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2021-02-04 00:02:02|
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相关申请的交叉引用
本申请要求2017年12月14日提交的美国临时专利申请第62/598894号的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在政府支持下以美国国立卫生研究院授予的资助号分别为r01od023700和r01dk102960完成的。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术：
本公开一般地涉及分子生物学和医学领域；特别是基因工程化巨噬细胞及其在纤维化治疗中的用途。
相关技术描述
纤维化是由长期实质细胞损伤和/或炎症引起的与慢性损伤相关的常见瘢痕形成反应，其可能由多种因素引起，例如药物、毒素、辐射、任何干扰组织或细胞稳态的过程、中毒损伤、血流改变、感染(病毒、细菌、螺旋体和寄生虫)、沉积症以及导致有毒代谢产物积累的障碍。纤维化最常见于肝、心、肺、腹膜和肾。
例如，肝纤维化(肝脏纤维化)是由伤口愈合反应改变导致的，其特征是基质蛋白的产生增加和基质重塑降低。组织的正常结构元素被过量的无功能的瘢痕组织所代替。肝纤维化是慢性肝病的常见病理结果。在许多患者中，纤维化最终导致肝硬化，这是由异常肝结构定义的疾病，其纤维化间隔围绕再生结节和血管化改变。由于功能性实质储备减少和肝血流量改变，肝硬化与威胁生命的肝衰竭并发症以及门静脉高压并发症相关，肝衰竭并发症包括肝性脑病、凝血功能紊乱和细菌感染，门静脉高压并发症如腹水、静脉曲张破裂和肝肾综合征。另外，肝硬化的肝处于癌前状态，因此需要对肝细胞癌进行系统的筛查。几项临床报告证明，只要消除或控制了引起肝损伤的因素，大部分患者便会发生肝纤维化消退。与该观察结果一致，在啮齿动物中的研究还记录了在消除毒性损害后数周内纤维化或早期肝硬化的消退。纤维化的潜在可逆性在晚期下降。必须在形成可逆性肝瘢痕的早期治疗纤维化，以防止不可逆性肝硬化。
仍然需要其他和/或改进的疗法来逆转患有纤维化病症的个体的纤维化。
技术实现要素：
本文所述的实施方案提供了经工程化的巨噬细胞，其用于治疗纤维化并改善纤维化病变在各种器官和组织中的影响。某些实施方案涉及能够治疗纤维化或减少纤维化病变的基因工程化的巨噬细胞。在某些方面，可以对巨噬细胞进行基因工程化以(1)靶向细胞外基质(ecm)或其组分，(2)增强ecm的降解或(3)靶向ecm并增强ecm的降解。通过表达结合ecm的一种或多于一种组分(例如胶原蛋白)的一种或多于一种细胞表面受体(例如胶原蛋白受体)，可以将巨噬细胞工程化为靶向ecm。另外，可对巨噬细胞进行工程化以通过切割或降解一种或多于一种ecm组分的蛋白酶或其他酶(例如基质金属蛋白酶，mmp)的表达来增强ecm的降解。
在第一方面，基因工程化的巨噬细胞可包含或表达重组靶向蛋白和/或重组催化酶。重组靶向蛋白可包含结合例如胶原蛋白的ecm组分的蛋白。在一个实施方案中，重组靶向蛋白是胶原蛋白受体或其亚基。胶原蛋白受体是结合细胞外基质蛋白胶原蛋白的膜蛋白。在一个实施方案中，胶原蛋白受体或其亚基包含整联蛋白、网柄菌凝素结构域受体、甘露糖家族受体和/或免疫球蛋白样受体中的一种或多于一种。整联蛋白可以是α1β1、α2β1、α10β1和/或α11β1整联蛋白。一方面，网柄菌凝素结构域受体(ddr)可以是ddr1和/或ddr2。一方面，甘露糖家族受体可以是m-磷脂酶a2受体和/或endo180。一方面，免疫球蛋白样受体可以是糖蛋白vi。
一方面，重组靶向蛋白是整联蛋白α1(itga-1)(seqidno：1或seqidno：3，其分别为小鼠(例如genbank登录号np_001028400.2)和人(例如genbank登录号np_852478.1)。在某些方面，巨噬细胞可表达与seqidno：1或seqidno：3或其片段相同或与seqidno：1或seqidno：3或其片段具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(或其可衍生的任何范围)的核酸。在其他方面，巨噬细胞可表达与seqidno：2或seqidno：4或其功能变体或片段相同或与seqidno：2或seqidno：4或其功能变体具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(或其可衍生的任何范围)的多肽。
seqidno：1提供了小鼠itga-1的全长编码序列，其编码seqidno：2的氨基酸序列。seqidno：2是1179个氨基酸的蛋白质，其具有从seqidno：2的氨基酸1位至28位的信号肽(包含seqidno：2的氨基酸29位至1179位的成熟蛋白)和从大约氨基酸1142位至1164位的跨膜区域。在某些方面，seqidno：2的片段可以由工程化的巨噬细胞表达，该片段包含、包含至少或包含至多500个、501个、502个、503个、504个、505个、506个、507个、508个、509个、510个、511个、512个、513个、514个、515个、516个、517个、518个、519个、520个、521个、522个、523个、524个、525个、526个、527个、528个、529个、530个、531个、532个、533个、534个、535个、536个、537个、538个、539个、540个、541个、542个、543个、544个、545个、546个、547个、548个、549个、550个、551个、552个、553个、554个、555个、556个、557个、558个、559个、560个、561个、562个、563个、564个、565个、566个、567个、568个、569个、570个、571个、572个、573个、574个、575个、576个、577个、578个、579个、580个、581个、582个、583个、584个、585个、586个、587个、588个、589个、590个、591个、592个、593个、594个、595个、596个、597个、598个、599个、600个、601个、602个、603个、604个、605个、606个、607个、608个、609个、610个、611个、612个、613个、614个、615个、616个、617个、618个、619个、620个、621个、622个、623个、624个、625个、626个、627个、628个、629个、630个、631个、632个、633个、634个、635个、636个、637个、638个、639个、640个、641个、642个、643个、644个、645个、646个、647个、648个、649个、650个、651个、652个、653个、654个、655个、656个、657个、658个、659个、660个、661个、662个、663个、664个、665个、666个、667个、668个、669个、670个、671个、672个、673个、674个、675个、676个、677个、678个、679个、680个、681个、682个、683个、684个、685个、686个、687个、688个、689个、690个、691个、692个、693个、694个、695个、696个、697个、698个、699个、700个、700个、701个、702个、703个、704个、705个、706个、707个、708个、709个、710个、711个、712个、713个、714个、715个、716个、717个、718个、719个、720个、721个、722个、723个、724个、725个、726个、727个、728个、729个、730个、731个、732个、733个、734个、735个、736个、737个、738个、739个、740个、741个、742个、743个、744个、745个、746个、747个、748个、749个、750个、751个、752个、753个、754个、755个、756个、757个、758个、759个、760个、761个、762个、763个、764个、765个、766个、767个、768个、769个、770个、771个、772个、773个、774个、775个、776个、777个、778个、779个、780个、781个、782个、783个、784个、785个、786个、787个、788个、789个、790个、791个、792个、793个、794个、795个、796个、797个、798个、799个、800个、801个、802个、803个、804个、805个、806个、807个、808个、809个、810个、811个、812个、813个、814个、815个、816个、817个、818个、819个、820个、821个、822个、823个、824个、825个、826个、827个、828个、829个、830个、831个、832个、833个、834个、835个、836个、837个、838个、839个、840个、841个、842个、843个、844个、845个、846个、847个、848个、849个、850个、851个、852个、853个、854个、855个、856个、857个、858个、859个、860个、861个、862个、863个、864个、865个、866个、867个、868个、869个、870个、871个、872个、873个、874个、875个、876个、877个、878个、879个、880个、881个、882个、883个、884个、885个、886个、887个、888个、889个、890个、891个、892个、893个、894个、895个、896个、897个、898个、899个、900个、901个、902个、903个、904个、905个、906个、907个、908个、909个、910个、911个、912个、913个、914个、915个、916个、917个、918个、919个、920个、921个、922个、923个、924个、925个、926个、927个、928个、929个、930个、931个、932个、933个、934个、935个、936个、937个、938个、939个、940个、941个、942个、943个、944个、945个、946个、947个、948个、949个、950个、951个、952个、953个、954个、955个、956个、957个、958个、959个、960个、961个、962个、963个、964个、965个、966个、967个、968个、969个、970个、971个、972个、973个、974个、975个、976个、977个、978个、979个、980个、981个、982个、983个、984个、985个、986个、987个、988个、989个、990个、991个、992个、993个、994个、995个、996个、997个、998个、999个、1000个、1001个、1002个、1003个、1004个、1005个、1006个、1007个、1008个、1009个、1010个、1011个、1012个、1013个、1014个、1015个、1016个、1017个、1018个、1019个、1020个、1021个、1022个、1023个、1024个、1025个、1026个、1027个、1028个、1029个、1030个、1031个、1032个、1033个、1034个、1035个、1036个、1037个、1038个、1039个、1040个、1041个、1042个、1043个、1044个、1045个、1046个、1047个、1048个、1049个、1050个、1051个、1052个、1053个、1054个、1055个、1056个、1057个、1058个、1059个、1060个、1061个、1062个、1063个、1064个、1065个、1066个、1067个、1068个、1069个、1070个、1071个、1072个、1073个、1074个、1075个、1076个、1077个、1078个、1079个、1080个、1081个、1082个、1083个、1084个、1085个、1086个、1087个、1088个、1089个、1090个、1091个、1092个、1093个、1094个、1095个、1096个、1097个、1098个、1099个、1100个、1101个、1102个、1103个、1104个、1105个、1106个、1107个、1108个、1109个、1110个、1111个、1112个、1113个、1114个、1115个、1116个、1117个、1118个、1119个、1120个、1121个、1122个、1123个、1124个、1125个、1126个、1127个、1128个、1129个、1130个、1131个、1132个、1133个、1134个、1135个、1136个、1137个、1138个、1139个、1140个、1141个、1142个、1143个、1144个、1145个、1146个、1147个、1148个、1149个、1150个、1151个、1152个、1153个、1154个、1155个、1156个、1157个、1158个、1159个、1160个、1161个、1162个、1163个、1164个、1165个、1166个、1167个、1168个、1169个、1170个、1171个、1172个、1173个、1174个、1175个、1176个、1177个、1178个、1179个seqidno：2的连续氨基酸(或其中的任何范围)，该连续氨基酸起始于seqidno：2的氨基酸1位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位、10位、11位、12位、13位、14位、15位、16位、17位、18位、19位、20位、21位、22位、23位、24位、25位、26位、27位、28位、29位、30位、31位、32位、33位、34位、35位、36位、37位、38位、39位、40位、41位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、51位、52位、53位、54位、55位、56位、57位、58位、59位、60位、61位、62位、63位、64位、65位、66位、67位、68位、69位、70位、71位、72位、73位、74位、75位、76位、77位、78位、79位、80位、81位、82位、83位、84位、85位、86位、87位、88位、89位、90位、91位、92位、93位、94位、95位、96