一种苯酞甘油醚类化合物及其制备方法和在抗海洋生物污损方面的应用与流程

本发明属于天然产物应用技术领域，具体涉及一种新的苯酞甘油醚类化合物，另外还涉及这种苯酞甘油醚化合物的制备方法及其在抗海洋生物污损方面的应用。

背景技术：

在开发海洋、利用海洋的历史进程中，人类一直面临着防除海洋附着生物的间题。海洋污损生物是指固着或栖息在船舶和各种人工设施水下固体表面上，对人类经济活动产生不利影响的海洋生物，其危害主要为增加船舶行进阻力，降低航速，增大燃料消耗；堵塞用水管道；改变金属腐蚀过程，导致局部腐蚀或穿孔；妨碍各类海洋设施的正常工作，引发漂移、失衡甚至导致倾覆；在海洋水产养殖方面，还会与养殖贝类争夺附着基和饵料，妨碍养殖对象的生长发育，并降低水产品品质等。当前，最常用防污涂料大体分为三类：氧化亚铜、有机锡和其他化合物。由于对海洋生物具有致畸毒性，有机锡抗污损涂料已被国际海事组织(imo)从2008年9月17日起全球范围内禁止使用；氧化铜涂料也被中国国家环保部列入“高污染、高环境风险”产品名录，于2012年被禁止使用。由此可见，我们亟需寻找无毒、环境无害、高效的替代涂料。从海洋生物体的基于化学防御和自身净化的化学生态作用而表现出抗污损活性的海洋天然产物中寻找无毒抗污损涂料成为主要的策略。

至今，在研究发现的无毒抗污损天然产物中，神经传递阻断是一类重要的作用机制。乙酰胆碱酯酶(ache)在脊椎动物和无脊椎动物体内广泛分布，包括海洋污损生物，抑制乙酰胆碱酯酶可造成污损生物类胆碱功能神经突触传送介质乙酰胆碱的积聚，引起神经功能紊乱和阻断神经传递。抑制乙酰胆碱酯酶活性已被用来作为判断抗污损效果的重要指标。因此，在具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的海洋天然产物中筛选无毒抗污损先导化合物具有更大的成功率，对于开发效果更好的环保型防污剂具有重要经济价值。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的海洋微生物来源新颖结构化合物苯酞甘油醚phthalideglycerolethera(pgea)。

本发明的苯酞甘油醚pgea，或其药用盐，其结构式如式i所示：

本发明的第二个目的是提供上述苯酞甘油醚pgea，或其药用盐在制备抗海洋生物污损剂中的应用。

所述的抗海洋生物污损剂是抗网纹藤壶附着的制剂。

本发明的第三个目的是提供一种苯酞甘油醚pgea的制备方法，其是从cochlioboluslunatusscsio41401的发酵培养物中分离得到的。

具体包括以下步骤：

制备cochlioboluslunatusscsio41401的发酵物，发酵物用乙酸乙酯浸泡提取，提取液经浓缩去除乙酸乙酯后得到浸膏，浸膏经硅胶柱层析，二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，收集二氯甲烷/甲醇体积比10:1洗脱馏分，经反相硅胶中压液相层析，用甲醇/水梯度洗脱，收集甲醇/水体积比1:1洗脱馏分，再经高效液相纯化得到苯酞甘油醚pgea。

所述的经高效液相纯化是经半制备高效液相(hplc)纯化，采用sunfire^tmc18色谱柱，柱温40℃，ch3cn/h2ov/v25:75洗脱，流速为2.0ml/min，在保留时间为26.5min时得到苯酞甘油醚pgea。

所述的制备cochlioboluslunatusscsio41401的发酵物，是将菌株接种到mb培养基平板上，置于25℃培养7d，然后再将活化后的菌种转接到种子培养基中，25℃178rpm摇床震荡培养3d获得种子液，再将种子液接种到大米固体培养基中，自然光照下，于25℃静止培养30d，获得菌株大米发酵物，所述的mb培养基每升含有麦芽提取物15g,海盐24.4g,琼脂15g,余量为水，ph:7.4–7.8，所述的种子培养基是每升含有麦芽提取物15g,海盐10g,余量为水，ph:7.4–7.8，所述的大米培养基是在每210ml水中加入200克大米，2.5克海盐，混合均匀制得。

本发明的第五个目的是提供cochlioboluslunatusscsio41401在制备苯酞甘油醚pgea中的应用。

本发明从一株海洋真菌cochlioboluslunatusscsio41401中分离鉴定一个结构新颖的苯酞甘油醚类化合物pgea，毒性小，对网纹藤壶金星幼虫半抑制率浓度为1.6μm。同时pgea具有显著的乙酰胆碱酯酶抑制活性(ic50＝2.5μm)，是其抗污损的主要作用机制。苯酞甘油醚类化合物pgea在抗海洋生物污损方面具有较好应用价值。

