一种qPCR检测样品中miR-100含量的试剂盒的制作方法

一种qpcr检测样品中mir-100含量的试剂盒
技术领域
[0001]
本实用新型涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种qpcr检测样品中mir-100含量的试剂盒。


背景技术：

[0002]
mir-100为一种非编码小rna(mirnas)，mir-100在血清中的含量极低(飞摩尔级)，而且mirna的qpcr定量检测过程相对较为复杂，不仅需要特定的引物和探针，而且需要分门别类采购种类繁多的试剂和耗材。现有技术中并未有关于集成mir-100含量检测过程中应用的试剂及耗材的试剂盒的报道。或者给出现有的试剂盒结构如何，采用这种试剂盒检测繁琐。


技术实现要素：

[0003]
本实用新型的目的在于提供一种qpcr检测样品中mir-100含量的试剂盒，本实用新型的试剂盒能够简化mirna的qpcr定量检测流程。
[0004]
为了实现上述发明目的，本实用新型提供以下技术方案：
[0005]
本实用新型提供了一种检测样品中mir-100含量的试剂盒，包括盒体和盒盖12；
[0006]
所述盒体1内空间被竖立隔板13分隔成试剂部14和耗材部10；所述耗材部10从下到上依次设置有耗材底座2、48孔板3、缓冲垫4 和离心管架27；
[0007]
所述离心管架27的上表面开设有间隔分布的48个第一圆形凹槽 7；所述离心管架27的下表面开设有间隔分布的48个第二圆形凹槽 26；所述第一圆形凹槽7用于放置规格为1.5ml的离心管；所述第二圆形凹槽26用于放置规格为0.2ml的离心管；
[0008]
所述试剂部14的底部设置有试剂瓶底座16；所述试剂瓶底座16 的上表面开设有间隔分布的第三圆形凹槽18和第四圆形凹槽19；所述第三圆形凹槽18用于放置第一圆柱型试剂瓶，所述第一圆柱型试剂瓶为圆柱形试剂瓶，直径为3.0cm；所述第四圆形凹槽19用于放置第二圆柱型试剂瓶，所述第二圆柱型试剂瓶为圆柱形试剂瓶，直径为1.6cm。
[0009]
优选的，所述盒体1内部侧壁设立有缓冲垫；所述盒体1和盒盖 12的连接处设置有密封垫。
[0010]
优选的，所述第一圆形凹槽7的直径为1.1cm、深度为2.4cm，每两个相邻的第一圆形凹槽7的间距为1.0cm；所述第二圆形凹槽26 的直径为0.70cm、深度为1.6cm，每两个相邻的第二圆形凹槽26的间距为1.2cm。
[0011]
优选的，所述第三圆形凹槽18的直径为3.2cm；所述第四圆形凹槽19的直径为1.8cm。
[0012]
优选的，所述第三圆形凹槽18的数量为3个，在试剂部内靠一侧位置呈一列排列，相邻的两个第三圆形凹槽18的间距为1.1cm，所述第四圆形凹槽19的数量为5个，在试剂部内呈相邻两列排列，第一列分布有2个，相邻的两个第四圆形凹槽19的间距为6.0cm；第2列分布有3个，相邻的两个第四圆形凹槽19的间距为2.4cm。
[0013]
优选的，所述试剂部14还包括固定板15，用以固定第一圆柱型试剂瓶和第二圆柱型试剂瓶；所述固定板15包括上、下两个固定板，两个固定板的间隔高度为2.8cm；两个固定板15呈上下结构，一端固定在盒体1的内壁上，另一端固定在竖立隔板13上。
[0014]
优选的，所述离心管架27包括上、下重叠放置的两个离心管架；所述上、下重叠放置的两个离心管架之间设置有缓冲垫。
[0015]
优选的，所述48孔板3包括上、下重叠放置的两个48孔板；所述上、下重叠放置的两个48孔板间设置有缓冲垫。
[0016]
优选的，所述第一圆柱型试剂瓶用于盛装样品提取液；所述第二圆柱型试剂瓶用于盛装反转录试剂或qpcr反应液。
[0017]
优选的，所述缓冲垫的材质包括海绵或橡胶。
[0018]