位、97位、98位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位、109位、110位、111位、112位、113位、114位、115位、116位、117位、118位、119位、120位、121位、122位、123位、124位、125位、126位、127位、128位、129位、130位、131位、132位、133位、134位、135位、136位、137位、138位、139位、140位、141位、142位、143位、144位、145位、146位、147位、148位、149位、150位、151位、152位、153位、154位、155位、156位、157位、158位、159位、160位、161位、162位、163位、164位、165位、166位、167位、168位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、176位、177位、178位、179位、180位、181位、182位、183位、184位、185位、186位、187位、188位、189位、190位、191位、192位、193位、194位、195位、196位、197位、198位、199位、200位、201位、202位、203位、204位、205位、206位、207位、208位、209位、210位、211位、212位、213位、214位、215位、216位、217位、218位、219位、220位、221位、222位、223位、224位、225位、226位、227位、228位、229位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、242位、243位、244位、245位、246位、247位、248位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、25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058位、1059位、1060位、1061位、1062位、1063位、1064位、1065位、1066位、1067位、1068位、1069位、1070位、1071位、1072位、1073位、1074位、1075位、1076位、1077位、1078位、1079位、1080位、1081位、1082位、1083位、1084位、1085位、1086位、1087位、1088位、1089位、1090位、1091位、1092位、1093位、1094位、1095位、1096位、1097位、1098位、1099位、1100位、1101位、1102位、1103位、1104位、1105位、1106位、1107位、1108位、1109位、1110位、1111位、1112位、1113位、1114位、1115位、1116位、1117位、1118位、1119位、1120位、1121位、1122位、1123位、1124位、1125位、1126位、1127位、1128位、1129位、1130位、1131位、1132位、1133位、1134位、1135位、1136位、1137位、1138位、1139位、1140位、1141位、1142位、1143位、1144位、1145位、1146位、1147位、1148位、1149位、1150位、1151位、1152位、1153位、1154位、1155位、1156位、1157位、1158位、1159位、1160位、1161位、1162位、1163位、1164位、1165位、1166位、1167位、1168位、1169位、1170位、1171位、1172位、1173位、1174位、1175位、1176位、1177位、1178位或1179位(或其中的任何位置范围)。
seqidno：3提供了人itga-1的全长编码序列，其编码seqidno：4的氨基酸序列。seqidno：4是1179个氨基酸的蛋白质，其具有从seqidno：4的氨基酸1位至28位的信号肽(包含seqidno：4的氨基酸29位至1179位的成熟蛋白)和从大约氨基酸1142位至1164位的跨膜区域。在某些方面，seqidno：4的片段可以由工程化的巨噬细胞表达，该片段包含、包含至少或包含至多500个、501个、502个、503个、504个、505个、506个、507个、508个、509个、510个、511个、512个、513个、514个、515个、516个、517个、518个、519个、520个、521个、522个、523个、524个、525个、526个、527个、528个、529个、530个、531个、532个、533个、534个、535个、536个、537个、538个、539个、540个、541个、542个、543个、544个、545个、546个、547个、548个、549个、550个、551个、552个、553个、554个、555个、556个、557个、558个、559个、560个、561个、562个、563个、564个、565个、566个、567个、568个、569个、570个、571个、572个、573个、574个、575个、576个、577个、578个、579个、580个、581个、582个、583个、584个、585个、586个、587个、588个、589个、590个、591个、592个、593个、594个、595个、596个、597个、598个、599个、600个、601个、602个、603个、604个、605个、606个、607个、608个、609个、610个、611个、612个、613个、614个、615个、616个、617个、618个、619个、620个、621个、622个、623个、624个、625个、626个、627个、628个、629个、630个、631个、632个、633个、634个、635个、636个、637个、638个、639个、640个、641个、642个、643个、644个、645个、646个、647个、648个、649个、650个、651个、652个、653个、654个、655个、656个、657个、658个、659个、660个、661个、662个、663个、664个、665个、666个、667个、668个、669个、670个、671个、672个、673个、674个、675个、676个、677个、678个、679个、680个、681个、682个、683个、684个、685个、686个、687个、688个、689个、690个、691个、692个、693个、694个、695个、696个、697个、698个、699个、700个、700个、701个、702个、703个、704个、705个、706个、707个、708个、709个、710个、711个、712个、713个、714个、715个、716个、717个、718个、719个、720个、721个、722个、723个、724个、725个、726个、727个、728个、729个、730个、731个、732个、733个、734个、735个、736个、737个、738个、739个、740个、741个、742个、743个、744个、745个、746个、747个、748个、749个、750个、751个、752个、753个、754个、755个、756个、757个、758个、759个、760个、761个、762个、763个、764个、765个、766个、767个、768个、769个、770个、771个、772个、773个、774个、775个、776个、777个、778个、779个、780个、781个、782个、783个、784个、785个、786个、787个、788个、789个、790个、791个、792个、793个、794个、795个、796个、797个、798个、799个、800个、801个、802个、803个、804个、805个、806个、807个、808个、809个、810个、811个、812个、813个、814个、815个、816个、817个、818个、819个、820个、821个、822个、823个、824个、825个、826个、827个、828个、829个、830个、831个、832个、833个、834个、835个、836个、837个、838个、839个、840个、841个、842个、843个、844个、845个、846个、847个、848个、849个、850个、851个、852个、853个、854个、855个、856个、857个、858个、859个、860个、861个、862个、863个、864个、865个、866个、867个、868个、869个、870个、871个、872个、873个、874个、875个、876个、877个、878个、879个、880个、881个、882个、883个、884个、885个、886个、887个、888个、889个、890个、891个、892个、893个、894个、895个、896个、897个、898个、899个、900个、901个、902个、903个、904个、905个、906个、907个、908个、909个、910个、911个、912个、913个、914个、915个、916个、917个、918个、919个、920个、921个、922个、923个、924个、925个、926个、927个、928个、929个、930个、931个、932个、933个、934个、935个、936个、937个、938个、939个、940个、941个、942个、943个、944个、945个、946个、947个、948个、949个、950个、951个、952个、953个、954个、955个、956个、957个、958个、959个、960个、961个、962个、963个、964个、965个、966个、967个、968个、969个、970个、971个、972个、973个、974个、975个、976个、977个、978个、979个、980个、981个、982个、983个、984个、985个、986个、987个、988个、989个、990个、991个、992个、993个、994个、995个、996个、997个、998个、999个、1000个、1001个、1002个、1003个、1004个、1005个、1006个、1007个、1008个、1009个、1010个、1011个、1012个、1013个、1014个、1015个、1016个、1017个、1018个、1019个、1020个、1021个、1022个、1023个、1024个、1025个、1026个、1027个、1028个、1029个、1030个、1031个、1032个、1033个、1034个、1035个、1036个、1037个、1038个、1039个、1040个、1041个、1042个、1043个、1044个、1045个、1046个、1047个、1048个、1049个、1050个、1051个、1052个、1053个、1054个、1055个、1056个、1057个、1058个、1059个、1060个、1061个、1062个、1063个、1064个、1065个、1066个、1067个、1068个、1069个、1070个、1071个、1072个、1073个、1074个、1075个、1076个、1077个、1078个、1079个、1080个、1081个、1082个、1083个、1084个、1085个、1086个、1087个、1088个、1089个、1090个、1091个、1092个、1093个、1094个、1095个、1096个、1097个、1098个、1099个、1100个、1101个、1102个、1103个、1104个、1105个、1106个、1107个、1108个、1109个、1110个、1111个、1112个、1113个、1114个、1115个、1116个、1117个、1118个、1119个、1120个、1121个、1122个、1123个、1124个、1125个、1126个、1127个、1128个、1129个、1130个、1131个、1132个、1133个、1134个、1135个、1136个、1137个、1138个、1139个、1140个、1141个、1142个、1143个、1144个、1145个、1146个、1147个、1148个、1149个、1150个、1151个、1152个、1153个、1154个、1155个、1156个、1157个、1158个、1159个、1160个、1161个、1162个、1163个、1164个、1165个、1166个、1167个、1168个、1169个、1170个、1171个、1172个、1173个、1174个、1175个、1176个、1177个、1178个、1179个seqidno：4的氨基酸(或其中衍生的任何范围)，该氨基酸起始于seqidno：4的氨基酸1位、4位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位、10位、11位、12位、13位、14位、15位、16位、17位、18位、19位、20位、21位、22位、23位、24位、25位、26位、27位、28位、29位、30位、31位、32位、33位、34位、35位、36位、37位、38位、39位、40位、41位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、51位、52位、53位、54位、55位、56位、57位、58位、59位、60位、61位、62位、63位、64位、65位、66位、67位、68位、69位、70位、71位、72位、73位、74位、75位、76位、77位、78位、79位、80位、81位、82位、83位、84位、85位、86位、87位、88位、89位、90位、91位、92位、93位、94位、95位、96位、97位、98位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位、109位、110位、111位、112位、113位、114位、115位、116位、117位、118位、119位、120位、121位、122位、123位、124位、125位、126位、127位、128位、129位、130位、131位、132位、133位、134位、135位、136位、137位、138位、139位、140位、141位、142位、143位、144位、145位、146位、147位、148位、149位、150位、151位、152位、153位、154位、155位、156位、157位、158位、159位、160位、161位、162位、163位、164位、165位、166位、167位、168位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、176位、177位、178位、179位、180位、181位、182位、183位、184位、185位、186位、187位、188位、189位、190位、191位、192位、193位、194位、195位、196位、197位、198位、199位、200位、201位、202位、203位、204位、205位、206位、207位、208位、209位、210位、211位、212位、213位、214位、215位、216位、217位、218位、219位、220位、221位、222位、223位、224位、225位、226位、227位、228位、229位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、242位、243位、244位、245位、246位、247位、248位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、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在一个实施方案中，重组催化酶是蛋白酶。