一种丙环唑半抗原、完全抗原和其抗体及其制备和应用的制作方法

本发明属于食品安全检测技术领域。更具体地，涉及一种丙环唑半抗原、完全抗原和其抗体及其制备和应用。

背景技术：

丙环唑是一种既有保护作用又有治疗作用的内吸性三唑类杀菌剂，可被根茎叶部吸收，并很快地在植物体内向上传导。其作用机理是影响甾醇的生物合成，使病原菌的细胞膜功能受到破坏，最终导致细胞死亡，从而起到杀菌、防病和治病的功效。经查询中国农药信息网，丙环唑在我国登记的作物主要有水稻、小麦、玉米、大豆、油菜、马铃薯、茭白、莲藕、枇杷、花生、苹果、香蕉、榛子和人参等。残效期在1个月左右，一般只对皮肤和眼有刺激作用，经口误服，可引起恶心、呕吐等。由于其毒负作用，国内国际上均对其残留限量做出了限定。目前欧盟等国家对不同作物中的丙环唑残留量做出了详细的限量，日本肯定列表中规定丙环唑在菜心、芥蓝和小白菜上的最大允许残留限量(mrl值)为0.05mg/kg。中国在gb2763-2016《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定各类食品中最大允许残留限量(mrl值)为0.02mg/kg。因此，为了公众的健康，对食品中丙环唑残留量的检测是十分必要的。

有关丙环唑在蔬菜、水果、粮食、食品中的残留分析方法国内外已有一些报道。目前，对于丙环唑残留的检测方法主要有高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography，hplc)、气相色谱(gaschromatography，gc)、气相色谱-质谱联用(gaschromatography-massspectrometer，gc-ms)以及高效液相-质谱联用(highperformanceliquidchromatography-massspectrometer，hplc-ms)等方法。这些方法结果可靠，灵敏度高，已有相关的技术标准可供参考。但由于需要昂贵的仪器、专门的操作人员，以及样品前处理复杂、有机溶剂使用量大等，因此该方法一方面不能实现现场的快速检测；另一方面也很难在我国基层单位广泛推广。

与仪器分析方法相比，免疫检测方法因其简便、经济、快速等优点而在农药残留检测领域中受到越来越多的关注。elisa方法是常用的免疫检测方法，但是其却有操作步骤相对较多，检测时间较长，检测结果不够直观等缺陷。因而elisa在丙环唑农药的快速检测上的应用受到很大的限制。

胶体金试纸条无需专业操作人员及任何辅助类仪器，根据反应所显现的条带几分钟即可判定结果，不仅操作简便、快速，且结果直观准确、成本低。而在建立能够高效、特异性检测丙环唑的免疫学检测方法时，关键在于获得灵敏度高、特异性强的抗体，如公开号为cn106596953a的中国专利提供了一种检测丙环唑的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，是在丙环唑结构上进行改造、修饰，来合成半抗原，偶联蛋白来免疫动物，但这样会破坏丙环唑的结构，导致很难产生针对丙环唑的特异性抗体。因此，迫切需要提供一种保留丙环唑整体结构并且能够产生针对丙环唑特异性高的抗体的半抗原和抗原，同时建立一种检测高效、灵敏、特异性强、能专一检测丙环唑的免疫学检测方法。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种新型丙环唑半抗原的合成及多克隆抗体的制备，利用得到的多克隆抗体开发一种检测丙环唑残留的酶联免疫试剂盒，以及制备一种检测丙环唑的胶体金快速检测试纸条。本发明制备的丙环唑半抗原，以一种与丙环唑高度相似的结构类似物作为出发点，在一端进行延长碳链，极大地保证整个结构的完整性；制得的丙环唑多克隆抗体灵敏度高，特异性好，为建立特异性丙环唑的免疫检测方法提供了核心原材料，且以胶体金标记高亲和力的丙环唑多克隆抗体为基础制备而成的胶体金试纸条，具有较宽的选择性和较高的敏感性，能够特异性的检测食品中的丙环唑残留。

本发明的首要目的是提供一种丙环唑半抗原。

本发明的另一目的是提供所述丙环唑半抗原的制备方法。

本发明的另一目的是提供一种丙环唑完全抗原。

本发明的另一目的是提供一种丙环唑多克隆抗体。

本发明的再一目的是提供一种检测丙环唑的酶联免疫试剂盒。

本发明的再一目的是提供一种丙环唑胶体金快速检测试纸条。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首先提供了一种丙环唑半抗原，所述丙环唑半抗原的结构式如式(i)所示：

所述丙环唑半抗原采用系统命名法命名为：

(4-((((2s，4r)-2-((1h-1,2,4-三唑-1-基)甲基)))-2-(2,4-二氯苯基)-1,3-二氧戊环-4-基)甲氧基)-4-氧代丁酸即：4-(((2s,4r)-2-((1h-1,2,4-triazol-1-yl)methyl)-2-(2,4-dichlorophenyl)-1,3-dioxolan-4-yl)methoxy)-4-oxobutanoicacid)。

