甲氧基去甲肾上腺素衍生物、免疫原、特异性抗体及其制备方法与应用与流程

2021-02-02 22:02:19|

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本发明涉及一种甲氧基去甲肾上腺素衍生物、免疫原、抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体及其制备方法与应用，属于生物医学检测
技术领域：
。
背景技术：
：甲氧基去甲肾上腺素（normetanephrine，nmn）即3-甲氧基去甲肾上腺素，主要为去甲肾上腺素的中间代谢产物。儿茶酚胺（catecholamine，ca）为肾上腺髓质、肾上腺神经元及肾上腺外嗜铬体分泌的激素，主要包括肾上腺素（epinephrine，e）和去甲肾上腺素(norepinephrine，ne)等。肾上腺素主要通过肾上腺髓质和嗜铬细胞在儿茶酚-o-甲基转移酶（catechol-omethyltransferase，comt）作用下转化为甲氧基肾上腺素（metanephrine，mn），去甲肾上腺素主要通过神经元以外的组织和嗜铬细胞在comt作用下转化为甲氧基去甲肾上腺素。尿液中甲氧基去甲肾上腺素的测定可间接反映体内儿茶酚胺的分泌，常与尿甲氧基肾上腺素联合检测，对肾上腺疾病的诊断有着重要的临床意义。尿mn和nmn的检测仅与临床用药和特定饮食有关，而血mn和nmn检测易受噪音、咖啡因、吸烟和某些食物等因素的影响，因此尿mn和nmn检测更准确。有文献指出，24h尿mn、nmn诊断肾上腺髓质功能亢进，被认为是目前最为可靠的检查。尿nmn的检测具有重要的临床意义：（1）可用于继发性高血压的诊断。（2）可以作为评价2型糖尿病患者血糖控制情况的指标。（3）可用于肾上腺髓质增生症的定性诊断。（4）可用于甲状腺功能亢进症、甲状腺功能减退症、急慢性肝炎、肝硬化、慢性肾功能不全等疾病的诊断。检测方法较多，主要包括：比色法、放射免疫分析法（ria）、高效液相色谱法（hplc）、液相串联质谱法(lc-ms/ms)、酶联免疫吸附测定法(elisa)、免疫比浊法等。比色法检测的是儿茶酚胺类和甲氧基去甲肾上腺素类物质的总和而非单一化合物水平；放射免疫分析法（ria）稳定性较差，且存在放射线辐射和污染等问题；高效液相色谱法（hplc）前处理复杂，要求目标分析物在色谱上被完全分离，因此分析时间较长；液相串联质谱法(lc-ms/ms)检测灵敏度高，快速，但结构复杂，维护成本高，需经过专门培训的技术人员操作，不易在基层医疗机构普及。酶联免疫吸附测定法(elisa)灵敏度高，特异性好，但检测时间长，准确度差，难以用于批量检测。因此，目前市面上缺乏线性范围宽、灵敏度高、准确度高、精密度高，检测时间短，样品处理简单，仪器自动化程度高，可多样本连续检测的甲氧基去甲肾上腺素检测产品。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种甲氧基去甲肾上腺素衍生物，该衍生物为新合成的化合物，自然界中不存在。本发明的第一个目的采用以下技术方案实现：一种甲氧基去甲肾上腺素衍生物，其结构式如式ⅰ所示：式ⅰ。本发明的第二个目的在于提供一种如上所述的甲氧基去甲肾上腺素衍生物的合成方法，该合成方法不同于常规合成方法，具有良好的合成效果，显著提高了甲氧基去甲肾上腺素衍生物的合成效率。本发明的第二个目的采用以下技术方案实现：一种如上所述的甲氧基去甲肾上腺素衍生物的合成方法，如下式所示：；反应过程包括以下步骤：（a1）化合物3合成步骤：将甲氧基去甲肾上腺素、化合物2溶解于n,n-二甲基甲酰胺中，并加入k2co3进行反应后，经萃取、干燥、浓缩、纯化得到化合物3；（a2）甲氧基去甲肾上腺素衍生物合成步骤：将化合物3与苄基三乙基氯化铵溶解于氯仿中，制成反应溶液；将naoh溶液滴加入反应溶液中，反应后调节溶液ph=6，然后经萃取、干燥、浓缩、纯化，得到甲氧基去甲肾上腺素衍生物。具体的，反应过程包括以下步骤：（a1）化合物3的合成：称取50.0g的甲氧基去甲肾上腺素、25.0g的化合物2，共同溶解于250mln,n-二甲基甲酰胺（dmf）中，然后加入20.0g的k2co3，制成反应混合液；将反应混合液在室温下搅拌12小时；反应结束后，在反应混合液中加入250ml纯化水，然后用200ml二氯甲烷（dcm）进行萃取，萃取步骤重复3次；将萃取得到的结合的有机相通过na2so4进行干燥处理，再进行浓缩；将浓缩后得到的剩余物通过硅胶干燥柱（pe:ea=5:1）进行纯化，得到化合物3。（a2）甲氧基去甲肾上腺素衍生物的合成：称取5.0g的化合物3、0.75g苄基三乙基氯化铵，共同溶解于50ml氯仿（chcl3）中制成反应溶液；将浓度为0.55g/ml的naoh溶液在65℃条件下逐滴加入反应溶液中，并在65℃条件下搅拌5.0小时；反应结束后得到的剩余物用1n的hci调节至ph=6，进行酸化处理，然后用150ml乙酸乙酯（ea）进行萃取，萃取步骤重复3次；将萃取得到的结合的有机相进行干燥与浓缩处理；将浓缩后得到的剩余物通过pre-hplc进行纯化，得到的化合物，即为甲氧基去甲肾上腺素衍生物。本发明的第三个目的在于提供一种甲氧基去甲肾上腺素免疫原。本发明的第三个目的采用以下技术方案实现：一种甲氧基去甲肾上腺素免疫原，所述甲氧基去甲肾上腺素免疫原由上述结构式ⅰ所示的甲氧基去甲肾上腺素衍生物与载体蛋白连接而成，其结构式如式ⅱ所示：式ⅱ；其中，载体蛋白为重组牛血清白蛋白，进一步地，所述重组牛血清白蛋白的氨基酸序列如序列表seqidno：1所示。