在某些方面，蛋白酶是基质金属蛋白酶(mmp)。在一个实施方案中，基质金属蛋白酶是mmp1(例如np_002412)、mmp1a(例如np_114395.1)、mmp2(例如np_001121363)、mmp3(例如np_002413)、mmp7(例如np_002414)、mmp8(例如np_001291370)、mmp9(例如np_004985)、mmp10(例如np_002416)、mmp12(例如np_002417)、mmp13(例如np_002418)、mmp14(例如np_004986)、mmp17(例如np_057239)、mmp19(例如np_001259030)、mmp20(例如np_004762)、mmp21(例如np_671724)、mmp22(np_008914.1)、mmp24(例如np_006681)、mmp25(例如np_071913)、mmp26(例如np_068573)、mmp27(例如np_071405)和/或mmp28(例如np_001027449)。在一些方面，可以将这些中的一个或多于一个排除在外作为一个实施方案。
在某些实施方案中，基质金属蛋白酶是mmp1a。在某些实施方案中，巨噬细胞是m2特异性巨噬细胞。在一个实施方案中，重组靶向蛋白是由seqidno：3编码的人整联蛋白α1，重组催化酶是由seqidno：5编码的人mmp1，其中巨噬细胞是人m2特异性巨噬细胞。在某些方面，巨噬细胞可表达与seqidno：5或seqidno：7或其片段相同或与seqidno：5或seqidno：7或其片段具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(或其中可衍生的任何范围)的核酸。在其他方面，巨噬细胞可表达与seqidno：6或seqidno：8或其功能变体或片段具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
seqidno：5提供了人mmp1的全长编码序列，其编码seqidno：6的氨基酸序列。seqidno：6是469个氨基酸的蛋白质，其具有从seqidno：6的氨基酸1位至17位的信号肽(包含seqidno：6的氨基酸18位至469位的成熟蛋白)和从大约氨基酸98位至276位的金属蛋白酶区域。在某些方面，seqidno：6的片段可以由工程化的巨噬细胞表达，该片段包含或包含至少75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个、250个、251个、252个、253个、254个、255个、256个、257个、258个、259个、260个、261个、262个、263个、264个、265个、266个、267个、268个、269个、270个、271个、272个、273个、274个、275个、276个、277个、278个、279个、280个、281个、282个、283个、284个、285个、286个、287个、288个、289个、290个、291个、292个、293个、294个、295个、296个、297个、298个、299个、300个、301个、302个、303个、304个、305个、306个、307个、308个、309个、310个、311个、312个、313个、314个、315个、316个、317个、318个、319个、320个、321个、322个、323个、324个、325个、326个、327个、328个、329个、330个、331个、332个、333个、334个、335个、336个、337个、338个、339个、340个、341个、342个、343个、344个、345个、346个、347个、348个、349个、350个、351个、352个、353个、354个、355个、356个、357个、358个、359个、360个、361个、362个、363个、364个、365个、366个、367个、368个、369个、370个、371个、372个、373个、374个、375个、376个、377个、378个、379个、380个、381个、382个、383个、384个、385个、386个、387个、388个、389个、390个、391个、392个、393个、394个、395个、396个、397个、398个、399个、400个、401个、402个、403个、404个、405个、406个、407个、408个、409个、410个、411个、412个、413个、414个、415个、416个、417个、418个、419个、420个、421个、422个、423个、424个、425个、426个、427个、428个、429个、430个、431个、432个、433个、434个、435个、436个、437个、438个、439个、440个、441个、442个、443个、444个、445个、446个、447个、448个、449个、450个、451个、452个、453个、454个、455个、456个、457个、458个、459个、460个、461个、462个、463个、464个、465个、466个、467个、468个seqidno：6的氨基酸(或其中衍生的任何范围)，该氨基酸起始于seqidno：6的氨基酸1位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位、10位、11位、12位、13位、14位、15位、16位、17位、18位、19位、20位、21位、22位、23位、24位、25位、26位、27位、28位、29位、30位、31位、32位、33位、34位、35位、36位、37位、38位、39位、40位、41位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、51位、52位、53位、54位、55位、56位、57位、58位、59位、60位、61位、62位、63位、64位、65位、66位、67位、68位、69位、70位、71位、72位、73位、74位、75位、76位、77位、78位、79位、80位、81位、82位、83位、84位、85位、86位、87位、88位、89位、90位、91位、92位、93位、94位、95位、96位、97位、98位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位、109位、110位、111位、112位、113位、114位、115位、116位、117位、118位、119位、120位、121位、122位、123位、124位、125位、126位、127位、128位、129位、130位、131位、132位、133位、134位、135位、136位、137位、138位、139位、140位、141位、142位、143位、144位、145位、146位、147位、148位、149位、150位、151位、152位、153位、154位、155位、156位、157位、158位、159位、160位、161位、162位、163位、164位、165位、166位、167位、168位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、176位、177位、178位、179位、180位、181位、182位、183位、184位、185位、186位、187位、188位、189位、190位、191位、192位、193位、194位、195位、196位、197位、198位、199位、200位、201位、202位、203位、204位、205位、206位、207位、208位、209位、210位、211位、212位、213位、214位、215位、216位、217位、218位、219位、220位、221位、222位、223位、224位、225位、226位、227位、228位、229位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、242位、243位、244位、245位、246位、247位、248位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、259位、260位、261位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、277位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、287位、288位、289位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、306位、307位、308位、309位、310位、311位、312位、313位、314位、315位、316位、317位、318位、319位、320位、321位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、338位、339位、340位、341位、342位、343位、344位、345位、346位、347位、348位、349位、350位、351位、352位、353位、354位、355位、356位、357位、358位、359位、360位、361位、362位、363位、364位、365位、366位、367位、368位、369位、370位、371位、372位、373位、374位、375位、376位、377位、378位、379位、380位、381位、382位、383位、384位、385位、386位、387位、388位、389位、390位、391位、392位、393位、394位(或其中的任何位置范围)，结束于seqidno：6的氨基酸75位、76位、77位、78位、79位、80位、81位、82位、83位、84位、85位、86位、87位、88位、89位、90位、91位、92位、93位、94位、95位、96位、97位、98位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位、109位、110位、111位、112位、113位、114位、115位、116位、117位、118位、119位、120位、121位、122位、123位、124位、125位、126位、127位、128位、129位、130位、131位、132位、133位、134位、135位、136位、137位、138位、139位、140位、141位、142位、143位、144位、145位、146位、147位、148位、149位、150位、151位、152位、153位、154位、155位、156位、157位、158位、159位、160位、161位、162位、163位、164位、165位、166位、167位、168位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、176位、177位、178位、179位、180位、181位、182位、183位、184位、185位、186位、187位、188位、189位、190位、191位、192位、193位、194位、195位、196位、197位、198位、199位、200位、201位、202位、203位、204位、205位、206位、207位、208位、209位、210位、211位、212位、213位、214位、215位、216位、217位、218位、219位、220位、221位、222位、223位、224位、225位、226位、227位、228位、229位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、242位、243位、244位、245位、246位、247位、248位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、259位、260位、261位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、277位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、287位、288位、289位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、306位、307位、308位、309位、310位、311位、312位、313位、314位、315位、316位、317位、318位、319位、320位、321位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、338位、339位、340位、341位、342位、343位、344位、345位、346位、347位、348位、349位、350位、351位、352位、353位、354位、355位、356位、357位、358位、359位、360位、361位、362位、363位、364位、365位、366位、367位、368位、369位、370位、371位、372位、373位、374位、375位、376位、377位、378位、379位、380位、381位、382位、383位、384位、385位、386位、387位、388位、389位、390位、391位、392位、393位、394位、395位、396位、397位、398位、399位、400位、401位、402位、403位、404位、405位、406位、407位、408位、409位、410位、411位、412位、413位、414位、415位、416位、417位、418位、419位、420位、421位、422位、423位、424位、425位、426位、427位、428位、429位、430位、431位、432位、433位、434位、435位、436位、437位、438位、439位、440位、441位、442位、443位、444位、445位、446位、447位、448位、449位、450位、451位、452位、453位、454位、455位、456位、457位、458位、459位、460位、461位、462位、463位、464位、465位、466位、467位、468位、469位(或其中的任何位置范围)。