本发明还提供所述丙环唑半抗原bhc-hs的制备方法为：将丙环唑类似物溶解于无水二氯甲烷后，加入丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶进行反应，反应产物经旋干后，加入乙酸乙酯和饱和食盐水萃取，酯层用无水硫酸钠干燥，最后浓缩后即得到丙环唑半抗原；所述丙环唑类似物的结构式为：

本发明将丙环唑类似物分子上羟基与丁二酸酐进行反应引入游离羧基形成丙环唑半抗原，在丙环唑类似物一端进行延长碳链，极大地保证整个结构的完整性。

优选地，所述丙环唑类似物和无水二氯甲烷的质量体积比为10～15mg：1ml。

更优选地，所述丙环唑类似物和无水二氯甲烷的质量体积比为15mg：1ml。

优选地，丁二酸酐和丙环唑类似物的质量比为2～5:1。

更优选地，丁二酸酐和丙环唑类似物的质量比为2：1。

所述薄层层析的展开剂为体积比为3：1的乙酸乙酯和石油醚。

本发明还提供了一种丙环唑完全抗原，是采用活泼酯法将上述的丙环唑半抗原与载体蛋白偶联，透析得到。

优选地，所述载体蛋白为牛血清蛋白(bsa)或钥孔血蓝蛋白(klh)。

制备得到的丙环唑完全抗原的结构式如下：

本发明还提供了一种丙环唑多克隆抗体，该多克隆抗体是将上述丙环唑完全抗原乳化后，免疫新西兰大白兔，经分离纯化得到。

作为一种优选地实施方式，丙环唑多克隆抗体的制备方法具体包括以下步骤：

(1)用2只(雌、雄各一只)4周的新西兰大白兔进行免疫，每只完全抗原为半抗原-钥孔血蓝蛋白偶联物(bhc-hs-klh)(1mg/ml)500μl，初次免疫时将半抗原-钥孔血蓝蛋白偶联物(bhc-hs-klh)按体积比1:1与弗式完全佐剂乳化，免疫新西兰大白兔。之后将bhc-hs-klh按体积比1:1与弗式不完全佐剂乳化，每隔三周进行一次加强免疫，共加强免疫三次；

(2)第三次免疫后隔一周兔耳静脉取血，离心取上清，-20℃保存备用。

本发明制备的丙环唑多克隆抗体对丙环唑原药的半抑制浓度为4.23ng/ml，定量检测范围为0.29～61.83ng/ml，检测限为0.06ng/ml，对乙环唑、三唑醇的交叉反应率均低于1％。

因此由上述方法制备得到的丙环唑多克隆抗体也在本发明的保护范围之内。

基于上述制备的丙环唑多克隆抗体，本发明还提供了一种检测丙环唑的酶联免疫试剂盒，包括有：包被有包被原的酶标板、丙环唑标准品溶液、丙环唑多克隆抗体、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液；

所述包被原为所述包被原为丙环唑半抗原与蛋白的偶联物；所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的丙环唑多克隆抗体。

优选地，所述包被原的结构式为：

本试剂盒采用直接竞争elisa方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的丙环唑和酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗丙环唑的酶结合物，用tmb底物显色，样本吸光度值与其所含残留物丙环唑的含量成负相关，与标准曲线比较，再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中丙环唑的残留量。

优选地，所述丙环唑标准品溶液为六个浓度梯度，分别是0μg/l，0.1μg/l，1μg/l，10μg/l，100μg/l，1000μg/l。

优选地，所述底物显色液由底物液a液和底物液b液组成，a液为过氧化氢或过氧化脲，b液为邻苯二胺或四甲基联苯胺。

优选地，所述终止液为1～2mol/l的硫酸溶液。

优选地，所述洗涤液为ph值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/l的磷酸盐缓冲液；所述百分比为重量体积百分比。

优选地，上述酶标板的制备方法为：用包被缓冲液将包被原稀释成1μg/ml，每孔加入100μl，37℃避光孵育过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μl封闭液，25℃避光孵育1～2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

优选地，上述酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为ph值为9.6，0.05mol/l的碳酸盐缓冲液；封闭液为ph值为7.1～7.5，含有1％～3％酪蛋白、0.1～0.3mol/l的磷酸盐缓冲液；所述百分比为重量体积百分比。

作为一种优选的方式，上述酶联免疫试剂盒检测丙环唑的方法，它包括如下步骤：

(1)样品前处理；(2)用试剂盒进行检测；(3)分析检测结果。

本发明检测丙环唑的酶联免疫试剂盒主要采用elisa方法定量检测样品中丙环唑残留的量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品；主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量。