重组牛血清白蛋白的氨基酸序列（seqidno：1）具体如下：mkwvtfisllllfssaysrgvfrrdthkseiahrfkkdlgeehfkglvliafsqylqqcpfdehvkklvneltefakkqtcvadeshagcekslhtlfgdelckvaslretygdmadccekkqepernecflshkddspdlpkklkpdpntlcdefkadekkfwgkylyeiarrhpyfyapellyyankyngvfqeccvqaedkgacllpkkietmrekkvltssarqrlrcasiqkkfgeralkkawsvarlsqkfpkkaefvevtkclvtdltkvhkecchgdllecaddradlakkyicdnqdtissklkkeccdkpllekkshciaevekdaipenlppltadfaedkkkdvcknyqeakdaflgsflyeysrrhpeyavsvllrlakeyeatleeccakddphacystvfdkllkkhlvdepqnlikqncdqfekklgeygfqnalivrytrkvpqvstptlvevsrslgkvgtrcctkkpesermpctedylslilnrlcvlhekktpvsekkvtkkccteslvnrrpcfsaltpdetyvpkafdeklftfhadictlpdtekkqikkqtalvellkhkpkkateeqlkktvmenfvahfvdkccaaddkkeacfavegpkklvvstqtala。本发明的第四个目的在于提供一种如上所述的甲氧基去甲肾上腺素免疫原的制备方法。本发明的第四个目的采用以下技术方案实现：一种如上所述的甲氧基去甲肾上腺素免疫原的制备方法，包括以下步骤：（b1）载体蛋白溶液的制备：将上述的重组牛血清白蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中，得到载体蛋白溶液；（b2）甲氧基去甲肾上腺素衍生物溶液的制备：将上述结构式ⅰ所示的甲氧基去甲肾上腺素衍生物与二甲基甲酰胺、乙醇、磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和n-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解，得到甲氧基去甲肾上腺素衍生物溶液；（b3）甲氧基去甲肾上腺素免疫原的合成：将步骤（b2）得到的甲氧基去甲肾上腺素衍生物溶液加入到步骤（b1）得到的载体蛋白溶液中，搅拌反应，经透析纯化，得到甲氧基去甲肾上腺素免疫原。具体的，所述甲氧基去甲肾上腺素免疫原的制备方法，包括以下步骤：（b1）载体溶液的制备：将载体蛋白溶解于0.35mol/l的磷酸钾缓冲液（ph=8.5）中，载体蛋白的终浓度为5.0mg/ml，得到载体蛋白溶液；（b2）甲氧基去甲肾上腺素衍生物溶液的制备：将250.0mg上述的甲氧基去甲肾上腺素衍生物、7.5ml二甲基甲酰胺、7.5ml乙醇、15.0ml的磷酸钾缓冲液（10.0mmol/l，ph=8.0）、150.0mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、90.0mgn-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解反应3小时，得到甲氧基去甲肾上腺素衍生物溶液；（b3）甲氧基去甲肾上腺素免疫原的合成：将步骤（b2）得到的甲氧基去甲肾上腺素衍生物溶液逐滴加入到步骤（b1）得到的载体蛋白溶液中，并在-4℃下搅拌过夜，经透析纯化，得到甲氧基去甲肾上腺素免疫原。本发明的第五个目的在于提供一种抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体。本发明的第五个目的采用以下技术方案实现：一种抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体，所述抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体为使用上述的甲氧基去甲肾上腺素免疫原对实验动物进行注射后所得到的特异性抗体，所述的实验动物为兔子、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、豚鼠或马中的一种。本发明的第六个目的在于提供一种如上所述的抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体的制备方法。本发明的第六个目的采用以下技术方案实现：一种如上所述的抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体的制备方法，包含以下步骤：（c1）将上述的甲氧基去甲肾上腺素免疫原用磷酸盐缓冲液稀释，得到甲氧基去甲肾上腺素人工抗原溶液，然后将甲氧基去甲肾上腺素人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对上述的实验动物进行多点注射；（c2）3-6周后，再用相同的甲氧基去甲肾上腺素人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物进行多点注射，之后每隔3-6周注射一次，共计注射3-10次；（c3）对步骤（c2）中完成注射的实验动物取血，分离纯化，得到抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体。具体的，所述抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体的制备方法，包含以下步骤：（c1）将上述的甲氧基去甲肾上腺素免疫原用0.15mol/l磷酸钠缓冲液（ph=7.0）稀释至终浓度为3.5mg/ml，得到人工抗原溶液，然后将3.0ml人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔子进行多点注射；（c2）4周后，再用3.0ml相同的人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔子进行多点注射，之后每隔5周注射一次，共计注射6次；（c3）对步骤（c2）完成注射的实验动物兔子取血，分离纯化，得到抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体。