本实用新型的有益效果：本实用新型提供了一种qpcr检测样品中mir-100含量的试剂盒，包括盒体1和盒盖12；所述盒体1包括试剂部14和耗材部10；所述试剂部14和耗材部10通过竖立隔板13分隔，分别放置试剂和耗材，防止误取、误用和交叉污染；通过在盒体内的侧壁增加缓冲垫、底部设置底座，防止试剂和耗材在晃动时发生碰撞、破损，具有保证盒体的密封性、方便打开使用、降低检测成本、提高工作效率等优点，解决了检测需要试剂和耗材种类繁多、准备工作繁杂、耗时；解决了耗材和试剂瓶容易碰撞、磨损和损坏；解决了试剂取用容易误取误用和交叉污染，以及密封性不好、使用不方便等问题。本实用新型通过合理的空间布局，能够集成qpcr检测样品中mir-100 含量过程所要用到的几乎所有试剂、耗材，具有大幅减少实验的准备工作、实验步骤和操作，大幅减少体力和时间的消耗，又可有效避免小核酸检测过程的交叉污染和误操作，保证试剂盒的密封，提升实验效率等优点。
附图说明
[0019]
图1是本实用新型试剂盒的侧视结构图，其中1为盒体、2为耗材底座、3为48孔板、4为海绵缓冲垫、5为离心管架下部、6为离心管架上部、7为第一圆形凹槽、8为大离心管、9为盒体内的侧壁缓冲垫、10为耗材部、11为密封垫、12为盒盖、13为竖立隔板、14 为试剂部、15为固定板、16为试剂瓶底座、17为第三圆形凹槽底部缓冲垫、18为第三圆形凹槽、19为第四圆形凹槽、27为离心管架；
[0020]
图2是本实用新型试剂盒局部俯视结构图，其中9为盒体内的侧壁缓冲垫、23为第一圆孔、15为固定板、20为第三圆孔、21和22 为第四圆孔、20-1用于盛装样品裂解液试剂瓶、20-2用于盛装样品洗涤液试剂瓶、20-3用于盛装样品洗脱液试剂瓶、21-1用于盛装反转录反应液试剂瓶、21-2用于盛装反转录酶液试剂瓶、21-3用于盛装 rnase抑制剂试剂瓶、21-4用于盛装mirna模板试剂瓶、22用于盛装qpcr反应液试剂瓶；
[0021]
图3是图1中的倒置的两用离心管架(5、6)局部侧视结构图，其中5为离心管架下部、6为离心管架上部、25为0.2ml小离心管、 26为第二圆形凹槽；
[0022]
图4是图1中的倒置的两用离心管架(5、6)局部俯视结构图、 5为离心管架下部、24为第二圆孔。
具体实施方式
[0023]
本实用新型提供了一种检测样品中mir-100含量的试剂盒，包括盒体1和盒盖12；
本实用新型提供了一种检测样品中mir-100含量的试剂盒，包括盒体1的外周长优选为29.4cm，宽度优选15.0cm，高度优选为2.1cm；所述试剂部14的长度优选为10.5cm，宽度优选为12.9cm，高度优选为13.0cm；所述耗材部10的长度优选为17.0cm，宽度优选为12.9cm，高度优选为13.0cm；所述试剂部14和耗材部 10通过竖立隔板13分隔；
[0024]
所述盒体1内空间被竖立隔板13分隔成试剂部14和耗材部10，用于分别放置试剂和耗材，便于区分和使用；
[0025]
所述耗材部10从下到上依次设置有耗材底座2、2个48孔板3、缓冲垫4和2个离心管架27；所述离心管架27的上表面开设有间隔分布的48个第一圆形凹槽7；所述离心管架27的下表面开设有间隔分布的48个第二圆形凹槽26；所述第一圆形凹槽7用于放置规格为1.5ml的离心管；所述第二圆形凹槽26用于放置规格为0.2ml的离心管；
[0026]
所述试剂部14的底部设置有试剂部底座16；所述试剂部底座16 的上表面开设有间隔分布的第三圆形凹槽18和第四圆形凹槽19；所述第三圆形凹槽18用于放置第一圆柱型试剂瓶，所述第一圆柱型试剂瓶为圆柱形试剂瓶，直径优选为3.0cm；所述第四圆形凹槽19用于放置第二圆柱型试剂瓶，所述第二圆柱型试剂瓶为圆柱形试剂瓶，直径优选为1.6cm。
[0027]
本发明中，所述样品优选的包括血清，更优选的包括人血清。
[0028]
本发明中，所述盒体1内部侧壁优选的设立有缓冲垫9，缓冲垫 9的材质优选为海绵；所述盒体1和盒盖12的连接处优选的设置有密封垫11，用以保证试剂盒的密封性，防止晃动时试剂瓶和耗材的碰撞和损坏。