seqidno：7提供了小鼠mmp1a的全长编码序列，其编码seqidno：8的氨基酸序列。seqidno：8是464个氨基酸的蛋白质，其具有从seqidno：8的氨基酸1位至17位的信号肽(包含seqidno：8的氨基酸18位至464位的成熟蛋白)和从大约氨基酸95位至274位的金属蛋白酶区域。在某些方面，seqidno：8的片段可以由工程化的巨噬细胞表达，该片段包含或包含至少75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个、250个、251个、252个、253个、254个、255个、256个、257个、258个、259个、260个、261个、262个、263个、264个、265个、266个、267个、268个、269个、270个、271个、272个、273个、274个、275个、276个、277个、278个、279个、280个、281个、282个、283个、284个、285个、286个、287个、288个、289个、290个、291个、292个、293个、294个、295个、296个、297个、298个、299个、300个、301个、302个、303个、304个、305个、306个、307个、308个、309个、310个、311个、312个、313个、314个、315个、316个、317个、318个、319个、320个、321个、322个、323个、324个、325个、326个、327个、328个、329个、330个、331个、332个、333个、334个、335个、336个、337个、338个、339个、340个、341个、342个、343个、344个、345个、346个、347个、348个、349个、350个、351个、352个、353个、354个、355个、356个、357个、358个、359个、360个、361个、362个、363个、364个、365个、366个、367个、368个、369个、370个、371个、372个、373个、374个、375个、376个、377个、378个、379个、380个、381个、382个、383个、384个、385个、386个、387个、388个、389个、390个、391个、392个、393个、389个、395个、396个、397个、398个、399个、400个、401个、402个、403个、404个、405个、406个、407个、408个、409个、410个、411个、412个、413个、414个、415个、416个、417个、418个、419个、420个、421个、422个、423个、424个、425个、426个、427个、428个、429个、430个、431个、432个、433个、434个、435个、436个、437个、438个、439个、440个、441个、442个、443个、444个、445个、446个、447个、448个、449个、450个、451个、452个、453个、454个、455个、456个、457个、458个、459个、460个、461个、462个、463个、464个、465个、466个、467个、468个seqidno：8的氨基酸(或其中衍生的任何范围)，该氨基酸起始于seqidno：8的氨基酸1位、2位、3位、4位、5位、8位、7位、8位、9位、10位、11位、12位、13位、14位、15位、16位、17位、18位、19位、20位、21位、22位、23位、24位、25位、26位、27位、28位、29位、30位、31位、32位、33位、34位、35位、36位、37位、38位、39位、40位、41位、42位、43位、44位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、51位、52位、53位、54位、55位、56位、57位、58位、59位、60位、61位、62位、63位、64位、65位、66位、67位、68位、69位、70位、71位、72位、73位、74位、75位、76位、77位、78位、79位、80位、81位、82位、83位、84位、85位、86位、87位、88位、89位、90位、91位、92位、93位、94位、95位、96位、97位、98位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位、109位、110位、111位、112位、113位、114位、115位、116位、117位、118位、119位、120位、121位、122位、123位、124位、125位、126位、127位、128位、129位、130位、131位、132位、133位、134位、135位、136位、137位、138位、139位、140位、141位、142位、143位、144位、145位、146位、147位、148位、149位、150位、151位、152位、153位、154位、155位、156位、157位、158位、159位、160位、161位、162位、163位、164位、165位、166位、167位、168位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、176位、177位、178位、179位、180位、181位、182位、183位、184位、185位、186位、187位、188位、189位、190位、191位、192位、193位、194位、195位、196位、197位、198位、199位、200位、201位、202位、203位、204位、205位、206位、207位、208位、209位、210位、211位、212位、213位、214位、215位、216位、217位、218位、219位、220位、221位、222位、223位、224位、225位、226位、227位、228位、229位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、242位、243位、244位、245位、246位、247位、248位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、259位、260位、261位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、277位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、287位、288位、289位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、306位、307位、308位、309位、310位、311位、312位、313位、314位、315位、316位、317位、318位、319位、320位、321位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、338位、339位、340位、341位、342位、343位、344位、345位、346位、347位、348位、349位、350位、351位、352位、353位、354位、355位、356位、357位、358位、359位、360位、361位、362位、363位、364位、365位、366位、367位、368位、369位、370位、371位、372位、373位、374位、375位、376位、377位、378位、379位、380位、381位、382位、383位、384位、385位、386位、387位、388位、389位(或其中的任何位置范围)，结束于seqidno：8的氨基酸75位、76位、77位、78位、79位、80位、81位、82位、83位、84位、85位、86位、87位、88位、89位、90位、91位、92位、93位、94位、95位、96位、97位、98位、99位、100位、101位、102位、103位、104位、105位、106位、107位、108位、109位、110位、111位、112位、113位、114位、115位、116位、117位、118位、119位、120位、121位、122位、123位、124位、125位、126位、127位、128位、129位、130位、131位、132位、133位、134位、135位、136位、137位、138位、139位、140位、141位、142位、143位、144位、145位、146位、147位、148位、149位、150位、151位、152位、153位、154位、155位、156位、157位、158位、159位、160位、161位、162位、163位、164位、165位、166位、167位、168位、169位、170位、171位、172位、173位、174位、175位、176位、177位、178位、179位、180位、181位、182位、183位、184位、185位、186位、187位、188位、189位、190位、191位、192位、193位、194位、195位、196位、197位、198位、199位、200位、201位、202位、203位、204位、205位、206位、207位、208位、209位、210位、211位、212位、213位、214位、215位、216位、217位、218位、219位、220位、221位、222位、223位、224位、225位、226位、227位、228位、229位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、242位、243位、244位、245位、246位、247位、248位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、259位、260位、261位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、277位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、287位、288位、289位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、306位、307位、308位、309位、310位、311位、312位、313位、314位、315位、316位、317位、318位、319位、320位、321位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、338位、339位、340位、341位、342位、343位、344位、345位、346位、347位、348位、349位、350位、351位、352位、353位、354位、355位、356位、357位、358位、359位、360位、361位、362位、363位、364位、365位、366位、367位、368位、369位、370位、371位、372位、373位、374位、375位、376位、377位、378位、379位、380位、381位、382位、383位、384位、385位、386位、387位、388位、389位、390位、391位、392位、393位、394位、395位、396位、397位、398位、399位、400位、401位、402位、403位、404位、405位、406位、407位、408位、409位、410位、411位、412位、413位、414位、415位、416位、417位、418位、419位、420位、421位、422位、423位、424位、425位、426位、427位、428位、429位、430位、431位、432位、433位、434位、435位、436位、437位、438位、439位、440位、441位、442位、443位、444位、445位、446位、447位、448位、449位、450位、451位、452位、453位、454位、455位、456位、457位、458位、459位、460位、461位、462位、463位、464位(或其中的任何位置范围)。
在第二方面，预期了细胞群，其包含根据第一方面及其实施方案的基因工程化的巨噬细胞。
在第三方面，细胞治疗产品包含基因工程化的巨噬细胞，其包含重组靶向蛋白和重组催化酶中的至少一种。在第三方面的一个实施方案中，细胞治疗产品还包含一种或多于一种细胞介质组分和/或治疗化合物。在第三方面的另一个实施方案中，细胞治疗产品还包含有效量的α-生育酚、干扰素-γ、槲皮素、ace抑制剂和ppar-δ中的一种或多于一种。在第三方面的另一个实施方案中，细胞治疗产品还包含适合治疗应用的药物试剂和/或赋形剂。
术语“有效量”是指在必要的剂量和时间段内达到期望的治疗或预防效果的有效量。关于肝、心或肺纤维化，有效量是足以防止、延迟肝、心或肺的纤维化的进展或引起肝、心或肺纤维化消退的剂量或能够减轻由疾病引起的症状的剂量。在一个实例中，有效量是足以减轻肝炎症、降低肝酶水平(例如ast、alt和/或ap)和/或减少肝瘢痕形成至少10％、至少20％、至少50％、至少70％或至少90％的治疗量。在一个实例中，有效量是足以增加纤维化肝、纤维化心或纤维化肺中的肝功能、心功能或肺功能的治疗量，例如与不进行治疗相比增加至少10％、至少20％、至少50％、至少70％或至少90％的治疗量。在某些方面，巨噬细胞的有效量可以包括或包括至少或至多10个、100个、1000个、1x104个、1x105个、1x106个、1x107个、1x108个、1x109个、1x1010个巨噬细胞，包括它们之间的所有值和范围。