本发明的第七个目的在于提供一种如上所述的抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体的应用。本发明的第七个目的采用以下技术方案实现：一种如上所述的抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体的应用，将所述抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体用于制备甲氧基去甲肾上腺素检测试剂，所述甲氧基去甲肾上腺素检测试剂包括甲氧基去甲肾上腺素均相酶免疫检测试剂与甲氧基去甲肾上腺素胶乳增强免疫比浊检测试剂。优选地，上述的抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体的应用，所述甲氧基去甲肾上腺素均相酶免疫检测试剂，由r1试剂与r2试剂组成，所述r1试剂包含上述的抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体与r1缓冲液，所述r2试剂包含甲氧基去甲肾上腺素葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物与r2缓冲液；所述的r1缓冲液含有酶底物、辅酶、牛血清白蛋白及tris缓冲液，所述的酶底物为葡萄糖-6-磷酸，所述的辅酶为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；所述的甲氧基去甲肾上腺素葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物由上述结构式ⅰ所示的甲氧基去甲肾上腺素衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联而成；其结构式如式ⅲ所示：式ⅲ；所述的r2缓冲液为含有牛血清白蛋白的tris缓冲液。具体的，所述甲氧基去甲肾上腺素均相酶免疫检测试剂的制备方法，包含以下步骤：（d1）将250.0mg牛血清白蛋白、250.0mg葡萄糖-6-磷酸及50.0mg氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依次加入250mltris缓冲液（50mmol/l，ph=8.5）中搅拌溶解制成r1缓冲液，再将抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体以1∶1000的体积比加入到上述r1缓冲液中混匀，再用1.0mol/l的盐酸调节ph至7.6，制成r1试剂；（d2）将250.0mg牛血清白蛋白加入250mltris缓冲液（100mmol/l，ph=8.7）中搅拌溶解制成r2缓冲液，再将甲氧基去甲肾上腺素葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物以1∶1000的体积比加入到上述r2缓冲液中混匀，再用1.0mol/l的盐酸调节ph至8.0，制成r2试剂。所述的甲氧基去甲肾上腺素葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物的制备方法，包含以下步骤：（e1）称取20.0mg活力单位为200ku的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，在室温条件下溶解于50.0ml磷酸钠（100mmol/l，ph=8.0）缓冲液中，然后加入150.0mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、75.0mg葡萄糖-6-磷酸以及0.75ml卡必醇，再逐滴加入2.5ml二甲基亚砜，搅拌溶解，得到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；（e2）在无水状态下称取15.0mg上述结构式ⅰ所示的甲氧基去甲肾上腺素衍生物，溶解于500.0µl二甲基甲酰胺中，将上述溶液温度降到0℃后加入4.5µl三丁胺、2.5µl氯甲酸异丁酯、3.5µln，n′-二环己基碳二亚胺，0℃下搅拌45分钟，得到甲氧基去甲肾上腺素衍生物激活液；（e3）将甲氧基去甲肾上腺素衍生物激活液逐滴加入到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，-4℃搅拌反应12小时，反应结束后经g-25凝胶层析柱纯化得到甲氧基去甲肾上腺素葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物。优选地，上述的抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体的应用，所述甲氧基去甲肾上腺素胶乳增强免疫比浊检测试剂，由l1试剂与l2试剂组成；所述l1试剂由上述的抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体、ph=8.0的缓冲液、牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸、促凝剂以及防腐剂组成；所述l2试剂由甲氧基去甲肾上腺素-牛血清白蛋白复合体包被的聚苯乙烯胶乳颗粒、ph=8.0的缓冲液、牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸以及防腐剂组成；所述的甲氧基去甲肾上腺素-牛血清白蛋白复合体由上述结构式ⅰ所示的甲氧基去甲肾上腺素衍生物与牛血清白蛋白偶联而成，其结构式如式ⅳ所示：式ⅳ；所述的聚苯乙烯胶乳颗粒直径范围为50-250nm；所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、mes缓冲液、硼酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液或巴比妥缓冲液中的一种；所述促凝剂为peg-4000、peg-6000、peg-8000或硫酸葡聚糖钠中的一种；所述防腐剂为叠氮钠、硫柳汞、苯酚或乙基汞硫代硫酸钠中的一种。