本发明还提供了一种丙环唑胶体金快速检测试纸条，包括有衬板(1)和依次排列在衬板(1)上的样品垫(2)、金标结合物垫(3)、纤维素膜(4)和吸水垫(7)，所述金标结合物垫(3)内吸附有胶体金标记的权利要求6所述丙环唑多克隆抗体，所述纤维素膜(4)上有隐形检测线(5)和隐形对照线(6)，所述隐形检测线(5)采用权利要求4所述丙环唑完全抗原溶液印制，所述隐形对照线(6)采用羊抗兔抗体印制。

优选地，所述金标结合物垫(3)与所述样品垫(2)之间设置有保护膜(8-1)，且该保护膜上印制有待测样品标识线(9)，该标识线偏向样品垫(2)一侧0.5cm处。

优选地，所述样品垫(2)采用玻璃纤维棉和/或尼龙膜和/或聚偏二氟乙烯膜和/或聚酯膜中的制成，所述纤维素膜(4)采用硝酸纤维素膜和/或纯纤维素膜和/或羧化纤维素膜制成。

本发明具有以下有益效果：

本发明制备的丙环唑半抗原bhc-hs，以一种与丙环唑高度相似的结构类似物作为出发点，在一端进行延长碳链，极大地保证了丙环唑的关键基团和整体结构，以得到特异性高的抗体；应用该半抗原制备得到了丙环唑完全抗原和多克隆抗体，该抗体对丙环唑具有高灵敏度和高特异性的识别能力，半抑制浓度为4.23ng/ml，定量检测范围为0.29～61.83ng/ml，检测限为0.06ng/ml，对乙环唑、三唑醇的交叉反应率均低于1％，为建立特异性丙环唑的免疫检测方法提供了核心原材料；此外，利用该多克隆抗体开发了一种检测丙环唑残留的酶联免疫试剂盒，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点；最后基于该多克隆抗体制备而成的胶体金试纸条，具有较宽的选择性和较高的敏感性，能够特异性的检测丙环唑残留。

附图说明

图1为丙环唑半抗原、人工抗原、抗体、elisa制备流程图。

图2为丙环唑半抗原bhc-hs合成过程示意图。

图3为丙环唑完全抗原紫外扫描鉴定曲线。

图4为丙环唑抗体间接竞争elisa标准曲线。

图5为本发明中一种丙环唑农药胶体金快速检测试纸条的侧面结构示意图。

图6为本发明中一种丙环唑农药胶体金快速检测试纸条的俯瞰结构示意图；其中：1、衬板；2、样品垫；3、金标结合垫；4、纤维素膜；5、隐形检测线；6、隐形对照线；7、吸水垫；8-1、样品浸入端保护膜；8-2、手柄端保护膜；9、标识线。

图7为本发明中一种丙环唑农药胶体金快速检测试纸条的结果示意图；

其中：a为阴性样品检测结果，b为弱阳性样品检测结果，c为强阳性样品检测结果，d和e为试纸条失效。

图8为本发明实验例8中丙环唑农药检测试纸条中蔬菜加标样品的分析结果(阴性样品n：0.02mpb缓冲液)。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

丙环唑类似物

货号：28-azc-33-1；

商家：torontoresearchchemicals。

以下实施例包括丙环唑半抗原、丙环唑人工抗原的合成以及丙环唑抗体的制备，流程如图1所示。

实施例1丙环唑半抗原bhc-hs的合成与鉴定

1、丙环唑半抗原的合成

(1)向反应的25ml圆底瓶中加入30mg丙环唑类似物，加入2ml无水二氯甲烷溶解，然后加入20mg丁二酸酐和4mg4-二甲氨基吡啶，常温搅拌反应24个小时。应式如图2所示，用tlc(展开剂条件：乙酸乙酯：石油醚＝3:1)监控至反应完毕，旋干后用乙酸乙酯和饱和氯化钠分别萃取两次，向乙酸乙酯相中加入无水硫酸钠干燥，浓缩后得到丙环唑半抗原bhc-hs；

2、鉴定：

取丙环唑类似物的标准品进行核磁鉴定谱图，取丙环唑半抗原bhc-hs进行氢谱鉴定和质谱鉴定谱图。

氢谱结果如下：¹hnmr(600mhz,dmso-d6)

δ12.28–12.23(m,1h),8.40(d,j＝5.2hz,2h),7.84(d,j＝5.1hz,2h),7.66(d,j＝5.3hz,2h),7.46(t,j＝6.7hz,2h),7.41(q,j＝10.2,7.0hz,2h),4.84–4.74(m,4h),4.23(q,j＝5.6hz,2h),3.98(dd,j＝10.8,5.6hz,2h),3.85(ddd,j＝26.8,12.4,5.9hz,5h),3.65(dt,j＝11.7,5.7hz,2h),2.55(t,j＝6.0hz,4h),2.50(q,j＝6.6,6.2hz,6h),2.42(d,j＝5.3hz,1h),1.23(d,j＝5.4hz,1h).