在第四方面，治疗个体纤维化的方法包括施用根据第三方面及其实施方案的细胞治疗产品。在一个实施方案中，细胞治疗产品通过注射施用至个体(例如全身或局部注射)。在某些方面，注射是通过静脉内注射。在其他方面，注射到纤维化病变或潜在的纤维化区域中或周围(1cm至10cm内)。当通过注射施用细胞治疗产品时，可以通过连续输注或通过单次或多次大剂量施用。在一个实施方案中，细胞治疗产品包含源自被治疗个体(即自体细胞)的基因工程化的巨噬细胞。
在第五方面，一种在需要其的个体中逆转或治疗纤维化的方法，包括向个体施用能够表达重组itga-1和mmp1或mmp1a的基因工程化的m2巨噬细胞，将巨噬细胞靶向至个体的纤维化区域，并逆转目标区域内的纤维化。
在第六方面，通过用一种或多于一种表达载体例如慢病毒构建体转染m2特异性巨噬细胞来制备基因工程化的巨噬细胞，并选择其用于整合表达载体和重组基因的表达。可以选择表达整联蛋白a1、mmp1或mmp1a或整联蛋白a1和mmp1或mmp1a两者的重组m2特异性重组巨噬细胞。所选的细胞可以作为治疗肝纤维化、心脏纤维化、肺纤维化和其他纤维化疾病的新方法引入个体。
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如本文所使用的，不使用数量词包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。例如，提及“代谢物”是指一种或多于一种代谢物。
应注意的是，本文中不使用诸如“优选”、“通常”和“特别”的术语来限制要求保护的发明的范围或暗示某些特征对于要求保护的发明的结构或功能是关键、必要或甚至重要的。而是，这些术语仅旨在强调能够或不能够在本发明的特定实施方案中使用的替代或附加特征。
为了描述和定义本发明的目的，应注意，本文所用的术语“基本上”代表固有的不确定性程度，其可归因于任何定量比较、值、测量或其他表示。术语“基本上”在本文中还用于表示定量表示可以不同于所陈述的参考而不会导致所讨论主题的基本功能发生变化的程度。
本领域技术人员众所周知的方法可用于构建根据本发明的基因表达构建体、靶向载体和基因工程化的细胞。这些方法包括体外重组dna技术、合成技术、体内重组技术、聚合酶链反应(pcr)技术等。参见，例如green&sambrook，2012，molecularcloning：alaboratorymanual，fourthedition，coldspringharborlaboratory，newyork；ausubel等人，1989，currentprotocolsinmolecularbiology，greenepublishingassociatesandwileyinterscience，newyork，和pcrprotocols：aguidetomethodsandapplications(innis等人，1990，academicpress，sandiego，ca)中描述的技术。
如本文所使用的，术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可以互换使用，以指代包含dna、rna、其衍生物或它们的组合的核酸。
如本文所使用的，术语“基因工程化”是指一种或多于一种细胞的遗传操作，由此一种或多于一种细胞的基因组已被至少一种dna序列增强。候选dna序列包括但不限于非天然存在的基因，通常不会转录为rna或翻译为蛋白质(“表达的”)的dna序列，以及需要引入一种或多于一种细胞的其他基因或dna序列。应当理解，通常通过瞬时或稳定引入一种或多于一种重组基因来增强本文所述的基因工程化的细胞的基因组。
通常，引入的dna最初不是存在于接受该dna的细胞中，而是从给定的基因工程化的细胞中分离dna片段，然后将该dna的一种或多于一种其他拷贝引入相同的基因工程化的细胞，例如来增强基因产物的产生或改变基因的表达模式，也属于本公开的范围。在某些情况下，引入的dna将通过例如同源重组、定点诱变和/或基因组编辑技术来修饰或甚至替换内源基因或dna序列，基因组编辑技术包括crispr(规律间隔成簇的短回文重复序列)和/或哺乳动物转座子技术，例如通过使用piggybactm转座子。在一些情况下，通过病毒载体将引入的dna引入受体，所述病毒载体包括来自逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒的载体。在一些情况下，通过电穿孔将引入的dna直接引入受体细胞。
如本文所使用的，术语“重组基因”是指被引入基因工程化的细胞中的基因或dna序列，而不管这种宿主中是否已经存在相同或相似的基因或dna序列。在这种情况下，“引入”或“增强”在本领域中已知是指由人手引入或增强。因此，重组基因可以是来自另一个物种的dna序列，或者可以是起源于或存在于相同物种中但已经通过形成基因工程化的细胞的方法引入细胞中的dna序列。应当理解，被引入细胞的重组基因可以与通常存在于被转化细胞中的dna序列相同，并被引入以提供dna的一个或多余一个其他拷贝，从而允许该dna的基因产物的过表达或改变的表达。也可以将不同的驱动启动子或相关序列引入重组基因，从而改变基因的表达水平或模式。这样的重组基因由cdna特别编码。也可以包括非编码序列，例如短发夹状rna、微rna或长非编码rna。
还考虑到可以通过提高特定基因的翻译效率来对重组基因进行密码子优化，以最大化基因工程化的细胞中的蛋白质表达。密码子优化可以例如通过将一种物种的核苷酸序列转化为不同物种的遗传序列来实现。优化的密码子有助于实现更快的翻译速度和更高的准确性。由于这些因素，预计在高表达基因中翻译选择会更强。然而，尽管本文考虑了使用优化的密码子来表达公开的蛋白质，但是本文考虑了用于编码任何公开的蛋白质的核酸的所有可能的密码子。
如本文所使用的，术语“细胞治疗产品”是指包含一种或多于一种细胞的细胞群，该一种或多于一种细胞已被基因工程化以靶向个体中的期望位置中的至少一种并在期望位置具有生理相关作用。例如，细胞治疗产品可以是细胞群，其包括可以降解胶原蛋白的基因工程化的巨噬细胞。细胞群可以是同质的(即，仅包含基因工程化的巨噬细胞)或异质的(包含基因工程化的巨噬细胞、非基因工程化的巨噬细胞以及其他无论是否为基因工程化的细胞类型)。细胞治疗产品还可以包含一种或多于一种细胞培养基成分(例如缓冲液、抗生素、盐、维生素、生长因子、氨基酸等)和/或治疗性化合物，以维持细胞群和/或治疗疾病。例如，细胞治疗产品可以包含基因工程化的巨噬细胞和抗生素。细胞治疗产品还可以包含其他治疗剂，例如α-生育酚、干扰素-γ、槲皮素、ace抑制剂和ppar-δ中的一种或多于一种。适用于治疗应用的其他治疗剂和药物试剂和/或赋形剂也可以包含在预期的细胞治疗产品中。考虑将其他试剂包含在细胞治疗产品中。
术语“治疗”是指在减轻或改善伤害、病理或病症方面的任何成功或成功的标志，包括任何客观或主观参数，例如减轻、缓解、减少症状或使患者更能忍受伤害、病理或病症，减慢退化或衰退的速度，使退化的终点衰弱减少，改善对象的身心健康，或延长存活时间。症状的治疗或缓解可以基于客观或主观参数，包括体格检查、神经系统检查和/或精神病学评估的结果。
如本文所使用的，术语“或”和“和/或”用于描述组合或彼此排斥的多个部分。例如，“x、y和/或z”可以指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”或“x或y或z”。特别预期的是，x、y或z可以从实施方案中具体排除。
在整个申请中，术语“约”根据其在细胞生物学领域中的普通和一般含义使用，以指示值包括用于确定该值的装置或方法的误差的标准偏差。
与“包括”、“含有”或“特征在于”同义的术语“包含”是包含性的或开放式的，并且不排除其他未叙述的要素或方法步骤。短语“由......组成”不包括未指定的任何元素、步骤或成分。短语“基本上由......组成”将所描述的主题的范围限制为指定的材料或步骤，以及不实质影响其基本和新颖特征的材料或步骤。可以设想，在术语“包含”的上下文中描述的实施方案也可以在术语“由......组成”或“基本上由......组成”的上下文中实现。
特别考虑到的是，关于本发明的一个实施方案讨论的任何限制可以适用于本发明的任何其他实施方案。此外，本发明的任何组合物可用于本发明的任何方法，并且本发明的任何方法可用于制备或利用本发明的任何组合物。在实施例中阐述的实施方案的方面也是可以在不同实施例中的其他地方或本申请的其他地方，例如在发明内容、具体实施方式、权利要求和附图说明中讨论的实施方案的上下文中可以实施的实施方案。
通过下面的详细描述以及所附的权利要求书，将更加充分地理解本发明的这些和其他特征和优点。应注意，权利要求的范围由其中的叙述限定而不是由在本说明书中阐述的特征和优点的具体讨论来限定。
附图说明
图1a和图1b示出了抗炎m2特异性巨噬细胞治疗对小鼠中ccl4介导的肝纤维化的有效性。图1a示出了仅用ccl4处理10周后的小鼠肝的超声扫描。图1b示出了在用ccl4处理10周后，用可以促进组织修复和再生的抗炎的m2特异性巨噬细胞治疗，小鼠肝的超声扫描。每个图中的星号表示肝叶，信号强度(亮度)表示与纤维化相关的肝纹理硬度。与图1a相比，图1b中显著较小的强度(亮度)表明本发明的抗炎m2特异性巨噬细胞治疗在去除肝纤维化中的有效性。
图2a和图2b显示了用ccl4处理的小鼠肝的组织化学分析。处死经治疗的小鼠，将其肝切除，切片并用苏木精和曙红染色。图2a显示仅用ccl4处理10周后的小鼠肝切片。明显有炎症、纤维化病变和坏死病变。图2b显示了在用ccl4处理10周后，用抗炎的m2特异性巨噬细胞处理后的小鼠肝切片。与图2a相比，在图2b中明显减少了炎症和纤维化病变(箭头)。对于每个附图，比例尺指示为500μm。病理评价见表1。
图3a和图3b显示了用ccl4处理的小鼠肝的组织化学分析。处死经治疗的小鼠，将其肝切除，切片，并用三色染色剂对胶原纤维染色。箭头指示纤维化病变的区域。图3a显示仅用ccl4处理10周后的小鼠肝切片。纤维化的几个区域是明显的。图3b显示了在用ccl4处理10周后，用抗炎的m2特异性巨噬细胞处理后的小鼠肝切片。与图3a相比，在图3b中注意到纤维化病变的明显减少(箭头)。对于每个附图，比例尺指示为500μm。
图4a和图4b显示了用于表达整联蛋白a1(图4a)或mmp1(图4b)的慢病毒构建体。每个载体编码由cmv启动子驱动的整联蛋白或mmp1以及由组成型启动子ubic(泛素c启动子)驱动的选择标记(荧光蛋白tdtomato和嘌呤霉素抗性基因，puro)。tdtomato和puro可被自切割的肽t2a隔开。
图5a和图5b显示了工程化的巨噬细胞的植入部分地预防了mi引起的左心室收缩功能障碍。在接受pbs注射的mi小鼠中，射血分数(ef)(图5a)和短轴缩短率(fs)(图5b)明显恶化，表明由lad手术引起的收缩功能受损/心力衰竭。接受工程化的巨噬细胞的小鼠的射血分数(ef)和短轴缩短率(fs)高于接受pbs的小鼠，显示了工程化的巨噬细胞对mi后心脏的心脏保护作用。
图6a和图6b显示了使用工程化的巨噬细胞的细胞疗法预防了mi引起的lv扩张。在pbs组中，对lad进行手术结扎后，观察到lv室尺寸增大。工程化的巨噬细胞的植入阻止了mi引起的lv扩张。图6alvid；d，图6blvid；s。
图7a和图7b显示了使用工程化的巨噬细胞的细胞疗法预防了缺血性心肌重塑。pbs组中心肌梗死引起心肌重塑，这通过心重量的增加来证明。工程化的巨噬细胞组中的心脏重量降低表明细胞疗法使重塑进程退步。图7ahw/bw，图7bhw/t。
图8显示了使用工程化的巨噬细胞的细胞疗法预防了tac引起的lv舒张功能障碍。在pbs组中，通过手术限制主动脉后，观察到e/a增加。工程化的巨噬细胞的植入可防止lv的tac引起的舒张功能障碍。
图9a、图9b和图9c显示了巨噬细胞植入对blm引起的小鼠肺损伤的作用。在pbs/blm暴露14天后，从c57bl6小鼠的肺制备的组织切片上进行h&e染色。(图9a)：暴露于pbs并注射pbs的对照小鼠。(图9b)：纤维化组的小鼠暴露于blm然后注射pbs。(图9c)：通过尾静脉注射的巨噬细胞治疗减少了受到blm攻击的小鼠的纤维化和肺部炎症程度。
具体实施方式
本文所述的实施方案涉及能够除去例如肝、心脏或肺纤维化中的纤维化瘢痕的基因工程化的巨噬细胞。本公开还涉及细胞治疗产品，例如基因工程化的巨噬细胞的富集群体。更进一步，本公开内容针对通过将基因工程化的巨噬细胞递送至受损肝来增强纤维化组织的分解并引起功能性肝细胞再生的新型治疗方法。下面描述某些实施方案的附加特征和优点。
细胞选择与生长
可以在本公开中使用的合适的细胞包括但不限于巨噬细胞。在一个具体实施方案中，预期用于本文的细胞包括m2巨噬细胞，其可以关闭炎症反应并促进组织伤口修复，称为“抗炎m2特异性巨噬细胞”。
在一些实施方案中，可以从待处理的个体(自体来源)中提取细胞，进行基因改造，然后再引入(例如通过注射)回该个体中，以除去该个体的肝、心脏、肺或其他组织或器官中的纤维化瘢痕。在一个实施方案中，这样的细胞治疗产品可以源自个体的单采血液分离术产品。在另一个实施方案中，预期用于个体的细胞治疗产品可以源自取自另一个个体(异源)或另一个细胞来源的血液分离术产品。在一个实施方案中，可以如fraser等人所述制备合适的自体巨噬细胞群体(development，functionalcharacterizationandvalidationofmethodologyforgmp-compliantmanufactureofphagocyticmacrophages：anovelcellulartherapeuticforlivercirrhosis.cytotherapy2017sep；19(9)：1113-1124)。
通过在纤维化部位向个体施用工程化的m2巨噬细胞来治疗人或其他哺乳动物对象中纤维化的方法。巨噬细胞的来源可以是炎症部位或附近的外周血或组织。巨噬细胞来源可以是分离的来源，其包括包含巨噬细胞的离体组合物。这样的组合物可以是巨噬细胞的培养物，从对象(可以是待治疗的对象)获得的含巨噬细胞的组织，或者是培养物，如包含单核细胞的培养物。