具体的，所述甲氧基去甲肾上腺素胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法，包含以下步骤：（f1）将5.0ml的抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体溶解于250.0ml磷酸钾缓冲液（50.0mmol/lph=8.0）中，然后添加100.0mg牛血清白蛋白、25.0mg氯化钠、250.0μl吐温-20、250.0μl丙三醇、100.0μl的乙二胺四乙酸、150.0μl的peg-4000以及5.0mg叠氮钠，搅拌均匀，调节ph=7.3，制成l1试剂；（f2）将1.5mg表面带有羧基的直径为125nm的聚苯乙烯胶乳颗粒加入15.0ml的mes缓冲液（50.0mmol/l，ph=7.0）中，然后加入5.0mg碳二亚胺，在25℃下反应3小时，制成胶乳颗粒溶液，再将1.2mg甲氧基去甲肾上腺素-牛血清白蛋白复合体用7.5ml的硼酸盐缓冲液（50.0mmol/l，ph=9.2）稀释后，立即加入到上述胶乳颗粒溶液中，在41℃下反应18小时，然后加入3.0ml的甘氨酸缓冲液（100.0mmol/l，ph=8.0）搅拌3小时，反应终止后离心去除上清液，再将沉淀物用20.0ml的tris-hcl缓冲液（50.0mmol/l，ph=8.0）洗涤3次，再用50.0ml的甘氨酸缓冲液（50.0mmol/l，ph=8.6）稀释成胶乳悬浊液，最后加入质量分数为100.0mg牛血清白蛋白、25.0mg氯化钠、250.0μl吐温-20、250.0μl丙三醇、100.0μl的乙二胺四乙酸以及5.0mg叠氮钠，搅拌均匀，制成l2试剂。所述的甲氧基去甲肾上腺素-牛血清白蛋白复合体的制备方法，包含以下步骤：将10.0mg牛血清白蛋白用7.5ml的磷酸钠缓冲液（100.0mmol/l，ph=7.5）稀释，然后加入100.0mg上述结构式ⅰ所示的甲氧基去甲肾上腺素衍生物，再加入50.0mg的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺，在0℃下反应10小时，再用100.0ml磷酸盐缓冲液（100.0mmol/l，ph=7.5）在-4℃下透析12小时，得到甲氧基去甲肾上腺素-牛血清白蛋白复合体。相比现有技术，本发明的有益效果在于：1、本发明设计的甲氧基去甲肾上腺素衍生物及其合成方法均为针对性的新设计与研究，在现有技术中并不存在；2、本发明以甲氧基去甲肾上腺素衍生物制备出的抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体的特异性强、灵敏度高，并且与常见的32种激素及激素代谢物无任何交叉反应，因此能够用于制备具有较高的准确性、精密度、灵敏度和特异性的甲氧基去甲肾上腺素检测试剂；3、本发明的两种甲氧基去甲肾上腺素检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对甲氧基去甲肾上腺素高通量、快速化的检测，能同时测定多个样品，具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低甲氧基去甲肾上腺素检测成本，有利于临床推广使用。附图说明图1为实施例4甲氧基去甲肾上腺素的elisa检测标准曲线；图2为实施例8甲氧基去甲肾上腺素均相酶免疫检测试剂校准曲线；图3为实施例10甲氧基去甲肾上腺素胶乳增强免疫比浊检测试剂校准曲线。具体实施方式下面结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。除非特别指明，以下实施例中所用的试剂、仪器、设备、耗材均可从正规渠道商购买获得。实施例1：甲氧基去甲肾上腺素衍生物的合成通过以下合成路线合成甲氧基去甲肾上腺素衍生物：；具体的合成步骤如下：（1）化合物3的合成：称取50.0g的甲氧基去甲肾上腺素、25.0g的化合物2，共同溶解于250mln,n-二甲基甲酰胺（dmf）中，然后加入20.0g的k2co3，制成反应混合液；将反应混合液在室温下搅拌12小时；反应结束后，在反应混合液中加入250ml纯化水，然后用200ml二氯甲烷（dcm）进行萃取，萃取步骤重复3次；将萃取得到的结合的有机相通过na2so4进行干燥处理，再进行浓缩；将浓缩后得到的剩余物通过硅胶干燥柱（pe:ea=5:1）进行纯化，得到25.3g化合物3，产率50.6%。（2）甲氧基去甲肾上腺素衍生物的合成：称取5.0g的化合物3、0.75g苄基三乙基氯化铵，共同溶解于50ml氯仿（chcl3）中制成反应溶液；将浓度为0.55g/ml的naoh溶液在65℃条件下逐滴加入反应溶液中，并在65℃条件下搅拌5.0小时；反应结束后得到的剩余物用1n的hci调节至ph=6，进行酸化处理，然后用150ml乙酸乙酯（ea）进行萃取，萃取步骤重复3次；将萃取得到的结合的有机相进行干燥与浓缩处理；将浓缩后得到的剩余物通过pre-hplc进行纯化，得到0.81g白色固体状的化合物，即为甲氧基去甲肾上腺素衍生物，产率16.2%。