维；

具体为，将步骤s1中制备的纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯前体用分子量为14000的透析袋在40℃的通风条件下用超纯水透析7天，取出透析产物后先在-60～-80℃预冻12～48h，然后在-40℃用冻干机冷冻干燥6天，获得纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维。

s3：制备纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶，具体为，

s31：将步骤s2中制备的纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维在265nm的紫外光下消毒杀菌4h；

s32：将lap引发剂加入到pbs缓冲液中，在常温下磁力搅拌40min，获得lap引发剂和pbs缓冲液的混合溶液；

s33：将消毒杀菌后的纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维加入lap引发剂和pbs缓冲液的混合溶液中以8000rpm/min的转速离心搅拌1～3h，获得纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶。

s4：制备含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液；

具体为，在培养至95％融合度的生物细胞中加入2ml胰酶，然后将生物细胞置于细胞培养箱内消化5min，当生物细胞变圆分散时加入含fbs的dmem完全培养基终止消化，将消化完成后获得的产物置于50ml的离心管中以1000rpm/min转速离心5min，弃上清，然后加入含fbs的dmem完全培养基重悬，获得含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液，含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液细胞计数为1×10⁶～1×10⁸个/ml。

s5：将步骤s4制备的纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶和步骤s5制备的含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液混合，并用搅拌器以100rpm/min的转速搅拌10min，获得直写成型3d打印生物墨水。

实施例10。

一种直写成型3d打印生物墨水的制备方法，其它特征与实施例6相同，不同之处在于，包括以下步骤：

s1：制备纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯前体，具体为：

s11：将纤维素纳米纤维分散于温度为26℃的去离子水中，用搅拌器以600r/min的转速搅拌75min，待纤维素纳米纤维在去离子水中分散均匀后在15℃水浴条件下继续搅拌30h，获得浓度为3％的纤维素纳米纤维分散液；

s12：在纤维素纳米纤维分散液中加入甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐、多巴胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺，反应5～20min后调节反应体系的ph值至5.0继续反应15小时，获得纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯前体。本实施例中使用2.5mol/l的盐酸溶液调节反应体系的ph值但不限于盐酸溶液。

s2：制备纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维；

具体为，将步骤s1中制备的纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯前体用分子量为10000的透析袋在33℃的通风条件下用超纯水透析5天，取出透析产物后先在-60～-80℃预冻12～48h，然后在-50℃用冻干机冷冻干燥4天，获得纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维。s3：制备纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶，具体为：

s31：将步骤s2中制备的纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维在265nm的紫外光下消毒杀菌3h；

s32：将lap引发剂加入到pbs缓冲液中，在常温下磁力搅拌30min，获得lap引发剂和pbs缓冲液的混合溶液；

s33：将消毒杀菌后的纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯冻干纤维加入lap引发剂和pbs缓冲液的混合溶液中以7000rpm/min的转速离心搅拌2h，获得纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶。

s4：制备含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液；

具体为，在培养至90％融合度的生物细胞中加入1.5ml胰酶，然后将生物细胞置于细胞培养箱内消化3min，当生物细胞变圆分散时加入含fbs的dmem完全培养基终止消化，将消化完成后获得的产物置于50ml的离心管中以900rpm/min转速离心5min，弃上清，然后加入含fbs的dmem完全培养基重悬，获得含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液，含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液细胞计数为1×10⁶～1×10⁸个/ml。

s5：将步骤s4制备的纤维素纳米纤维-多巴胺甲基丙烯酸2-氨基乙基酯水凝胶和步骤s5制备的含fbs的生物细胞dmem完全培养基重悬液混合，并用搅拌器以60rpm/min的转速搅拌8min，获得直写成型3d打印生物墨水。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击【在线咨询】或添加微信【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。