巨噬细胞的来源可以是浓缩的巨噬细胞溶液，其是通过分级分离自患者获得的外周血而产生的。分级分离外周血包括制备外周血单核细胞(pbmc)的悬浮液并诱导pbmc分化为巨噬细胞。从外周血制备pbmc的悬浮液可以通过本领域通常已知的任何方法进行。作为非限制性实例，可以通过ficoll梯度离心法制备pbmc。ficoll梯度离心包括将一定体积的ficoll转移到管，如试管中。然后将全血轻轻覆盖在ficoll上，并将管在室温下从约175g至约225g离心约15分钟至约60分钟。在一个优选的实施方案中，将管以200g离心45分钟。离心后，剩下红细胞沉淀、ficoll层、包含pbmc的白色层和血浆层。然后可以从管中去除包含pbmc的白色层。由于pbmc包含单核细胞和淋巴细胞，因此可以对pbmc进行处理以分离单核细胞。例如，可以使用anti-cx3cr1microbeads试剂盒(miltenyibiotecinc.，加利福尼亚州奥本)将单核细胞与磁珠特异性结合，然后可以将其与淋巴细胞分离。或者，可通过流式细胞术技术，例如荧光激活细胞分选(facs)，将pbmc与淋巴细胞分离。分离后，pbmc可以在不诱导分化的巨噬细胞基础培养基dxf(prmocell)中培养。pbmc或分离的单核细胞向巨噬细胞的分化可通过，例如，在含有巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)的分化培养基中培养pbmc或分离的单核细胞来诱导。在各种实施方案中，分化培养基是巨噬细胞基础培养基dxf(promocell，heidelberg，德国)。分化为巨噬细胞后，即可以将巨噬细胞悬浮在培养基中以产生浓缩的巨噬细胞溶液。然后可以对m2巨噬细胞进行操纵，例如转染和工程化，以产生本文所述的靶向巨噬细胞。
培养过程。所使用的培养基可以是含有细胞存活生长所需的成分(无机盐、碳水化合物、激素、必需氨基酸、非必需氨基酸和维生素)等的基础培养基。培养基的实例包括dulbecco的改良版eagle培养基(dmem)、最低必需培养基(mem)、基础培养基fagle(bme)、dulbecco改良版eagle培养基：营养物质混合物f-12(dmem/f-12)、glasgow最低必需培养基(glasgowmem)、
另外，可以将诱导巨噬细胞分化或特性化的化合物添加到要使用的培养基中。通过添加该化合物，可以进一步加速分化或性状改变的速率，并且可以在特定方向上控制分化或性状。将巨噬细胞性状诱导为m1巨噬细胞的化合物的实例包括th1细胞因子，例如干扰素(ifn)-γ、肿瘤坏死因子(tnf)-α、脂多糖(lps)等，并且这些化合物中的两种或多于两种可以组合使用。另外，将巨噬细胞性状诱导为m2巨噬细胞的化合物的实例包括th2细胞因子，例如白介素(il)-4和il-13，并且这些化合物中的两种或多于两种可以组合使用。另外，可以将性状诱导为m1巨噬细胞和性状诱导为m2巨噬细胞组合使用。
诱导巨噬细胞分化的化合物的浓度没有特别限制，可以为1nm以上且1μm以下，可以为5nm以上且100nm以下。在上述范围内，可以更有效地将巨噬细胞的性状诱导为m1或m2巨噬细胞。
培养条件只要是适于培养巨噬细胞的方法就没有特别限制，例如，将巨噬细胞接种于培养基中的密度优选为1×100个细胞/ml至1×107个细胞/ml，更优选为1×102个细胞/ml至1×106个细胞/ml。培养温度优选为25℃以上且40℃以下，更优选为30℃以上且39℃以下，进一步优选为35℃以上且39℃以下。可以根据巨噬细胞的生长状态适当地设定培养时间，优选为1小时以上且100小时以下。培养环境为优选在co2条件下通过约5％的二氧化碳培养。
基因构建体
在一些实施方案中，本发明的基因工程化巨噬细胞可包括一种或多于一种重组基因。预期用于本文的基因构建体可以在重组宿主细胞中瞬时表达或永久表达。在一个特定的实施方案中，基因工程化巨噬细胞可包括一种或多于一种基因，其可用于将细胞(例如巨噬细胞)靶向至期望的位置，例如肝、心脏、肺或具体的纤维化瘢痕。例如，基因工程化巨噬细胞可包括一种或多于一种重组胶原蛋白受体或其亚基。可用于本文的预期胶原蛋白受体的实例包括但不限于整联蛋白。在一个实施方案中，基因工程化巨噬细胞包括α1β1、α2β1、α10β1和/或α11β1整联蛋白的一个或多于一个亚基。具体实例包括整联蛋白a1或α1(itga-1)，如seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3和/或seqidno：4所示。其他预期的胶原蛋白受体包括网柄菌凝素结构域受体，例如ddr1(例如np_001189450)和/或ddr2(例如np_001014796)、甘露糖家族受体，例如，m-磷脂酶a2受体(例如np_001007268和endo180受体(例如p22897))和免疫球蛋白样受体，例如糖蛋白vi(例如np_001077368)。在一个特定的实施方案中，基因工程化巨噬细胞包括并表达itga-1(整联蛋白α亚基1)。尽管不希望受到理论的束缚，但据信一种或多于一种靶向蛋白(例如胶原蛋白受体或其亚基)的表达不仅会增强基因工程化巨噬细胞对肝、心、肺或其他组织的靶向性，还会使巨噬细胞在损伤部位(富含胶原蛋白的环境)保留更长的时间，从而提高其治疗纤维化的功效、特异性和安全性。
在另一个实施方案中，本发明的基因工程化巨噬细胞可以包括一种或多于一种增强纤维化(例如，肝、心脏或肺)降解的基因。例如，本发明的基因工程化巨噬细胞可以包括一种或多于一种胶原酶。在本文考虑的一个特定实施例中，本文描述的基因工程化巨噬细胞包括并表达一种或多于一种基质金属蛋白酶(mmp)。预期的mmp的实施例包括但不限于mmp1、mmp1a、mmp2、mmp3、mmp7、mmp8、mmp9、mmp10、mmp12、mmp13、mmp14、mmp17、mmp19、mmp20、mmp21、mmp22、mmp24、mmp25、mmp26、mmp27和mmp28(caley等人adv.woundcare(newrochelle)2015，4：225-34)。在一些实施方案中，可以排除一个或多于一个mmp。
还考虑到，本发明的基因工程化巨噬细胞可以包括其他器官或组织特异性靶向蛋白、肽和/或分子和/或其他催化酶或物质，以从患病个体中去除纤维化瘢痕。
治疗方法
在本发明的一些实施方案中，考虑了治疗个体纤维化的方法。可以治疗的疾病包括肝纤维化、心脏纤维化、肺纤维化、关节纤维化、骨髓纤维化、纵隔纤维化、腹膜后纤维化、肾因性全身性纤维化以及瘢痕瘤、克罗恩病、乳房纤维囊肿和佩罗尼病等。在一个特定实施方案中，一种治疗个体的肝、心脏或肺纤维化的方法，包括获取巨噬细胞群，基因工程化巨噬细胞群以表达靶向纤维化的蛋白质，以及向所述个体施用基因工程化巨噬细胞群。
可以制备本发明的基因工程化巨噬细胞，并立即用于治疗有此需要的个体。或者，可以制备基因工程化巨噬细胞群并冷冻以备后用。
基因工程化巨噬细胞的施用可以通过一般公认的任何向个体细胞施用的方式进行(例如静脉内施用)。在一些实施方案中，可以通过门静脉注射、心内注射或静脉内(iv)注射将基因工程化巨噬细胞引入有需要的个体。
肝纤维化。慢性肝病患者经常发生肝纤维化或肝纤维化瘢痕。例如肝炎感染(通过乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒)、威尔森氏病、胆管阻塞、非酒精性脂肪肝和酒精滥用(例如饮酒障碍或“aud”)的疾病通常会导致肝纤维化的发展，尽管接触毒素和外伤也与病情有关。肝纤维化是细胞外基质(ecm)蛋白尤其是α1胶原蛋白过度积累的结果，这些蛋白是由诸如肝星状细胞(hsc)等细胞对肝损伤做出反应(即伤口愈合反应的慢性激活)而产生的。
通常，至少需要数月至数年的持续性肝损伤才能引起纤维化。晚期肝纤维化可导致肝硬化、肝功能不全、门脉高压和肝衰竭。对于终末期慢性肝病的患者，只有很少的治疗选择，其中肝移植是那些肝受损而无法再生的人的最后选择。然而，肝移植是一种极具侵害性和风险的医学干预措施。同样，患有晚期肝病的患者通常不符合移植条件。此外，肝移植非常昂贵，在美国的费用可能超过60万美元。因此，对于肝纤维化患者需要新的治疗选择。
一种潜在的治疗选择是逆转肝纤维化。逆转肝纤维化的方法已经研究了近50年。即便如此，逆转肝纤维化的最佳方法仍然是试图消除引起纤维化并允许肝再生的原发疾病。即使这样，肝再生仍不能总是完全逆转肝纤维化，并且在患有肝病的个体中肝再生的能力逐渐丧失。因此，正在进行的治疗研究正在开发针对各种分子和细胞靶标的化合物的抗纤维化全套资源，以预防或减慢纤维化。抗纤维化化学候选物的实例包括α-生育酚(抑制hsc活化)、干扰素-γ(抑制hsc中的ecm合成)、槲皮素(抗氧化剂)、acei抑制剂(抑制hsc增殖)和ppar-δ(参见houlum等人gastroenterology1997，113：1069-73；rockey等人jinvestigmed.1994，42：660-70；pavanato等人digdissci.2003，48：824-9；warner等人clinsci(lond)2007，113：109-18；marra等人gastroenterology2000，119：466-78)。然而，这些新生治疗候选物中的许多显然通过预防肝纤维化的发展(抑制慢性伤口愈合)而不是消除现有的纤维化瘢痕而起作用。有其他方法可以逆转肝纤维化。
正在探索一种治疗肝疾病的替代方法，该方法利用骨髓细胞疗法改善肝纤维化。使用实验性肝损伤的动物模型表明，巨噬细胞可以在纤维化肝病的控制和修复中发挥关键作用(ramachandran等人procnatlacadsciusa2012，109：e3186-95)。确实，一些针对肝硬化的骨髓细胞疗法的研究表明，实验性慢性肝损伤的一些临床参数已有所改善(thomas等人hepatology2011，jun；53(6)：2003-15)。然而，现有的基于细胞的方法疗效有限。
心脏纤维化。心脏纤维化是心脏病的标志，被认为可导致心源性死亡、室性心律失常、左心室(lv)功能不全和心力衰竭。心脏纤维化的特征是在心肌细胞死亡、发炎、工作量增加、肥大以及受到多种激素、细胞因子和生长因子刺激后发生的原纤维化胶原蛋白的积累不成比例。
心脏纤维化也可能是由于心脏成纤维细胞的不适当增殖引起的心脏瓣膜异常增厚，但更常见地是指心肌中成纤维细胞的增殖。纤维细胞通常分泌胶原蛋白，并为心脏提供结构支持。当过度激活时，该过程导致瓣膜增厚和纤维化，白色组织主要在三尖瓣上积聚，但也发生在肺动脉瓣上。增厚和失去弹性最终可能导致瓣膜功能障碍和右侧心力衰竭。
对于心脏瓣膜纤维化或其他部位的纤维化，最明显的治疗方法是停止刺激性药物或产生5-羟色胺。对于某些患者，必须进行外科三尖瓣置换术以治疗严重狭窄(血流阻塞)。此外，还发现了在红酒中发现的一种化合物白藜芦醇可减慢心脏纤维化的发展(olson等人(2005)americanjournalofphysiology.heartandcirculatoryphysiology288(3)：h1131-8；aubin等人(2008)thejournalofpharmacologyandexperimentaltherapeutics325(3)：961-8)。目前正在动物模型中测试更复杂的抗心脏纤维化方法，例如微小rna抑制(例如mir-21)。
心脏病是发达国家的主要死因，仅在美国，每年就造成约80万人死亡。存在多种形式的具有不同病理学观察结果的心血管疾病。大多数心脏疾病与心脏纤维化有关，心脏纤维化是指由成肌纤维细胞的不适当增殖和心肌中细胞外基质(ecm)蛋白的过多沉积引起的心脏瓣膜异常瘢痕形成过程。肌成纤维细胞主要负责过多纤维化ecm的沉积(travers等人circres，2016，118(6)：1021-40)。
在过去的几十年中，对心脏纤维化的激活进行了广泛的研究。响应缺血或心肌梗塞等急性心脏损伤或高血压、糖尿病性心肌病等慢性疾病，心脏结缔组织内的心肌成纤维细胞(cf)被激活并转化为成肌纤维细胞，从而诱导细胞外基质(ecm)过多沉积(liu等人frontphysiol.，2017，8：238；tian等人expthermed2017，13(5)：1660-4)。
心脏纤维化有两种最常见的类型，即反应性间质纤维化(rif)和置换性纤维化(rf)。rif通常是由一种或多于一种进行性慢性病(例如糖尿病和高血压)诱发的，其特征是胶原蛋白(ecm类型)的弥散性沉积和间质腔体积的增加。rf发生在急性损伤后，而ecm的扩张和胶原i沉积的增加代替了死亡的心肌细胞，以防止梗塞的心肌破裂。通常，心脏纤维化增加会导致器官结构和功能扭曲，从而导致心力衰竭(mclenachan和dargie，amjhypertens1990，3(10)：735-40；krenning等人jcellphysiol2010，225(3)：631-7；mewton等人，jamcollcardiol2011，57(8)：891-903)。
在心脏纤维化的病理过程中，坏死性和凋亡性心肌细胞触发rif和rf中ecm蛋白的过度积累。因此，假设使用具有抗炎特性的巨噬细胞亚群可通过清除坏死和凋亡细胞并抑制成纤维细胞活化而具有直接的抗纤维化作用。在下面描述的这项研究中，将巨噬细胞直接注射到缺血的小鼠心脏中并监测心脏功能，以研究细胞疗法的抗纤维化潜力。
当前用于心脏纤维化的临床疗法主要依靠已建立的药理学试剂。ace抑制剂、他汀类药物和醛固酮拮抗剂是已被证明对心脏纤维化具有有益作用的药物。诸如赖诺普利之类的ace抑制剂可以使高血压患者的心脏纤维化消退，并改善lv功能。阿托伐他汀的他汀类药物治疗减少心力衰竭患者的纤维化生物标志物。螺内酯，一种醛固酮拮抗剂，可以减少心肌病中的心脏纤维化。然而，现有的治疗方法有几个主要缺点：(1)这些药物只能适度改善心脏功能；(2)更成问题的是，没有一种现有的疗法专门用于治疗心脏纤维化；(3)这些治疗针对的是病因或症状，但不能有效地抑制心肌瘢痕的形成，这使患有严重心脏纤维化的患者别无选择。靶向促纤维化途径关键成分的新化合物正在动物模型和临床前试验中进行测试，但到目前为止，结果是混杂的，临床转化非常有限。对于心脏纤维化缺乏有效的临床治疗，迫切需要使用非常规策略，如工程化巨噬细胞的细胞治疗来开发新颖的、组织特异性的有效治疗方法。
本文所述的方法适用于治疗已被诊断出患有与进行性心脏纤维化有关的疾病的个体，该个体被怀疑患有与进行性心脏纤维化有关的疾病、已知是易感人群、被认为可能发展为与进行性心脏纤维化有关的疾病、或被认为可能发展为先前治疗的与进行性心脏纤维化有关的疾病的复发者。