实施例2：甲氧基去甲肾上腺素免疫原的制备甲氧基去甲肾上腺素免疫原的制备方法具体步骤如下：（1）载体溶液的制备：将载体蛋白溶解于0.35mol/l的磷酸钾缓冲液（ph=8.5）中，载体蛋白的终浓度为5.0mg/ml，得到载体蛋白溶液；（2）甲氧基去甲肾上腺素衍生物溶液的制备：将250.0mg上述的甲氧基去甲肾上腺素衍生物、7.5ml二甲基甲酰胺、7.5ml乙醇、15.0ml的磷酸钾缓冲液（10.0mmol/l，ph=8.0）、150.0mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、90.0mgn-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解反应3小时，得到甲氧基去甲肾上腺素衍生物溶液；（3）甲氧基去甲肾上腺素免疫原的合成：将步骤（2）得到的甲氧基去甲肾上腺素衍生物溶液逐滴加入到步骤（1）得到的载体蛋白溶液中，并在-4℃下搅拌过夜，经透析纯化，得到甲氧基去甲肾上腺素免疫原。实施例3：抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体的制备抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体的制备方法具体步骤如下：（1）将上述的甲氧基去甲肾上腺素免疫原用0.15mol/l磷酸钠缓冲液（ph=7.0）稀释至终浓度为3.5mg/ml，得到人工抗原溶液，然后将3.0ml人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔子进行多点注射；（2）4周后，再用3.0ml相同的人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔子进行多点注射，之后每隔5周注射一次，共计注射6次；（3）对步骤（2）完成注射的实验动物兔子取血，分离纯化，得到抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体。实施例4：elisa法检验抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体的性能1.甲氧基去甲肾上腺素的elisa检测标准曲线的建立：（1）标准品的制备：将甲氧基去甲肾上腺素纯品粉末(购于sigma公司)溶解于甲醇溶液，制备成1mg/ml的储存液。用elisa缓冲液将储存液依次稀释为1600.0ng/ml、800.0ng/ml、400.0ng/ml、200.0ng/ml、100.0ng/ml、0.0ng/ml的标准溶液。其中，elisa缓冲液由50.0mmol/l的tris缓冲液，质量分数为1.5%的nacl以及体积分数为0.25％的bsa配制而成。（2）利用甲氧基去甲肾上腺素的elisa检验方法制备标准曲线：用磷酸钾缓冲液（50.0mmol/l，ph=8.0）将实施例3中所制备的抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体稀释成1:10000的终浓度溶液，100μl/孔包被在96孔酶联板上，4℃放置18小时；用磷酸钾缓冲液将包被有抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体的96孔酶联板洗涤3次后，加入200μl/孔的体积分数0.5％的bsa溶液，4℃下放置12小时。然后用磷酸钾缓冲液洗涤3次，加入20μl/孔的标准溶液。再加入100μl/孔工作浓度的hrp-甲氧基去甲肾上腺素偶联物；室温下孵育30min后磷酸钾缓冲液洗板5次；然后每孔加入100μl的tmb底物，室温孵育30min。再每孔加入100μl的终止液（2.0mol/l的硫酸）。使用酶标仪测定450nm的吸光值。根据各标准溶液所对应的450nm的吸光值定标，制作标准曲线，结果如图1所示。待测样品中甲氧基去甲肾上腺素含量的检测：（1）制作待测样品：制备方法：将甲氧基去甲肾上腺素纯品粉末(购于sigma公司)溶解于甲醇溶液制成1.0mg/ml的储存液，并将此储存液稀释于空白尿液中，至终浓度分别为0.0ng/ml、30.0ng/ml、300.0ng/ml、1500.0ng/ml，分别形成空白、低、中、高浓度的尿液样本。所述空白尿液为不含甲氧基去甲肾上腺素的健康人尿液。（2）测试方法：利用上述甲氧基去甲肾上腺素的elisa检验方法，将上述空白、低、中、高浓度的尿液样本代替标准溶液，测试上述空白、低、中、高浓度的尿液样本在450nm的吸光值。（3）测试结果：对照图1中所示的甲氧基去甲肾上腺素的elisa检验的标准曲线，计算每个样本中甲氧基去甲肾上腺素含量，并对每个样本进行3个复孔测定，根据上述样本中甲氧基去甲肾上腺素的实际含量计算回收率，结果如表1所示。表1甲氧基去甲肾上腺素的elisa检测结果尿液样本空白低值中值高值样本浓度(ng/ml)0.0030.00300.001500.00测定10.0030.63302.901510.00测定20.0030.52299.251503.98测定30.0029.87298.561506.33平均值(ng/ml)0.0030.34300.241506.77回收率(％)-101.13100.08100.45由表1中结果可知：使用本发明甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体的elisa检测方法测定不同浓度样本中的甲氧基去甲肾上腺素回收率都较高，均在97%-103%之间，说明本发明所述的抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体可以用于样本中甲氧基去甲肾上腺素的检测，并且灵敏度高，检测结果准确度高。实施例5：32种常见激素及激素代谢物干扰实验选取32种常见激素及激素代谢物作为干扰物进行干扰实验，将干扰物配制成浓度为100.0ng/ml的待测样本，采用实施例4的elisa检验方法对相应干扰物的浓度进行检测，32种常见激素及激素代谢物名称以及检测结果详见表2。