本发明的真菌cochlioboluslunatusscsio41401，保藏于中国科学院南海海洋研究所。公开于文献journalofnaturalproducts,2018,81(6):1405～1410。本申请人也持有，并保证自申请日起20年内向公众提供。

本发明由广东省促进经济发展专项资金(海洋经济发展用途)项目(2019-017)和“广东特支计划”本土创新创业团队项目(2019bt02y262)资助。

附图说明：

图1.化合物苯酞甘油醚pgea的结构式和重要的二维核磁cosy和hmbc相关信息

图2.化合物苯酞甘油醚pgea的圆二色谱图谱(a)和mo2(oac)4试剂诱导的圆二色谱图谱(b)。

图3.苯酞甘油醚pgea与ache(pdbcode:4ey7)的分子对接分析。(a)pgea与ache配体结合口袋的三维结构；(b)pgea与ache配体结合模式的二维推测结构。计算机分析结果显示pgea与ache结合较好。

具体实施方式：

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。

实施例1真菌cochlioboluslunatusscsio41401发酵和苯酞甘油醚pgea的分离

将真菌cochlioboluslunatusscsio41401菌株接种到mb培养基(麦芽提取物15g,海盐24.4g,琼脂15g,蒸馏水1l，ph:7.4–7.8，其制备方法是将各成分混合均匀，调ph值，然后灭菌制得)平板上，并将接种后的平板置于25℃培养7d。接种到将活化后的菌种转接到含有250ml培养基(麦芽提取物15g,海盐10g,蒸馏水1l，ph:7.4–7.8，其制备方法是将各成分混合均匀，调ph值，然后灭菌制得)的三角瓶(500ml)中，25℃178rpm摇床震荡培养3d获得种子液，用无菌一次性滴管吸取10ml种子培养液，分别转接于装有大米固体培养基的锥形瓶(瓶容量1000ml，装200克大米，2.5克海盐，210ml水，灭菌后备用)中，自然光照下，于25℃静止培养30d，共发酵48瓶。

发酵结束后，先于每瓶中加入乙酸乙酯(1:1，v:v)灭活，将固体发酵培养物切成小块捣碎，充分搅拌后，超声提取15分钟，再浸泡过夜。用纱布抽滤，对残渣和提取液分别进行提取。提取液减压蒸馏除去乙酸乙酯，水相用乙酸乙酯(1:1，v:v)萃取三次得乙酸乙酯相。残渣再以乙酸乙酯(1:2，v:v)浸提3次，每次充分搅拌后，浸泡过夜，浓缩合并收集乙酸乙酯相。将多次浸提得到的乙酸乙酯相液合并后进行减压蒸馏，得粗提物约310.0g。再用石油醚(1:1，v:v)萃取3遍，减压蒸馏除去石油醚相中的石油醚，最后剩下浸膏约256.4g。

浸膏以少量甲醇溶解后硅胶拌样，进行中压硅胶柱层析(200-300目)，洗脱液为二氯甲烷/甲醇从体积比100:0,100:1,50:1,20:1,15:1,10:1,5:1,3:1,2:1,1:1,1:2和0:1梯度洗脱，顺序得到12个洗脱部位fr.1–fr.12。fr.6(二氯甲烷/甲醇体积比10:1洗脱馏分)再次经过反相硅胶中压液相(mplc)层析，用甲醇/水(v/v2:8to10:0)梯度洗脱，收集甲醇/水体积比1:1洗脱馏分，再经半制备高效液相(hplc)纯化，采用sunfire^tmc18色谱柱，柱温40℃，ch3cn/h2o洗脱(v/v25:75,流速2.0ml/min)，在保留时间为26.5min时分离得到纯化合物苯酞甘油醚pgea。

实施例2苯酞甘油醚pgea的结构鉴定

对化合物pgea进行结构分析测试，得到以下理化性质数据：棕色无定形固体(甲醇)；易溶于甲醇、氯仿等有机溶剂，旋光[α]²d⁵+2.4(c0.062,meoh)；紫外uv(meoh)λmax(logε)204(3.10),310(2.26)nm；圆二色谱cd(0.33mg/ml,meoh)λmax(δε)217(0.79),259(-0.07),291(0.15)nm；核磁共振¹h和¹³cnmr见表1；高分辨质谱(+)-hresemsm/z291.0838[m+na]⁺(calcdforc13h16nao6,291.0839)。

¹h-nmr谱中可以观察到1个甲基δh(0.97t,7.0)，2个芳香质子δ(7.09，d,j＝8.4hz)(7.19d，j＝8.4hz)，3个亚甲基，以及两个次甲基。¹³c-nmr谱及dept135数据显示共13个碳，其中1个羰基碳，2个芳香次甲基碳，1个甲基碳，以及3个亚甲基碳，2个次甲基碳，还有4个季碳。根据不饱和度为6，结合¹h和¹³cnmr谱，推测结构中含有一个4取代苯基。由2dnmr谱中，质子h-3，h-8与h-9；质子h-4与h-5；质子h-10，h-11与h-12依次有cosy相关信号；质子h-3与c-1，c-3a，c-4；h-10与c-6；h-4与c-3，c-6，c-7a；h-5与c-7，c-3a；h-10与c-7有hmbc相关(图1)确定了连接方式，从而推测出化合物pgea的平面结构。

