一种固态发酵烟梗梗丝的方法及其应用与流程

本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种固态发酵烟梗梗丝的方法及其应用。

背景技术：

我国作为烟草大国，烟草的种植面积和产量均居世界首位，大量的烟梗也由此产生。目前处理烟梗的方法主要包括物理爆破法、化学处理法、生物酶法，存在降解效果差、化学试剂污染、费用昂贵等缺点。目前有报道用短小芽孢杆菌v35制成菌剂用于梗丝处理，只是针对纤维素和果胶进行降解，其细胞壁成分木质素没有被降解，因此其细胞壁物质降解效果不明显。目前烟梗利用率较低，而其大量积压既会造成环境污染，也会造成可利用资源的浪费。

烟梗的主要成分是细胞壁物质(果胶、纤维素、木质素和半纤维素)，约占烟梗的43％左右，此外还有水溶性糖类、淀粉、蛋白质、烟碱和茄尼醇等。与烟叶相比，烟梗中化学成分的组成特征是总糖(即水溶性糖)、总氮和烟碱含量一般较低，细胞壁物质含量较高。目前认为细胞壁物质是影响烟草内在品质和风味的不利因素，该类物质在热解作用下会产生较多的低级醛类，在燃吸时会产生刺激性的呛咳等。

食药用真菌拟青霉菌可以高效利用纤维素、木质素等物质的腐生生物，同时合成多糖类、三萜类、腺苷类、生物碱等活性物质，并且拟青霉分泌的各种酶类含量很高，并具有特有的香味。

技术实现要素：

本发明的目的是针对烟梗利用率低的问题，提供一种固态发酵烟梗梗丝的方法及其应用，以降解烟梗梗丝中影响风味的不利物质，增加其香气成分，提高烟梗在卷烟中的利用率。

本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种固态发酵烟梗梗丝的方法，包括以下步骤：

(1)斜面菌种培养：将拟青霉菌种接种到斜面培养基上培养，获得斜面菌种；

(2)液体种子培养：将步骤(1)获得的所述斜面菌种接种到种子培养基中培养，获得液体种子；

(3)拟青霉发酵液培养：将步骤(2)获得的液体种子接种到拟青霉发酵培养基中发酵，得到拟青霉发酵液；

(4)固态发酵培养：将步骤(3)获得的拟青霉发酵液接种到固态发酵培养基中，在温度为22-32℃条件下培养6-10天。

优选的，斜面菌种培养条件为：在28-32℃温度条件下培养，至菌丝体长满斜面。

优选的，液体种子培养和拟青霉发酵液培养的条件均为：在温度为28-32℃，摇床转速120-180rpm的条件下培养5-7天。

优选的，按照1-5％的体积百分比接种量将液体种子接种于拟青霉发酵培养基中。

优选的，拟青霉发酵液的接种量为10-40％体积质量比。

优选的，所述斜面培养基为土豆培养基，含有：土豆200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，所述种子培养基含有：土豆200g/l，葡萄糖20g/l。

优选的，所述拟青霉发酵培养基含有：葡萄糖20g/l，酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，mgso4·7h2o1g/l，kh2po41g/l，vb0.1g/l。

优选的，所述固态发酵培养基为100％的烟梗梗丝。

优选的，所述拟青霉菌种购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，保藏号为cctccm209240。

第二方面，本发明提供了一种固态发酵烟梗梗丝的方法在烟梗处理中的应用。

本发明的有益效果如下：

1、本发明的烟梗烟丝经过拟青霉菌种的固态发酵和微生物转化，其中细胞壁物质纤维素、半纤维素、木质素和果胶被分解利用，还原糖含量可增加34.49％，总糖可增加30.99％，有效提高了卷烟中烟梗的利用率。

2、通过本发明的方法，不仅降解了烟梗梗丝中影响风味的不利物质，还增加了烟梗梗丝的香气成分。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明不以任何形式受限于实施例内容。

在本申请的所有具体实施例中，斜面培养基、种子培养基、拟青霉发酵培养基、固态发酵培养基按照以下方法制备：

(1)斜面培养基，即土豆培养基(pda培养基)：土豆200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，ph自然，121℃灭菌20分钟。

(2)种子培养基：葡萄糖20g/l、土豆200g/l，ph自然，121℃灭菌20分钟。

(3)拟青霉发酵培养基：葡萄糖20g/l、酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、mgso4·7h2o1g/l、kh2po41g/l、vb0.1g/l，ph自然，121℃灭菌20分钟。

(4)固态发酵培养基：烟梗梗丝100％，ph自然，121℃灭菌20分钟。

在本申请的所有具体实施例中，纤维素的测定、半纤维素的测定、木质素的测定、果胶的测定、还原糖和总糖的测定按照以下测定方法进行测定：

(1)纤维素的测定方法

标准曲线绘制：

取10ml比色管6支，分别放入0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00ml纤维素标准液，再分别加入蒸馏水2.00、1.60、1.20、0.80、0.40、0ml，摇匀，则每管纤维素含量依次为0、40、80、120、160、200μg。向每管加2％蒽酮0.5ml，再沿管壁加浓h2so45ml，上塞，摇匀，沸水浴中加热5min，静置冷却，然后在620nm波长下，求测不同含量纤维素溶液的吸光度。