表2常见干扰物名称及检测结果序号干扰物名称等价于甲氧基去甲肾上腺素的浓度(ng/ml)序号干扰物名称等价于甲氧基去甲肾上腺素的浓度(ng/ml)1皮质醇0.0017醛固酮0.002雄烯二酮0.0018雄甾酮0.003皮质脂酮0.0019皮质酮0.004去氧皮质酮0.0020脱氢表雄酮0.005硫酸脱氢表雄酮0.0021二氢睾酮0.006雌二醇0.0022雌三醇0.007雌酮0.0023本胆烷醇酮0.00817-羟孕烯醇酮0.002417-羟孕酮0.009孕烯醇酮0.0025孕酮0.0010睾酮0.0026孕三醇0.0011孕二醇0.002717α-羟基黄体酮0.0012雄烯二酮0.002817-酮类固醇0.001317-羟皮质类固醇0.0029肾上腺素0.0014去甲肾上腺素0.0030多巴胺0.0015高香草酸0.0031二羟基杏仁酸0.0016香草扁桃酸0.0032甲氧基肾上腺素0.00测定结果显示：上述32种常见激素及激素代谢物等价于甲氧基去甲肾上腺素的浓度均为0.00ng/ml。由此可见，本发明的抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体的特异性强，与常见干扰物无任何交叉反应。实施例6：甲氧基去甲肾上腺素均相酶免疫检测试剂的制备甲氧基去甲肾上腺素均相酶免疫检测试剂的制备方法，具体步骤如下：（1）将250.0mg牛血清白蛋白、250.0mg葡萄糖-6-磷酸及50.0mg氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依次加入250mltris缓冲液（50mmol/l，ph=8.5）中搅拌溶解制成r1缓冲液，再将抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体以1∶1000的体积比加入到上述r1缓冲液中混匀，再用1.0mol/l的盐酸调节ph至7.6，制成r1试剂；（2）将250.0mg牛血清白蛋白加入250mltris缓冲液（100mmol/l，ph=8.7）中搅拌溶解制成r2缓冲液，再将甲氧基去甲肾上腺素葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物以1∶1000的体积比加入到上述r2缓冲液中混匀，再用1.0mol/l的盐酸调节ph至8.0，制成r2试剂。所述的甲氧基去甲肾上腺素葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物的制备方法，包含以下步骤：（1）称取20.0mg活力单位为200ku的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，在室温条件下溶解于50.0ml磷酸钠（100mmol/l，ph=8.0）缓冲液中，然后加入150.0mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、75.0mg葡萄糖-6-磷酸以及0.75ml卡必醇，再逐滴加入2.5ml二甲基亚砜，搅拌溶解，得到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；（2）在无水状态下称取15.0mg实施例1合成的甲氧基去甲肾上腺素衍生物，溶解于500.0µl二甲基甲酰胺中，将上述溶液温度降到0℃后加入4.5µl三丁胺、2.5µl氯甲酸异丁酯、3.5µln，n′-二环己基碳二亚胺，0℃下搅拌45分钟，得到甲氧基去甲肾上腺素衍生物激活液；（3）将甲氧基去甲肾上腺素衍生物激活液逐滴加入到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，-4℃搅拌反应12小时，反应结束后经g-25凝胶层析柱纯化得到甲氧基去甲肾上腺素葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物。实施例7：甲氧基去甲肾上腺素校准品、质控品的制备（1）校准品的制备：将甲氧基去甲肾上腺素纯品粉末分别加入6份浓度为50.0mmol/lph=7.2的tris-hcl缓冲液中，搅拌溶解，至终浓度分别为0.00ng/ml、200.00ng/ml、400.00ng/ml、800.00ng/ml、1600.00ng/ml、3200.00ng/ml，然后在每份溶液中分别加入质量分数为0.5%的氯化钠、1.0%的牛血清白蛋白、0.75%的乙二胺四乙酸、0.05%的叠氮钠，搅拌均匀，即为甲氧基去甲肾上腺素校准品（6个浓度）。（2）质控品的制备：将甲氧基去甲肾上腺素纯品粉末分别加入3份浓度为50.0mmol/lph=7.2的tris-hcl缓冲液中，搅拌溶解，至终浓度分别为0.00ng/ml、300.00ng/ml、1200.00ng/ml，然后在每份溶液中分别加入质量分数为0.5%的氯化钠、1.0%的牛血清白蛋白、0.75%的乙二胺四乙酸、0.05%的叠氮钠，搅拌均匀，即为甲氧基去甲肾上腺素质控品（3个浓度）。实施例8：甲氧基去甲肾上腺素均相酶免疫检测试剂校准曲线制作及质控实验1.制作甲氧基去甲肾上腺素均相酶免疫检测校准曲线：在迈瑞bs480全自动生化分析仪中放入r1试剂、r2试剂及校准品，然后对生化分析仪进行反应参数设置，具体参数详见表3；实际操作过程中需不断调整r1试剂和r2试剂的体积比例，同时调整测光点，最后由生化分析仪自动得出均相酶免疫检测校准曲线，如图2所示。表3迈瑞bs480全自动生化分析仪反应参数设置项目名称甲氧基去甲肾上腺素r1试剂160.0µlr2试剂40.0µl样本量10.0µl定标方法两点终点法主波长340nm次波长405nm反应时间10分钟温育时间8分钟反应方向上升结果ng/ml结果精度0.01拟合方法linegraph校准品浓度0.00ng/ml、200.00ng/ml、400.00ng/ml、800.00ng/ml、1600.00ng/ml、3200.00ng/ml2.质控品检测实验：利用上述的甲氧基去甲肾上腺素均相酶免疫检测方法，对质控品进行测定，并根据步骤1中制作的均相酶免疫检测校准曲线，计算每个质控品中甲氧基去甲肾上腺素的含量，每个质控品重复测定10次，检测结果及数据分析详见表4。