[0029]
本发明中，所述48孔板的长度优选为16.8cm、宽度优选为 12.9cm、厚度优选为1.5cm；所述用于qpcr反应和荧光检测。
[0030]
本发明中，本发明中，所述第一圆形凹槽7的直径优选为1.1cm、深度优选为2.4cm；每两个相邻的第一圆形凹槽7的间距优选为1.0cm；所述第一圆形凹槽对应第一圆孔23；所述第二圆形凹槽26的直径优选为0.70m，深度优选为1.6cm；每两个相邻的第二圆形凹槽26的间距优选为1.2cm；所述第二圆形凹槽对应第二圆孔24。
[0031]
本发明中，所述第三圆形凹槽18的直径优选为3.2cm；所述第四圆形凹槽19的直径优选为1.8cm；所述第三圆形凹槽对应第三圆孔21和22；所述第四圆形凹槽对应第四圆孔20；所述第三圆形凹槽 18的底部和所述第四圆形凹槽19的底部优选的分别设置有缓冲垫，用以固定试剂瓶，防止晃动时试剂瓶的磨损和碰撞；所述缓冲垫的材质优选的包括橡胶。
[0032]
本发明中，所述第三圆形凹槽18的数量优选为3个，在试剂部内靠一侧位置呈一列排列，相邻的两个第三圆形凹槽18的间距优选为1.1cm；所述第四圆形凹槽19的数量优选为5个，在试剂部内呈相邻两列排列，第一列分布有2个，相邻的两个第四圆形凹槽19的间距优选为6.0cm；第2列分布有3个；相邻的两个第四圆形凹槽19 的间距优选为2.4cm。
[0033]
本发明中，所述试剂部14优选的还包括固定板15，用以固定第一圆柱型试剂瓶和第二圆柱型试剂瓶；所述固定板15优选包括上、下两个固定板，两个固定板的间隔高度优选为2.8cm，下边的固定板与试剂瓶底座16间的距离优选为1.8cm；两个固定板15呈上下结构，一端固定在盒体1的内壁上，另一端固定在竖立隔板13上。
[0034]
本发明中，所述离心管架27优选的包括离心管架上部6和离心管架下部5；所述离心管架27的材质优选为塑料；所述离心管架27 优选的包括上、下两个重叠放置的离心管架，每个离心管架的厚度优选为2.7cm；所述上、下放置的两个离心管架之间优选的包括缓
冲垫；所述缓冲垫的材质优选为海绵。
[0035]
在本发明的具体实施过程中，所述离心管架27为两用离心管架，所述离心管架27通过正、反向放置，分别适用于放置1.5ml离心管 (直径1.0cm)和0.2ml离心管(直径0.60cm)，如图1所示，白色部分在上紫色在下为正放离心管架。
[0036]
本发明中，所述48孔板3优选的包括上、下重叠放置的两个48 孔板；所述上、下重叠放置的两个48孔板间优选的包括缓冲垫；所述缓冲垫的材质优选的包括海绵。
[0037]
本发明中，所述48孔板3和离心管架27之间优选的设置有缓冲垫，所述缓冲垫的材质优选的包括海绵。
[0038]
本发明中，所述第一圆柱型试剂瓶用于盛装样品提取液；所述第二圆柱型试剂瓶用于盛装反转录试剂或qpcr反应液。
[0039]
在本发明具体实施过程中，试剂盒内配置的试剂分别用绿、蓝、红三种颜色瓶分开盛装，有效防止试剂取用过程中的误取和交叉污染；绿瓶盛装样品提取液，所述样品提取液优选的包括样品裂解液(a
-ꢀ
样品提取液1，对应图2中圆孔20-1)、样品洗涤液(b-样品提取液2，对应图2中圆孔20-2)和样品洗脱液(c-样品提取液3，对应图2中圆孔20-3)；蓝瓶盛装反转录试剂；所述反转录试剂优选的包括反转录反应液(d-反转录试剂1，对应图2中圆孔21-1)、反转录酶液(e
-ꢀ
反转录试剂2，对应图2中圆孔21-2)、rnase抑制剂(f-反转录试剂 3，对应图2中圆孔21-3)和mirna模板(g-反转录试剂4，对应图 2中圆孔21-4)；红瓶盛装qpcr反应液(对应图2中的圆孔22)。
[0040]