发酵结束后固体培养物(含烟梗梗丝和拟青霉菌菌丝体)自然风干，粉碎，过60目筛。称取约0.3g样品，加入1ml80％乙醇，室温快速匀浆，90℃水浴20min，冷却至室温，6000g25℃离心10min，弃上清。沉淀加入1.5ml80％乙醇和丙酮各洗一遍(漩涡振荡2min左右，6000g25℃离心10min，弃上清即可)，沉淀即为粗细胞壁，将沉淀干燥，称取0.2g样品于烧杯中，置于冷水浴，加入50％h2so460ml，40min后转入100ml容量瓶中，并用50％h2so4定容至刻度，摇匀后静置。取上清液10ml，放入100ml容量瓶中，在冷水浴上加蒸馏水稀释至刻度，摇匀后取2ml溶液于比色管中，加入2％蒽酮0.5ml，并沿管壁加浓h2so45ml，上塞，摇匀，沸水浴中加热5min，静置冷却，然后在620nm波长下，求测吸光度，并根据回归方程计算出烟梗样品中纤维素的含量。

(2)半纤维素的测定方法

制作标准曲线：取25ml比色管8支，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml葡萄糖标准溶液(1.0mg/ml)，加蒸馏水2ml，再各加1.5mldns，摇匀，沸水浴10min，冷却后定容至25ml，在540nm波长下，用分光光计测定吸光度。

称取0.20g样品于100ml烧杯中，加10ml60％ca(no3)2，加热10min，稀释过滤，用蒸馏水洗滤渣3次后置于烘箱，70℃烘干，再转入250ml三角烧瓶中，加入10ml2mol/l的hcl后沸水浴50min，冷却后过滤，用蒸馏水洗滤渣3次，留取滤液和洗涤液混匀，取0.5ml滤液加dns溶液1.5ml，沸水浴10min，冷却后定容至25ml，于540nm波长下测定吸光度，再根据回归方程计算出烟梗样品中的半纤维素含量。

(3)木质素的测定方法

准确称取经过粉碎的样品粉末6.0mg，置于25ml试管中，加入25％乙酰溴一乙酸溶液(v/v)5ml和高氯酸0.2ml，将试管管口用封口膜封住，于80℃恒温水浴40min，将样液全部转移到装有10ml2mol/lnaoh和25ml冰乙酸混合液的容量瓶内，充分振荡混匀后用冰乙酸定容至100ml。以冰乙酸为空白溶液，用紫外分光光度计在280nm处，测定吸光值。

(4)果胶测定方法

标准曲线的制作：准确称取半乳糖醛酸0.0991g，用蒸馏水溶解后定容于100ml容量瓶中，分别移取此液0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0ml于6个100ml容量瓶中，加蒸馏水定容，得标准稀释液。分别移取标准稀释液1.0ml于6支试管中，加6ml浓h2so4，摇匀，在85℃水浴中加热15min，取出冷却，加入0.15％咔唑无水乙醇溶液0.2ml，摇匀，在室温下暗处放置，在530nm波长下显色2h，用lcm比色皿，以空白试剂做参比，测定吸光度(a)，绘制吸光度—浓度标准曲线。

称取5g(精确到0.001g)样品于烧杯中，加入热的70％乙醇，充分搅拌以提取糖类，过滤，反复操作至滤液不呈糖的反应。残渣用99％乙醇洗涤，再用乙醚洗涤，风干乙醚。用150ml加热至沸的0.05mol/lhcl溶液把漏斗中残渣移入250ml锥形瓶中，装上冷凝器，于沸水浴中加热回流1h，冷却后移入250ml容量瓶中，加甲基红指示剂2滴，加0.5mol/lnaoh中和后，定容，摇匀，过滤，收集滤液即得总果胶提取液。取果胶提取液，用水稀释到适当浓度(含半乳糖醛酸10～70μg/l)。取1ml稀释液于试管中，按制作标准曲线的方法操作，测定吸光度并从标准曲线上查出半乳糖醛酸浓度。

(5)还原糖、总糖测定方法

标准曲线的制作：将分析纯葡萄糖在80℃下烘干至恒重，精确称取500mg，加少量蒸馏水溶解，移入100ml容量瓶中并定容、摇匀，即为5mg/ml葡萄糖标准液。分别量取5mg/ml葡萄糖标准溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml，置于具塞25ml试管中，吸取蒸馏水分别补充至2.0ml，再各加2.0mldns试剂。盖上塞子，置于沸水浴中加热6min，取出，用流动冷水冷却后用蒸馏水定容到刻度25ml，充分摇匀，静置10min后，在紫外可见分光光度计上于540nm波长下，以空白(即量取标准溶液0ml)为参比液，测其吸光度。经回归统计求出其回归方程。