表4甲氧基去甲肾上腺素均相酶免疫检验试剂检测结果及数据分析质控品空白低值高值浓度(ng/ml)0.00300.001200.00测试10.00303.051220.41测试20.00295.661193.74测试30.00298.801195.02测试40.00299.671211.50测试50.00303.201203.39测试60.00298.071212.00测试70.00303.291198.59测试80.00300.751196.67测试90.00307.341190.83测试100.00297.721198.45平均值(ng/ml)0.00300.761202.06标准差（sd）/3.479.58精密度（cv%）/1.150.80回收率（%）/100.25100.17实验结果表明：测定不同浓度质控品中甲氧基去甲肾上腺素含量的cv值均低于5%，回收率均在95%-105%之间，说明本发明的甲氧基去甲肾上腺素均相酶免疫检测试剂测定生物样本中甲氧基去甲肾上腺素含量的精密度较高，结果准确。实施例9：甲氧基去甲肾上腺素胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备甲氧基去甲肾上腺素胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法，包含以下步骤：（f1）将5.0ml的抗甲氧基去甲肾上腺素特异性抗体溶解于250.0ml磷酸钾缓冲液（50.0mmol/lph=8.0）中，然后添加100.0mg牛血清白蛋白、25.0mg氯化钠、250.0μl吐温-20、250.0μl丙三醇、100.0μl的乙二胺四乙酸、150.0μl的peg-4000以及5.0mg叠氮钠，搅拌均匀，调节ph=7.3，制成l1试剂；（f2）将1.5mg表面带有羧基的直径为125nm的聚苯乙烯胶乳颗粒加入15.0ml的mes缓冲液（50.0mmol/l，ph=7.0）中，然后加入5.0mg碳二亚胺，在25℃下反应3小时，制成胶乳颗粒溶液，再将1.2mg甲氧基去甲肾上腺素-牛血清白蛋白复合体用7.5ml的硼酸盐缓冲液（50.0mmol/l，ph=9.2）稀释后，立即加入到上述胶乳颗粒溶液中，在41℃下反应18小时，然后加入3.0ml的甘氨酸缓冲液（100.0mmol/l，ph=8.0）搅拌3小时，反应终止后离心去除上清液，再将沉淀物用20.0ml的tris-hcl缓冲液（50.0mmol/l，ph=8.0）洗涤3次，再用50.0ml的甘氨酸缓冲液（50.0mmol/l，ph=8.6）稀释成胶乳悬浊液，最后加入质量分数为100.0mg牛血清白蛋白、25.0mg氯化钠、250.0μl吐温-20、250.0μl丙三醇、100.0μl的乙二胺四乙酸以及5.0mg叠氮钠，搅拌均匀，制成l2试剂。所述的甲氧基去甲肾上腺素-牛血清白蛋白复合体的制备方法，包含以下步骤：将10.0mg牛血清白蛋白用7.5ml的磷酸钠缓冲液（100.0mmol/l，ph=7.5）稀释，然后加入100.0mg实施例1合成的甲氧基去甲肾上腺素衍生物，再加入50.0mg的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺，在0℃下反应10小时，再用100.0ml磷酸盐缓冲液（100.0mmol/l，ph=7.5）在-4℃下透析12小时，得到甲氧基去甲肾上腺素-牛血清白蛋白复合体。实施例10：甲氧基去甲肾上腺素胶乳增强免疫比浊检测试剂校准曲线制作及质控实验1.制作甲氧基去甲肾上腺素胶乳增强免疫比浊检测试剂校准曲线：在奥林巴斯au480全自动生化分析仪中放入l1试剂、l2试剂及校准品，然后对生化分析仪进行反应参数设置，具体参数详见表5；实际操作过程中需不断调整l1试剂和l2试剂的体积比例，同时调整测光点，最后由生化分析仪自动得出胶乳增强免疫比浊检测校准曲线，如图3所示。表5奥林巴斯au480全自动生化分析仪反应参数项目名称甲氧基去甲肾上腺素l1试剂160.0µll2试剂40.0µl样本量10.0µl定标方法两点终点法主波长570nm次波长412nm反应时间10分钟温育时间5分钟反应方向下降结果ng/ml结果精度0.01拟合方法logit-log4p校准品浓度0.00ng/ml、200.00ng/ml、400.00ng/ml、800.00ng/ml、1600.00ng/ml、3200.00ng/ml2.质控品检测实验：利用上述的胶乳增强免疫比浊检测方法，对质控品进行测定，并根据步骤1中制作的胶乳增强免疫比浊检测校准曲线，计算每个质控品中甲氧基去甲肾上腺素的含量，每个质控品重复测定10次，检测结果及数据分析详见表6。表6甲氧基去甲肾上腺素胶乳增强免疫比浊试剂检测结果及数据分析质控品空白低值高值浓度(ng/ml)0.00300.001200.00测试10.00298.91205.7测试20.00319.81198.1测试30.00302.01193.1测试40.00296.31201.4测试50.00317.71163.4测试60.00310.61199.1测试70.00312.01227.3测试80.00293.01235.1测试90.00322.81240.9测试100.00315.61224.2平均值(ng/ml)0.00308.871208.83标准差（sd）/10.5723.29精密度（cv%）/3.421.93回收率（%）/102.96100.74实验结果表明：测定不同浓度质控品中甲氧基去甲肾上腺素含量的cv值均低于5%，回收率均在95%-105%之间，说明本发明的甲氧基去甲肾上腺素胶乳增强免疫比浊检测试剂测定生物样本中甲氧基去甲肾上腺素含量的精密度较高，结果准确。对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思做出其它各种相应的变更以及修改，而所有的这些变更以及修改都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。