本发明中，所述样品提取液2包括wa漂洗液和ws漂洗液，可提高去除血清样品中细胞代谢物、蛋白质等杂质的能力；所述反转录试剂1包括多种脱氧核糖核苷酸混合液、反转录缓冲液和mirna；所述qpcr反应液包括qpcr所需的反应物pcr预混液、mir-100引物和无核酸酶蒸馏水。
[0041]
本发明中，将吸附柱ra放入无核酸酶的1.5ml离心管内组成过滤组合a，用于除去样品液中的长链rna；将mirna吸附柱ma 放入无核酸酶的1.5ml离心管内组成过滤组合b，用于将样品液内的mirna吸附下来。将足量袋装的过滤组合a和过滤组合b，连同袋装的无核酸酶的1.5ml离心管、0.2ml离心管放置在耗材部10上方的空余空间内。将无核酸酶的1000μl吸头、200μl和10μl低吸附吸头临时放置在试剂部14上方的空余空间内。
[0042]
本发明中，试剂盒内配有绿瓶c装的无核酸酶的蒸馏水试剂瓶，放入第一圆形凹槽18及第三圆孔20-3之中，它是样品提取液3，用于过滤柱中的mirna的洗脱，也是反转录和pcr反应的反应物之一。
[0043]
本发明的试剂盒能够大幅减少反转录过程的实验环节和操作，节省时间，提升实验效率。
[0044]
下面将结合本实用新型中的实施例，对本实用新型中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。
[0045]
实施例1
[0046]
一种检测血清中mir-100含量的多功能试剂盒，包括盒体1、耗材底座2、48孔板3、海绵缓冲垫4、正放离心管架下部5、离心管架上部6、第一圆形凹槽7、1.5ml大离心管8、盒体
内侧海绵缓冲垫 9、耗材部10、密封垫11、盒盖12、竖立隔板13、试剂部14、固定板15、试剂瓶底座16、橡胶软垫17、第三圆形凹槽18、第四圆形凹槽19、第三圆孔20、第二类圆孔21和22；第一圆孔23、第二圆孔 24、0.2ml小离心管25、第二圆形凹槽26、离心管架27。
[0047]
试剂盒内设有竖立隔板13，通过与盒体1连为一体加以固定，竖立隔板两侧设有海绵缓冲垫9，将试剂盒内部划分为耗材部和试剂部两个独立空间，分别用来放置耗材和试剂瓶。
[0048]
试剂部14的底端安装有试剂瓶底座16，试剂瓶底座16上依次开设有第三圆形凹槽18(3个)和第四圆形凹槽19(5个)，第三圆形凹槽18、第四圆形凹槽19的底部都安装有橡胶软垫17；试剂瓶通过固定架15放置在试剂瓶底座16上时，插接在第三圆形凹槽18或第四圆形凹槽19内，第三圆形凹槽或第四圆形凹槽内都安装橡胶软垫17，能够避免试剂瓶与试剂瓶底座16的直接接触，有晃动时减少晃动的冲力对试剂瓶底部的磨损，防止试剂瓶底部损坏。
[0049]
试剂瓶底座16上方安装有固定在盒体1上的固定板15，固定板数量为2个，两个固定板15呈上下结构，一端固定在盒体1的内壁上，另一端固定在竖立隔板13上，两个固定板15之间距离为2.8cm，本实用新型设置有固定板15，试剂部内的8个试剂瓶放置在盒体1 内时，通过固定板15上的第三圆孔20(3个)、第四圆孔21(4个) 和22(1个)放置在试剂瓶底座16上，固定板15对试剂瓶的上端和下端进行固定，使试剂瓶的摆放时更加稳定，运输时不会晃动，固定板15上的第三圆孔20与试剂瓶底座16上的第三圆形凹槽18的直径大小一致，都是3.2cm，用来放直径为3.0cm黄色试剂瓶；第四圆孔21和22和第四圆形凹槽19的直径为1.8cm，用来放置直径1.6cm 的蓝色试剂瓶和红色试剂瓶。试剂部14的空余空间用来临时放置袋装的无核酸酶的1000μl吸头、200μl和10μl低吸附吸头。
[0050]
耗材部10至下而上依次放置2个48孔板3、2个两用塑料离心管架27；耗材部10的空余空间用来放置袋装的过滤组合a和过滤组合b、袋装无核酸酶的1.5ml离心管和0.2ml离心管；其中正放的离心管架的白色部分(离心管架上部)开有第一圆形凹槽7，凹槽深度2.4cm，其直径与第一圆孔23的大小相一致，都是1.1cm，是用来放置直径1.0cm的1.5cm大离心管；倒放离心管架的紫色部分(离心管架下部)开有0.2ml第二圆形凹槽26，凹槽深度1.6cm，其直径与第二圆孔24的大小一致，都是0.70cm，用来放置直径0.60cm的 0.2ml小离心管。管架上的第一圆孔23之间距离为1.0cm，第二圆孔之间的距离为1.2cm。