称取磨碎后的样品(过80目筛)100mg于100ml大试管中，加入10ml80％乙醇，浸泡过夜，次日加入热蒸馏水10ml，并在80℃水浴中加热0.5h，过滤于100ml容量瓶中，并用热蒸馏水反复冲洗滤渣，定容，即为还原糖待测液。吸取上述还原糖待测液25ml于250ml三角瓶中，并加入1:3(浓盐酸与蒸馏水体积比)的盐酸溶液7ml，置于沸水浴中酸化0.5h，加1～2滴甲基红指示剂，用10％naoh调至中性或偏碱性(ph＝7.0～7.5)，转移到100ml容量瓶并定容。即为水溶性总糖待测液。取还原糖待测液2.00ml，水溶性总糖待测液2.00ml，加入3,5-二硝基水杨酸显色剂2.00ml，按标准液的处理方法测定吸光度，然后从标准曲线上查出对应的浓度并计算还原糖、总糖含量。

纤维素、半纤维素、木质素的含量均按样本质量计算，单位mg/g干重。还原糖和总糖的含量均为每克干物质所含还原糖和总糖的量，即质量百分比，其他如无特殊说明，均为本领域常用方法。

实施例1

(1)斜面菌种培养：将拟青霉菌种接种到斜面培养基(即pda培养基)上，在30℃环境下培养大约7天时间，至菌丝体长满斜面；

(2)液体种子培养：将斜面菌种接种到装有80ml种子培养基的250ml的三角瓶中，在摇床转速150转/分钟，30℃条件下培养7天；

(3)拟青霉发酵液培养：将液体种子用玻璃珠和磁力转子打散后，按照4％的体积百分比接种量将液体种子接种到装有80ml拟青霉发酵培养基的250ml的三角瓶中，在摇床转速150转/分钟，30℃条件下培养7天；

(4)固态发酵培养：将培养好的拟青霉发酵液打散混匀后，取培养好的拟青霉发酵液按10％(v/m)的接种量接种至装有烟梗梗丝的固态发酵培养基的500ml的三角瓶中，30℃条件下培养6天，分别在培养2天、4天、6天时测定烟梗梗丝纤维素降解率、半纤维素降解率、木质素降解率、果胶降解率、还原糖增加率、总糖含量增加率。发酵前，烟梗梗丝中纤维素、半纤维素、木质素、果胶、还原糖、总糖的含量分别为585.4mg/g、167.18mg/g、96mg/g、66.40mg/g、17.25％、18.36％。

其中，拟青霉菌种购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，保藏号为cctccm209240。

试验结果：发酵2天、4天、6天后烟梗梗丝各成分变化见表1，其中发酵6天后测得纤维素降解率为18.44％，半纤维素降解率为41.43％，木质素降解率为13.15％，果胶降解率12.14％，还原糖增加率25.2％，总糖含量增加率27.6％。

表1：

实施例2

拟青霉发酵液接种量为20％(v/m)，其他条件同实施例1。

试验结果：发酵2天、4天、6天后烟梗梗丝各成分变化见表2，其中发酵6天后测得纤维素降解率13.75％，半纤维素降解率14.77％，木质素降解率11.37％，果胶降解率15.12％，还原糖含量增加率34.49％，总糖增加率30.99％。

表2：

实施例3

拟青霉发酵液接种量为30％(v/m)，其他条件同实施例1。

试验结果：发酵2天、4天、6天后烟梗梗丝各成分变化见表3，其中发酵6天后测得纤维素降解率6.62％，半纤维素降解率18.47％，木质素降解率18.63％，果胶降解率14.87％，还原糖含量增加率13.97％，总糖含量增加率10.35％。

表3：

实施例4

拟青霉发酵液接种量为40％(v/m)，其他条件同实施例1。

试验结果：发酵2天、4天、6天后烟梗梗丝各成分变化见表4，其中发酵6天后测得纤维素降解率3.58％，半纤维素降解率29.03％，木质素降解率26.96％，果胶降解率18.58％，还原糖含量增加率13.80％，总糖含量增加率9.20％。

表4：

通过以上实施例，可以得出本发明的方法可以有效降低烟梗梗丝中的纤维素、半纤维素、木质素、果胶的含量，减小影响烟梗梗丝内在品质和风味的不利因素，提高了在燃吸时的感官质量。

目前虽然液态发酵对烟梗梗丝降解效果要略好于固态发酵对烟梗梗丝的降解，但是液态发酵水分含量太多，其糖分含量还有香味物质成分会部分溶于液体中，造成一定量的损失。固态发酵不仅可以降解梗丝细胞壁成分，而且其还原糖和总糖以及香味成分都有所增加，所以总体效果要优于液态发酵。

尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，上述实施例仅为本发明较佳的实施方式，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。

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