现有证据表明，纤维化与多种心脏病(包括与容量和压力超负荷相关的心脏病)的心力衰竭过程相关(maron等人，am.j.cardiol.，35：725-39(1975)；schwarz等人，am.j.cardiol.，42：661-69(1978)；fuster等人，circ.，55：504-08(1976)；bartosova等人，j.physiol.，200：285-95(1969)；weber等人，circ.，83：1849-65(1991)；schaper等人，basicres.cardiol.，87：s1303-s1309(1992)；boluyt等人，circ.res.，75：23-32(1994)；和bishop等人，j.mol.cellcardiol.，22：1157-65(1990))。在心力衰竭的情况下，纤维化涉及成纤维细胞数量和基质沉积的增加(morkin等人，am.j.physiol.，215：1409-13(1968)；skosey等人，circ.res.，31：145-57(1972)；和booz等人，cardiovasc.res.，30：537-43(1995))，这表明成纤维细胞在这种状况的发展中的重要性。心脏成纤维细胞也是合成间质蛋白和其他心肌成分的主要来源，这些间质蛋白和其他心肌成分由于其对舒张功能的影响，间接地对心脏心肌细胞产生影响而引起或增强收缩功能障碍，从而与心力衰竭有关(hess等人，circ.，63：360-71(1981)；villari等人，amj.cardiol.，69：927-34(1992)；villari等人，jacc，22：1477-84(1993)；brilla等人，circ.res.，69：107-15(1991)；和sabbah等人，mol.&cellbiochem.，147：29-34(1995))。
与合适的对照相比，可以通过测量指示疾病进程的一个或多于一个诊断参数来确定纤维化心脏疾病状态的治疗。为了与动物模型进行比较，“合适的对照”是未用松弛素治疗或未用松弛素的药物制剂治疗的动物。在人类对象的情况下，“合适的对照”可以是治疗前的个体，或者可以是用安慰剂治疗的人(例如，年龄匹配或类似的对照)。
用本发明的方法治疗的心脏纤维化可能是由于与心脏成纤维细胞增殖或由心脏成纤维细胞激活细胞外基质蛋白合成有关的多种疾病。这些疾病可以在本发明中有效地治疗。这些疾病包括主动脉和二尖瓣关闭不全。另外，在本发明中可以有效地治疗与许多心脏疾病相关的并且经常涉及心肌细胞和成纤维细胞成分的心脏肥大。
心力衰竭定义为心脏泵无法根据需要移动血液以满足身体组织的代谢需求。泵吸能力下降最常见的原因是心肌组织的丢失或损坏。结果，抑制了心室排空，这导致心室充盈压力和心室壁应力的增加，以及心输出量的减少。作为对心输出量减少的生理反应，许多神经内分泌反射被激活，从而引起全身性血管收缩、心脏的交感刺激和液体潴留。尽管这些反射性反应起初往往会增强心输出量，但从长远来看却是有害的。周围阻力增加的结果增加了心脏的后负荷，血容量的增加进一步增加了心室充盈压。这些变化以及对心脏的增加的交感神经刺激，导致对剩余的功能性心肌的进一步需求和经常去代偿需求。
当心脏无法充分灌注周围组织时，就会导致充血性心力衰竭，这是许多心血管疾病的常见终点。根据最近的估计，在美国大约有400万人被诊断出患有这种疾病，其中超过50％的病例在诊断后5年内死亡(taylor等人，annualreportsinmed.chem.22，85-94(1987))。
肺纤维化和肺纤维化疾病。肺纤维化疾病是一种毁灭性的慢性肺部疾病，会导致肺部瘢痕形成(纤维化)。随着时间的流逝，疤痕会变得更糟，难以深呼吸，肺部也无法吸收足够的氧气。肺功能逐渐下降，并有可能出现间歇性、不可预测的急性加重以及相关肺动脉高压的发展。有时医生可以确定纤维化的原因，但是在大多数情况下，他们不能确定。他们称这些病例为特发性肺纤维化(ipf)。
肺纤维化疾病主要影响中老年人。在美国，约有50000人患有特发性肺纤维化，每年估计有15000例新病例发生。根据美国国立卫生研究院/国家心肺和血液研究所的资料，目前尚无药物可延缓ipf的发展。泼尼松、硫唑嘌呤和n-乙酰半胱氨酸已被单独或联合用于治疗ipf。但是，专家尚未找到足够的证据来支持其使用。
共疗法
在一些实施方案中，在本申请中设想了共疗法。例如，一种治疗患有肝纤维化的个体的方法可以包括将包括基因工程化巨噬细胞的细胞治疗产品引入个体，并向个体施用有效量的α-生育酚、干扰素-γ、槲皮素、ace抑制剂和ppar-δ的一种或多于一种。
在某些情况下，治疗方法还可以包括对患者进行手术，例如通过切除全部或部分肝或肝的纤维化区域。可以在手术之前、之后和/或同时向患者施用细胞治疗产品。在某些方面，该方法可用于改善由手术引起的纤维化并协助再生。在其他方面，该方法可用于治疗或减少不能通过手术去除的纤维化区域。
多肽组合物
“多肽”是指包含通过肽键或经修饰的肽键连接的氨基酸的任何肽或蛋白质。“多肽”可以包括短链多肽，包括肽、寡肽或寡聚物，以及长链多肽，包括蛋白质。多肽可以包含20种编码基因的氨基酸以外的其他氨基酸。“多肽”包括通过自然过程如翻译后加工或通过化学修饰或本领域熟知的其他合成技术修饰的氨基酸序列。修饰可发生在多肽中的任何地方，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基末端或羧基末端。应当理解，相同类型的修饰可以相同或不同程度存在于给定多肽的几个位点上。同样，给定的多肽可以包含许多类型的修饰。修饰包括末端融合(n-和/或c-末端)、乙酰化、酰化、adp-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键的形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、gpi锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、亚硒化、硫酸化、rna介导的氨基酸向蛋白质的转化如精氨酸化和泛素化。
术语“分离的”可以指基本上不含细胞材料、细菌材料、病毒材料或它们来源的培养基(通过重组dna技术生产时)或化学前体或其他化学物质(化学合成时)的核酸或多肽。此外，分离的多肽是指可以作为分离的多肽施用至对象的多肽；换句话说，如果多肽黏附在色谱柱上或包埋在凝胶中，则不能简单地将其视为“分离的”。此外，“分离的核酸片段”或“分离的肽”是非天然作为片段存在和/或通常不处于功能状态的核酸或蛋白质片段。
术语“氨基酸”或“残基”应被理解为是指含有氨基(nh2)、羧酸基(cooh)和各种侧基中的任何一个的化合物，其基本式为nh2chrcooh，并通过肽键连接在一起形成蛋白质。氨基酸可以是例如酸性的、碱性的、芳香族的、极性的或衍生化的。非标准氨基酸可以被称为“非规范”氨基酸。氨基酸是天然存在α-和l-形式的，但是，也可以制备β-和d-形式的氨基酸。
通常使用单字母缩写系统来指定通常掺入天然存在的肽和蛋白质中的二十个“规范”氨基酸残基的身份，这些名称在本领域中是众所周知的。这样的单字母缩写词在含义上可以与三字母缩写词或非缩写的氨基酸名称完全互换。规范氨基酸及其三个字母和一个字母代码包括：丙氨酸(ala)a、谷氨酰胺(gln)q、亮氨酸(leu)l、丝氨酸(ser)s、精氨酸(arg)r、谷氨酸(glu)e、赖氨酸(lys)k、苏氨酸(thr)t、天冬酰胺(asn)n、甘氨酸(gly)g、蛋氨酸(met)m、色氨酸(trp)w、天冬氨酸(asp)d、组氨酸(his)h、苯丙氨酸(phe)f、酪氨酸(tyr)y、半胱氨酸(cys)c、异亮氨酸(ile)i、脯氨酸(pro)p和缬氨酸(val)v。
某些实施方案还包括本文所述多肽的变体。所公开的多肽的变体可以通过在多肽序列内进行氨基酸添加或插入、氨基酸缺失、氨基酸取代和/或氨基酸残基的化学衍生物来产生。本领域技术人员可以根据本文提供的指导来确定所需的氨基酸取代(无论是保守的还是非保守的)，以提高稳定性，同时保持或增强多肽的效力。在某些实施方案中，保守氨基酸取代可涵盖通常通过化学肽合成而不是通过生物系统合成掺入的非天然存在的氨基酸残基。
保守修饰可产生具有功能、物理和化学特性与进行此类修饰的肽相似的肽。相反，可以通过氨基酸序列中选择对维持(a)取代区域中分子骨架的结构例如，作为α螺旋构象、(b)靶位点上分子的电荷或疏水性或(c)分子大小的影响存在显著差异取代来实现肽的功能和/或化学特性的实质性修饰。例如，“保守氨基酸取代”可涉及用非天然残基取代天然氨基酸残基，从而对该位置上氨基酸残基的极性或电荷几乎没有影响。
重组dna和/或rna介导的蛋白质表达和蛋白质工程技术、或任何其他制备肽的方法，可用于制备本文公开的多肽或在靶细胞或组织中表达本文公开的多肽。术语“重组”应理解为是指材料(例如，核酸或多肽)已通过人为干预人工或合成(即，非天然)改变。可以在材料的自然环境或状态内或从其自然环境或状态移除的材料上执行改变。例如，“重组核酸”是通过例如在克隆、dna改组或其他众所周知的分子生物学过程中重组核酸制成的。这种分子生物学方法的实例可见于maniatis等人，molecularcloning.alaboratorymanual，coldspringharborlaboratory，coldspringharbor，n.y.，1982。“重组dna分子”由通过这种分子生物学技术连接在一起的dna片段组成。如本文所用，术语“重组蛋白”或“重组多肽”是指使用重组dna分子表达的蛋白质分子。“重组宿主细胞”是含有和/或表达重组核酸的细胞。
可以根据本领域技术人员已知的方法在转化的宿主细胞中制备多肽。简而言之，制备了编码该肽的重组dna分子或构建体。制备此类dna分子的方法是本领域众所周知的。例如，可以使用合适的限制酶从dna上切除编码肽的序列。大量可用的和众所周知的宿主细胞中的任何一种都可以用于各种实施方案的实践中。特定宿主的选择取决于许多因素，包括例如与所选表达载体的相容性、dna分子编码的多肽的毒性、转化率、多肽回收的难易程度、表达特性、生物安全性和成本。在理解并非所有宿主对于特定dna序列的表达可能均具有同等效力的前提下，应在这些因素之间取得平衡。在这些通用指南中，培养中有用的微生物宿主细胞包括细菌(例如大肠杆菌)、酵母(例如酵母菌)和其他真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物(包括人)细胞，例如cho细胞和hek293细胞。也可以在dna水平上进行修饰。可以将编码肽的dna序列改变为与所选宿主细胞更相容的密码子。对于大肠杆菌，优化的密码子是本领域已知的。密码子可以被取代以消除限制位点或包括沉默的限制位点，这可能有助于所选宿主细胞中dna的加工。接下来，培养并纯化转化的宿主。可以在常规发酵条件下培养宿主细胞，从而表达所需的多肽。另外，dna任选地在融合蛋白的编码区5′还编码可操作地连接至表达的多肽的信号肽序列(例如，分泌信号肽)。
表达和表达载体
可以将编码本文所述的任何多肽的核酸插入任何合适的表达系统或与之结合使用。重组表达可以使用载体例如质粒、病毒等完成。载体可以包括与编码一种或多于一种多肽的核酸可操作连接的启动子。载体还可以包括转录和翻译所需的其他元件。如本文所用，载体是指含有外源dna的任何载体。因此，载体是在不降解的情况下将外源核酸转运到细胞中的试剂，并且包括在核酸递送至的细胞中产生核酸的表达的启动子。载体包括但不限于质粒、病毒核酸、病毒、噬菌体核酸、噬菌体、黏粒和人工染色体。可以产生适合携带、编码和/或表达编码蛋白酶的核酸的多种原核和真核表达载体。这样的表达载体包括例如pet、pet3d、pcr2.1、pbad，puc和酵母载体。载体可以例如在多种体内和体外情况下使用。载体可以是基因治疗载体，例如腺病毒载体、慢病毒载体或crisp-r载体。
表达盒、表达载体以及该盒或载体中的序列可以是异源的。如本文所用，当用于表达盒、表达载体、调节序列、启动子或核酸时，术语“异源”是指已经以某种方式操纵的表达盒、表达载体、调节序列或核酸。例如，异源启动子可以是不与待表达的核酸天然连接的启动子，或者是已经通过细胞转化程序引入细胞的启动子。异源核酸或启动子还包括生物体天然的但已以某种方式(例如，置于不同的染色体位置、突变、以多拷贝添加、与非天然启动子或增强子序列连接等)改变的核酸或启动子。异源核酸可包含包含cdna的序列。可以将异源编码区域与内源编码区域区分开，例如，当异源编码区域与核苷酸序列连接，这些核苷酸序列中包含的调控元件如启动子并没有与编码区域天然连接时，或当异源编码区域与自然界中未发现的染色体部分连接时(例如，在基因座中表达的基因，其中编码区域所编码的蛋白质未正常表达)。类似地，异源启动子可以是与自然中不连接的编码区域连接的启动子。
可以使用的病毒载体包括与慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、aids病毒、神经营养性病毒、辛德比斯病毒和其他病毒有关的那些。共享这些病毒特性的任何病毒家族也有用，这使其适合用作载体。可以使用的逆转录病毒载体包括verma，i.m.，retroviralvectorsforgenetransfer.inmicrobiology-1985，americansocietyformicrobiology，第229-232页，washington，(1985)中描述的那些。例如，此类逆转录病毒载体可包括鼠马洛尼白血病病毒、mmlv和其他表达所需特性的逆转录病毒。通常，病毒载体包含非结构早期基因、结构晚期基因、rna聚合酶iii转录物、复制和衣壳化所必需的反向末端重复序列以及控制病毒基因组转录和复制的启动子。当工程化为载体时，病毒通常去除一个或多于一个早期基因，并且将基因或基因/启动子盒代替去除的病毒核酸插入病毒基因组中。
表达盒和/或表达载体可以包括多种调控元件，包括启动子、增强子、翻译起始序列、转录终止序列和其他元件。“启动子”通常是当相对于转录起始位点处于相对固定的位置时起作用的dna序列。例如，启动子可以在编码蛋白酶的核酸区段的上游。“启动子”包含rna聚合酶和转录因子的基本相互作用所需的核心元件，并且可以包含上游元件和响应元件。“增强子”通常是指在距转录起始位点不固定距离的范围内起作用的dna序列，其可以在转录单元的5′或3′。此外，增强子可以在内含子内以及编码序列本身内。它们的长度通常为10个至300个核苷酸，并且顺式起作用。增强子的功能是增加附近启动子的转录。像启动子一样，增强子也通常包含介导转录调控的反应元件。增强子通常决定表达的调节。
真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或有核细胞)中使用的表达载体还可以包含终止转录所必需的序列，该序列可能影响mrna的表达。这些区域在编码组织因子蛋白的mrna的未翻译部分转录为聚腺苷酸化片段。3′非翻译区还包括转录终止位点。优选地，转录单元还包含聚腺苷酸化区域。该区域的一个好处是，它增加了转录单位像mrna一样被加工和运输的可能性。在表达构建体中多腺苷酸化信号的鉴定和使用已被很好地建立。优选在表达构建体中使用同源的聚腺苷酸化信号。