[0051]
试剂盒内配置的试剂分别用绿、蓝、红三种颜色瓶分开盛装，有效防止试剂取用过程中的误取和交叉污染；绿瓶盛装样品提取液，所述样品提取液优选的包括样品裂解液(a-样品提取液1，对应图2中圆孔20-1)、样品洗涤液(b-样品提取液2，对应图2中圆孔20-2) 和样品洗脱液(c-样品提取液3，对应图2中圆孔20-3)；蓝瓶盛装反转录试剂；所述反转录试剂优选的包括反转录反应液(d-反转录试剂1，对应图2中圆孔21-1)、反转录酶液(e-反转录试剂2，对应图 2中圆孔21-2)、rnase抑制剂(f-反转录试剂3，对应图2中圆孔21-3) 和mirna模板(g-反转录试剂4，对应图2中圆孔21-4)；红瓶盛装 qpcr反应液(对应图2中圆孔22)。
[0052]
本发明中，将吸附柱ra放入无核酸酶的1.5ml离心管内组成过滤组合a，用于除去样品液中的长链rna；将mirna吸附柱ma 放入无核酸酶的1.5ml离心管内组成过滤组合b，用于将样品液内的 mirna吸附下来。将足量袋装的过滤组合a和过滤组合b，连同袋装的无核酸酶的1.5ml离心管、0.2ml离心管放置在耗材部10上方的空余空间，将无核酸酶的1000μl
吸头、200μl吸头和10μl低吸附吸头临时放置在试剂部14上方的空余空间。
[0053]
本发明中，试剂盒内配有绿瓶c装的无核酸酶的蒸馏水试剂瓶，放入第一圆形凹槽18及第三圆孔20-3之中，它是样品提取液3，用于过滤柱中的mirna的洗脱，也是反转录和pcr反应的反应物之一。
[0054]
示意图参见图1～图4。
[0055]
实施例2
[0056]
运用实施例1的试剂盒进行mir-100定量检测的实验过程需要经历样品mirna提取、反转录和qpcr定量检测三个阶段：
[0057]
1、取血液样品中加入3倍的样品提取液1，充分震荡、萃取；
[0058]
2、吸取上清，加入等体积室温的70％无水乙醇混匀、离心后，加入过滤组合a中；
[0059]
3、取滤液，加入过滤组合b中离心、过柱，收集过滤柱；
[0060]
4、加入样品提取液2漂洗、离心，重复2次，收集过滤柱；
[0061]
5、将收集的过滤柱放入无核酸酶的1.5ml离心管中，加入90℃样品提取液3静置、洗脱、离心，收集滤液即得mirna溶液；
[0062]
6、取mirna溶液，依次在0.2ml离心管内加入反转录试剂1、反转录试剂2、反转录试剂3和反转录试剂4后离心，在16℃下反应30min；
[0063]
7、然后在42℃下反应30min；
[0064]
8、最后在85℃下反应5min，取得mirna的反转录产物cdna 溶液，在4℃下保存；
[0065]
9、取上述cdna溶液，加入48孔板的反应孔内，再加入qpcr 反应液后离心，放入荧光定量pcr仪内进行pcr反应，先在95℃下反应30min；
[0066]
10、然后再进行45个循环的95℃、5s，60℃、1min，之后通过荧光定量pcr仪获取检测结果。
[0067]
采用本发明实施例1的试剂盒对179例正常人的血清样品中 mir-100含量进行检测，作为对照同时采用通常的荧光定量pcr检测方法对上述179例血清进行mir-100含量的检测。检测结果经过比对，每例检测结果的数值误差均在5％以内，一致性达100.0％。以上所述仅是本实用新型的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本实用新型的保护范围。

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