序列表<110>湖南苏阳医疗科技有限公司<120>甲氧基去甲肾上腺素衍生物、免疫原、特异性抗体及其制备方法与应用<130>2020.09.14<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>638<212>prt<213>人工合成(artificialsequence)<400>1metlystrpvalthrpheileserleuleuleuleupheserserala151015tyrserargglyvalpheargargaspthrhislyssergluileala202530hisargphelyslysaspleuglyglugluhisphelysglyleuval354045leuilealapheserglntyrleuglnglncyspropheaspgluhis505560vallyslysleuvalasngluleuthrgluphealalyslysglnthr65707580cysvalalaaspgluserhisalaglycysglulysserleuhisthr859095leupheglyaspgluleucyslysvalalaserleuarggluthrtyr100105110glyaspmetalaaspcyscysglulyslysglngluprogluargasn115120125glucyspheleuserhislysaspaspserproaspleuprolyslys130135140leulysproaspproasnthrleucysaspgluphelysalaaspglu145150155160lyslysphetrpglylystyrleutyrgluilealaargarghispro165170175tyrphetyralaprogluleuleutyrtyralaasnlystyrasngly180185190valpheglnglucyscysvalglnalagluasplysglyalacysleu195200205leuprolyslysilegluthrmetargglulyslysvalleuthrser210215220seralaargglnargleuargcysalaserileglnlyslysphegly225230235240gluargalaleulyslysalatrpservalalaargleuserglnlys245250255pheprolyslysalagluphevalgluvalthrlyscysleuvalthr260265270aspleuthrlysvalhislysglucyscyshisglyaspleuleuglu275280285cysalaaspaspargalaaspleualalyslystyrilecysaspasn290295300glnaspthrileserserlysleulyslysglucyscysasplyspro305310315320leuleuglulyslysserhiscysilealagluvalglulysaspala325330335ileprogluasnleuproproleuthralaaspphealagluasplys340345350lyslysaspvalcyslysasntyrglnglualalysaspalapheleu355360365glyserpheleutyrglutyrserargarghisproglutyralaval370375380servalleuleuargleualalysglutyrglualathrleugluglu385390395400cyscysalalysaspaspprohisalacystyrserthrvalpheasp405410415lysleuleulyslyshisleuvalaspgluproglnasnleuilelys420425430glnasncysaspglnpheglulyslysleuglyglutyrglyphegln435440445asnalaleuilevalargtyrthrarglysvalproglnvalserthr450455460prothrleuvalgluvalserargserleuglylysvalglythrarg465470475480cyscysthrlyslysproglusergluargmetprocysthrgluasp485490495tyrleuserleuileleuasnargleucysvalleuhisglulyslys500505510thrprovalserglulyslysvalthrlyslyscyscysthrgluser515520525leuvalasnargargprocyspheseralaleuthrproaspgluthr530535540tyrvalprolysalapheaspglulysleuphethrphehisalaasp545550555560ilecysthrleuproaspthrglulyslysglnilelyslysglnthr565570575alaleuvalgluleuleulyshislysprolyslysalathrgluglu580585590glnleulyslysthrvalmetgluasnphevalalahisphevalasp595600605lyscyscysalaalaaspasplyslysglualacysphealavalglu610615620glyprolyslysleuvalvalserthrglnthralaleuala625630635当前第1页1 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