表1化合物pgea的¹h(700mhz)和¹³c(175mhz)nmr数据(cd3od)

pgea的立体结构的确定主要通过分析圆二色谱(cd)。如图2所示，pgea的cd谱中，在217nm处有正的π→π*cotton效应，在259nm处有负的n→π*cotton效应，提示c-3位是s构型。而c-11位构型通过mo2(oac)4试剂(dmso溶剂)诱导的cotton效应来确定。pgea的钼复合物(mo2-complex)在408nm和313nm左右有正的cotton效应，确定c-11位是r构型。因此，pgea鉴定为式i所示的化合物3s,11r-phthalideglycerolethera(pgea).

实施例3苯酞甘油醚pgea乙酰胆碱酯酶抑制活性

细胞毒实验筛选发现pgea对一系列常见肿瘤细胞(k562,bel-7402,sgc-7901,a549和hela)的细胞毒作用较小，显示该化合物毒性小。

利用乙酰胆碱酯酶(ache)活性检测试剂盒进行检测。在3.00ml磷酸盐缓冲液(0.1mol/l,ph＝8.0)中加入20μl酶液,混匀后37℃保温20min后,依次加入100μldtnb溶液(终浓度1.0mmol/l)和20μlatch溶液(终浓度1.0mmol/l),充分混合,反应体积为3.14ml。在412mn处用1cm比色皿，每隔0.5min读数,连续测定3min。这是未加药酶活力为e1。在2.98ml磷酸盐缓冲液(0.lmol/l,ph＝8.0)中加入20μl酶液，并加入0.016,0.08,0.4,2,10,50μm不同浓度的pgea(一个浓度测定3次)，依次加入100μldtnb溶液(终浓度1.0mmol/l)和20μlatch溶液(终浓度1.0mmol/l),充分混合,反应体积为3.14ml。在412mn处用1cm比色皿，每隔0.5min读数,连续测定3min。计算出此时酶活，为e2。抑制率计算公式为i(％)＝(e1-e2)/e1*100％得到一系列不同浓度的抑制率以后，利用spss计算出pgea对的ic50为2.5μm。阳性药huperzinea在同样条件下检测出ic50为0.3μm。

通过高性能计算机的分子对接分析对pgea与ache的作用进行分析。使用2017-1软件进行对接，选用晶体结构ache(pdbcode:4ey7)，按照proteinpreparewizard工作流程进行构建。使用grid生成程序选择键合位点，然后再使用默认参数下的glide(xp模式)将制备的配体灵活对接到受体上。研究分析ache配体结合域与化合物pgea之间的分子相互作用。结果发现，pgea可与ache受体结合域进行结合(图3)，结合自由能值(s值)为-11.113。在二维结合模型中，色酮结构上三羟基与lxrα的活性位点残基thr302或hid421形成氢键相互作用。由此推测色酮结构上三羟基具有促进pca与lxrα受体蛋白结合的作用。

实施例4苯酞甘油醚pgea抗网纹藤壶金星幼虫附着活性实验

活性测试模型采用目前实验室最常用的海洋污损生物模型之一网纹藤壶金星幼虫的附着抑制试验。网纹藤壶金星幼虫的获取方法：从香港潮间带中采集成年网纹藤壶，将其于室温下暴露于空气中12小时候后，再置于过滤了的海水中，让其缓慢孵化出无节幼虫，然后按照thiyagarajan报道的实验方法，将无节幼虫置于恒温培养箱内在26-28℃的条件下用纤细角毛藻为饵料，将其培养至金星幼虫，新培养的金星幼虫立即用于抗附着实验。

采用24孔聚苯乙烯板测定化合物的抗幼虫附着活性。将实施例1得到的苯酞甘油醚pgea纯品溶于dmso，用无菌过滤海水稀释成不同的浓度溶液(终浓度25,10,5,2.5,1.25,0.625,0.31,0.15μm)。每个孔中加入1ml测试液和20±2个成熟的藤壶幼虫，每个浓度设5个重复样，无菌过滤海水做空白对照。将24孔细胞培养板置于30℃培养箱中放置24小时。测试结果用解剖显微镜检测藤壶在固体表面附着的数量、未附着的数量以及藤壶的死亡或病变的数量等。pgea的抑制率通过分别计算每个孔中，附着的幼虫数量及发生病变的幼虫数量与加入藤壶幼虫总数的比值来获得，用spss11.0软件进行统计分析，计算ec50值用来表示化合物抑制幼虫附着的数量为加入幼虫总数一半时化合物的浓度。实验结果表明，所有样品中未发现任何幼虫出现死亡的状况，说明化合物pgea安全无毒。同时pgea抑制网纹藤壶金星幼虫附着的ec50值为1.6μm。

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