来自表达盒或表达载体的一种或多于一种蛋白酶的表达可以由能够在原核细胞或真核细胞中表达的任何启动子控制。可以使用的原核启动子的实例包括但不限于sp6、t7、t5、tac、bla、trp、gal、lac或麦芽糖启动子。可以使用的真核启动子的实例包括但不限于组成型启动子，例如病毒启动子，例如cmv、sv40和rsv启动子，以及可调节启动子，例如，可诱导的或可抑制的启动子，例如tet启动子、hsp70启动子和受cre调节的合成启动子。用于细菌表达的载体包括pgex-5x-3，而用于真核表达的载体包括pcineo-cmv。
表达盒或载体可以包括编码标记产物的核酸序列。该标记产物用于确定基因是否已经被递送至细胞并且一旦被递送就被表达。优选的标记基因是大肠杆菌lacz基因，其编码β-半乳糖苷酶和绿色荧光蛋白。在一些实施方案中，标记可以是可选择标记。当这样的可选择标记成功地转移到宿主细胞中时，如果置于选择压力下，转化的宿主细胞可以存活。有两种广泛使用的不同类别的选择制度。第一类基于细胞的新陈代谢和突变细胞系的使用，该突变细胞系缺乏独立于补充培养基生长的能力。第二类是显性选择，其是指在任何细胞类型中使用的选择方案，并且不需要使用突变细胞系。这些方案通常使用药物来阻止宿主细胞的生长。具有新基因的那些细胞将表达传递抗药性的蛋白质，并在选择中存活下来。这样的显性选择的实例使用药物新霉素(southernandberg，molec.appl.genet.1：327(1982))、霉酚酸(mulliganandberg，science209：1422(1980))或潮霉素(sugdenetal.，mol.cell.biol.5：410-13(1985))。
可以使用包括但不限于质粒、病毒载体、病毒核酸、噬菌体核酸、噬菌体、黏粒和人工染色体的遗传物质的直接转移或通过遗传物质在细胞或例如阳离子脂质体或病毒的载体中的转移获得基因转移。这样的方法在本领域中是众所周知的，并且容易适用于本文所述的方法。转移载体可以是用于将基因递送到细胞(例如质粒)中的任何核苷酸构建体，或作为递送基因的一般策略的一部分(例如作为重组逆转录病毒或腺病毒的一部分)(ram等人cancerres.53：83-88，(1993))。用于转染的适当手段包括病毒载体、化学转染子或物理机械方法，例如dna的电穿孔和直接扩散，由例如wolff等人，science，247，1465-1468，(1990)；和wolff，nature，352，815-818，(1991)描述。
例如，可以通过任何方法将核酸分子、表达盒和/或编码蛋白酶的载体引入细胞，所述方法包括但不限于钙介导的转化、电穿孔、显微注射、脂质转染、粒子轰击等。可以在培养中扩增细胞，然后将其施用于对象，例如哺乳动物，例如人。所施用的细胞的数量或数目可以变化，但是可以使用约106个至约109个细胞的数量。细胞通常在生理溶液如盐水或缓冲盐水中递送。细胞也可以在诸如脂质体、外排体或微泡的载体中递送。
实施例
以下实施例说明了本发明的具体实施方案及其各种用途。提出它们仅出于解释目的，而不应视为限制本发明。
实施例1
减少肝硬化动物模型中的肝纤维化
在该实施例中，m2特异性巨噬细胞用于治疗肝硬化的动物模型，以证明巨噬细胞逆转肝纤维化的能力。
动物：从杰克逊实验室购买了六周龄至八周龄的雄性c57bj/6小鼠，并在无特定病原体条件下饲养在芝加哥大学动物核心设施中。在12小时的明暗循环中，动物食用标准的无菌饮食和过滤水。实验规程得到了芝加哥大学动物护理和使用委员会以及伦理委员会的批准。
诱发肝硬化。以0.1ml/10g体重的剂量向小鼠腹膜内注射含20％ccl4的玉米油持续6周至8周，以诱导肝硬化。
处理。将镇静的小鼠仰卧放置，腹部暴露并消毒。术前以0.1mg/kg的剂量皮下施用丁丙诺啡。从隔膜下方开始沿中线切开一个1.5cm的切口，通过外科手术暴露门静脉而不损坏肠道、肝或隔膜，在100μlpbs中收集3.0x106个m2特异性巨噬细胞并缓慢注入流向肝肿块方向的门静脉。使用尼龙缝线闭合切口。沿切口部位注射一百微升布比卡因(5mg/ml)，以进行局部疼痛处理。皮下注射半毫升无菌盐水以进行水合作用。每12小时重新施用丁丙诺啡长达72小时。
超声波扫描。在ccl4处理后第10周，将镇静小鼠置于仰卧位，除去腹部毛发。由于超声波探头与小鼠体型不成比例，因此仅进行了从左侧叶的外缘到最右侧叶的外缘的纵向扫描，以获取肝组织纹理反射的图像。纤维化组织给出了相对较强的回声信号。
组织学。在对处理过的小鼠进行超声肝扫描后，收集肝叶并固定在10％福尔马林中进行组织学检查。对固定的肝组织样品进行三色和苏木精和曙红染色。苏木精和曙红染色用于一般病理评估，三色染色突出显示胶原蛋白纤维。每组的组织学评估均采用hai-knodell评分系统进行，hai-knodell评分系统是病理学家根据肝实质损害、炎症和纤维化病变评估急性和慢性肝病的最公认的数字评分系统之一。如表1所示，检查了所有列出的肝病理表现方面，并用各种权重评分。每个样品的总分以半定量方式表明肝损伤的严重程度和治疗效果。
这项研究的结果表明，在肝硬化的小鼠模型中，m2特异性巨噬细胞可显著逆转已建立的肝纤维化。从图1可以看出，基于超声扫描，肝纤维化明显减少。用m2特异性巨噬细胞治疗肝硬化小鼠可明显减少炎症和纤维化病变(参见并比较图2b和图2a)。肝纤维化的逆转通过图3b所示的治疗小鼠中肝纤维化病变的数量和尺寸的显著减少而进一步突出。
此外，基于先前报道的指数采用组织学指数(参见knodellrg等人hepatology1981，1(5)：431-5)。表1中所示的组织学评估结果强烈表明巨噬细胞的门静脉递送通过减少纤维化显著逆转了肝损伤。
表1组织学指数(hai-knodell评分)
通过将m2特异性巨噬细胞递送到受损的肝中，开发了一种新的治疗方法，该方法可增强肝纤维化组织的分解并诱导肝中功能性肝细胞的再生。通过门静脉注射m2巨噬细胞，可以通过产生各种抗炎细胞因子来关闭炎性反应，并在伤口愈合和组织修复中起作用，使用公认的四氯化碳施用模型可观察到明显的减轻肝纤维化的作用。这项研究的结果表明，与其他巨噬细胞类型相比，向患有肝硬化的肝组织施用m2特异性巨噬细胞可以逆转患病个体的肝纤维化。
实施例2
基因工程化的巨噬细胞
构建基因工程化的m2特异性巨噬细胞以增强其逆转纤维化的能力。
为了进一步提高实施例1中所示方法的功效，通过胶原靶向剂或胶原受体例如itga-1的外源表达来增强m2特异性巨噬细胞。否则，正常的m2特异性巨噬细胞无法附着或归巢于纤维化组织中富含胶原蛋白的环境，itga-1或其他胶原蛋白靶向剂的表达可能会大大增强细胞对纤维化组织的保留，并增加该方法的特异性和安全性。此外，m2特异性巨噬细胞中胶原酶(mmp1)的表达提高了工程化m2细胞降解周围异常胶原基质并增强组织再生的能力。mmp1a不存在于未修饰的m2细胞中，它是体内降解胶原蛋白的主要酶。
基因构建体。组装慢病毒构建体以表达整联蛋白a1(seqidno：1或seqidno：2，图4a)或mmp1(seqidno：3或seqidno：4，图4b)。每个载体编码由cmv启动子驱动的整联蛋白a1或mmp1(或mmp1a)以及由组成型启动子ubic(泛素c启动子)驱动的选择标记(荧光蛋白tdtomato和嘌呤霉素抗性基因，puro)。tdtomato和puro被可自我切割的肽t2a隔开。
巨噬细胞。用一种或两种慢病毒构建体转染m2特异性巨噬细胞，并选择其用于表达载体的掺入和重组基因的表达。
可以考虑将表达整联蛋白a1、mmp1或mmp1a或整联蛋白a1和mmp1或mmp1a两者的重组m2特异性重组巨噬细胞引入个体，作为治疗肝纤维化和其他纤维化疾病的新方法。引入之后，表达整联蛋白a1的m2特异性巨噬细胞则以更大的特异性定位于纤维化病变，并且由于整联蛋白a1的表达而比其他组织保留更长的时间。表达mmp1或mmp1a的重组m2特异性巨噬细胞比非重组m2特异性巨噬细胞以更大的速度减少纤维化病变。表达整联蛋白a1和mmp1的m2特异性巨噬细胞比单重组m2特异性巨噬细胞表现出更大的纤维化病变清除率，并且比非重组的m2特异性巨噬细胞表现的更大。这种重组的m2特异性巨噬细胞可用作治疗纤维化疾病的细胞治疗产品。
已经参考特定方面和/或其实施方案详细描述了本发明，显然，在不脱离所附权利要求书所限定的本发明范围的情况下，可以进行修改和变化。更具体地，尽管本发明的某些方面在本文中可以被认为是特别有利的，但是可以预期的是，本发明不限于本发明的这些特定方面。
实施例3
减少动物模型中的心脏纤维化
在该实施例中，m2特异性巨噬细胞用于治疗心脏纤维化的动物模型，以证明巨噬细胞改善心脏纤维化的能力。
动物：12周龄的雄性c57/bl6小鼠。
心肌梗塞(mi)：如前所述(19)，使用7-0缝线永久性结扎左前降支(lad)冠状动脉后，通过开胸手术诱导mi。
工程化巨噬细胞植入：结扎后立即用28号注射器将5x105骨髓来源的m0巨噬细胞(21)通过0.1mlpbs直接注射到梗塞部位的边缘区域。梗塞部位通过左心室变白来识别。对照组仅注射pbs。
超声心动图：超声心动图是在术后7天、14天和21天使用visualsonicvevo770高分辨率超声系统进行的。使用vevo770系统中预装的软件记录m模式并计算超声心动图参数。
组织收集：手术后21天处死小鼠。测量心脏重量和胫骨长度。
研究工程化巨噬细胞在心脏纤维化治疗中的作用涉及5个步骤：(i)使用lad生成鼠心肌梗塞(mi)诱导的心脏纤维化模型；(ii)将骨髓单核细胞分化为m0巨噬细胞；(iii)将产生的巨噬细胞现场注射到梗塞心肌的边界区；(iv)通过测量以下参数，使用超声心动图评估以下心脏功能：(a)射血分数(ef)-对于左心室收缩功能，(b)对于左心室舒张功能测量短轴缩短率(fs)，(c)对于左心室大小测量舒张末期的左心室内部尺寸(lvid；d)，(d)对于左心室尺寸和心肌重塑测量收缩末期左心室内部尺寸(lvid；s)；(v)通过测量心脏重量检查肥大/心肌重塑。
数据显示，工程化巨噬细胞成功改善了患有心肌梗塞(mi)的小鼠的心脏性能，表明工程化巨噬细胞在治疗mi诱发的心脏纤维化和心力衰竭中具有心脏保护作用。这项研究表明，工程化巨噬细胞疗法比现有疗法具有多种优势：(1)有效抑制心脏纤维化的发展，这是由心脏功能改善所证明的；(2)通过直接和局部递送方法开发新的组织特异性策略；和(3)避免由现有药理试剂引起的副作用。
图5显示工程化巨噬细胞的植入部分地预防了mi引起的左心室收缩功能障碍。在接受pbs注射的mi小鼠中，射血分数(ef)和短轴缩短率(fs)明显恶化，表明由lad手术引起的收缩功能损伤/心力衰竭；接受工程化巨噬细胞的小鼠的射血分数(ef)和短轴缩短率(fs)高于接受pbs的小鼠，显示了工程化巨噬细胞对mi后心脏的心脏保护作用。射血分数(ef)和短轴缩短率(fs)是两个关键参数，用于测量每次心跳时从充盈的心室抽出的血液百分比。ef和fs降低表示左心室失去了分配足够的血流以满足身体需要的能力，这种症状在临床上被定义为“收缩功能障碍”，最终会导致心力衰竭，而没有有效的干预。
图6显示了使用工程化巨噬细胞的细胞疗法可预防mi诱导的lv扩张。在pbs组中，对lad进行手术结扎后，观察到lv室尺寸增大。工程化巨噬细胞的植入阻止了心肌梗死引起的左室扩张。lvid；d和lvid；s是用于在心脏跳动周期的舒张末期或收缩末期测量左心室内部尺寸的参数。这两个参数的增加表明由病理性心肌重构引起的扩张型心脏中左心室增大。
图7显示了使用工程化巨噬细胞的细胞疗法可预防缺血性心肌重塑。pbs组心肌梗塞引起心肌重塑，这通过心体重的增加来证明。工程化巨噬细胞组的心脏重量降低表明细胞疗法使重塑进程退步。在重塑过程中，随着心脏质量的增加，“心脏重量/体重”或“心脏重量/胫骨长度”的测量都可作为心脏纤维化引起的肥大的标志。
图8显示了使用工程化巨噬细胞的细胞疗法可预防tac诱发的lv舒张功能障碍。在pbs组中，通过手术限制主动脉后，观察到e/a增加。工程化巨噬细胞的植入可防止lv引起tac引起的舒张功能障碍。e/a是用于通过测量二尖瓣环运动比的峰值速度来评估左心室舒张功能的关键参数。该参数的增加表明纤维化引起的舒张功能障碍。
在这项研究中，工程化巨噬细胞在治疗心脏纤维化方面的有效性已得到验证，使这种治疗方法成为竞争性候选药物，可能在临床应用中具有巨大潜力。动物实验结果证明了工程化巨噬细胞用于治疗心脏纤维化的原理。
实施例4
减少动物模型中的肺纤维化
在该实施例中，m2特异性巨噬细胞用于治疗肺纤维化的动物模型，以证明巨噬细胞改善肺纤维化的能力。
博来霉素(blm)诱导的小鼠ipf模型。blm诱导的肺纤维化模型代表了最常用的实验模型。blm是一种已被确定为促纤维化药物的化学治疗性抗生素，在这种情况下淋巴瘤患者静脉注射blm后出现肺纤维化。博来霉素可能导致人类肺纤维化的认识导致其在实验模型中的应用，并且四十年来它一直是实验肺纤维化最常用的模型。据信blm通过在肿瘤细胞中引起单链和双链dna断裂并由此中断导致凋亡的细胞周期而起作用。
动物：10周龄的雄性c57/bl6小鼠。
产生鼠肺纤维化模型：使用异氟烷吸入麻醉小鼠，然后通过气管内递送以3u/kg的剂量暴露于博来霉素(blm)。对照组改为施用pbs。
巨噬细胞的分离和培养：分离小鼠骨髓单核细胞，然后使其分化为m0巨噬细胞。
工程化巨噬细胞植入：在blm暴露7天后，通过尾静脉直接用1ml胰岛素注射器注射0.1mlpbs中5x106个骨髓衍生的m0巨噬细胞。对照组仅注射pbs。
组织收集和组织学分析：blm暴露后14天处死小鼠。气管内滴注10％中性福尔马林固定肺组织2h，然后取出并连续固定24h。然后将组织用石蜡包埋并进行h&e染色。
组织学分析表明，巨噬细胞的植入减少了blm诱导的肺纤维化和炎症，并部分保留了肺泡的结构。
在这项研究中，通过气管内注射博来霉素(blm)建立了小鼠肺纤维化模型。最初接触blm14天后，肺组织受到炎症反应的影响，并严重破坏了肺泡的基本结构。
通过尾静脉注射的巨噬细胞治疗减少了受到blm攻击的小鼠的纤维化和肺部炎症程度。我们的数据表明巨噬细胞的治疗构成治疗纤维化性肺疾病的有效细胞载体，并提出了一种新颖的治疗方法。巨噬细胞植入对小鼠blm诱导的肺损伤的影响如图9所示。在pbs/blm暴露14天后，从c57bl6小鼠的肺制备的组织切片上进行h&e染色。图9a显示了暴露于pbs并注射了pbs的对照小鼠的组织学。图9b显示了纤维化组中暴露于blm然后注射pbs的小鼠的组织学。图9c显示了治疗组中暴露于blm然后注射巨噬细胞的小鼠的组织学。
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