质谱结果如下：ms:c17h17cl2n3o6:429.0，esi^-[m-h]^-:430。

根据核磁共振氢谱和质谱结果可以看出，衍生位点正确且成功，说明本发明成功合成了目标产物，命名为丙环唑半抗原bhc-hs，其结构式如式(i)所示：

所述丙环唑半抗原采用系统命名法命名为：

(4-((((2s，4r)-2-((1h-1,2,4-三唑-1-基)甲基)))-2-(2,4-二氯苯基)-1,3-二氧戊环-4-基)甲氧基)-4-氧代丁酸即：4-(((2s,4r)-2-((1h-1,2,4-triazol-1-yl)methyl)-2-(2,4-dichlorophenyl)-1,3-dioxolan-4-yl)methoxy)-4-oxobutanoicacid)。

实施例2丙环唑完全抗原的合成与鉴定

1、丙环唑完全抗原和载体蛋白的偶联

(1)称取半抗原10mg，2mg的nhs和3mg的edc溶解于100uldmf中，搅拌过夜；

(2)称取9.4mg牛血清蛋白(bsa)加入到1ml的pbs缓冲液中；

(3)将步骤(1)所得溶液逐滴缓慢加入到步骤(2)所得溶液中，搅拌8h；

(4)用pbs缓冲液透析两天，每天4次，透析结束后得到丙环唑类似物-hs-bsa完全抗原(bhc-hs-bsa)。

其中，磷酸盐缓冲溶液的配方：na2hpo4·12h2o2.90g，nacl8.50g，kcl0.20g，kh2po40.20g，加蒸馏水定容至1000ml。

同理，采用钥孔血蓝蛋白(klh)替换bsa作为载体蛋白，得到目的产物bhc-hs-klh，过程与制备bhc-hs-bsa完全抗原相同。

2、鉴定：

取丙环唑类似物完全抗原，进行紫外全波长扫描，结果如图3所示。

bsa、klh、完全抗原分别进行紫外(200～400nm)扫描鉴定，比较偶联前后的各物质的最高吸光值，丙环唑类似物完全抗原的吸收曲线与载体蛋白明显不同，且在365nm处出现丙环唑类似物的特征吸收峰，故丙环唑类似物完全抗原的曲线是两者的累加吸收特征，说明丙环唑类似物半抗原与bsa成功偶联制得完全抗原。

实施例3丙环唑多克隆抗体的制备

(1)用2只(雌、雄各一只)4周的新西兰大白兔进行免疫，每只完全抗原为bhc-hs-klh(1mg/ml)500μl，初次免疫时将bhc-hs-klh按体积比1:1与弗式完全佐剂乳化，免疫新西兰大白兔。之后将bhc-hs-klh按体积比1:1与弗式不完全佐剂乳化，每隔三周进行一次加强免疫，共加强免疫三次；

(2)第三次免疫后隔一周兔耳静脉取血，离心取上清，-20℃保存留用。

实施例4丙环唑多克隆抗体的elisa检测

1、elisa检测

(1)将血清用pbst稀释为1:6400，同时设置空白对照孔(未加入血清，用pbst代替)；

(2)将丙环唑(bhc-hs-bsa)人工抗原用包被液稀释至1μg/ml的浓度，包被96孔酶标板，每孔加入100μl，37℃温育过夜，弃去包被液，洗涤2次；

(3)每孔加入120μl封闭液(1％鱼皮胶原蛋白)，37℃封闭3h，弃去封闭液，拍板，37℃烘干备用；

(4)用pbst500倍稀释血清，并将丙环唑药物稀释至1000，200，40，8，1.6，0.32，0.064ng/ml；

(5)每行加50μl丙环唑药物稀释液(三组平行)，再加50μl血清稀释液/孔，在37℃温育40min，洗涤5次；

(6)加入羊抗兔二抗igg-hrp(5000倍稀释)，37℃温育30min，洗涤5次，拍板；

(7)加入显色液显色10min；

(8)加入50μl10％h2so4终止反应，并在450nm处读取od值；

(9)将上述药物丙环唑换成乙环唑、三唑醇和己唑醇，并以同样的稀释倍数进行上述试验，测定该抗体对三唑类杀菌剂其他结构类似物的交叉反应率。

2、结果

丙环唑抗体间接竞争elisa标准曲线如图4所示。可见丙环唑抗体对丙环唑的半抑制浓度(ic50)为4.23ng/ml，定量检测线性范围(ic20～ic80)为0.29～61.83ng/ml，最低检测限为0.06ng/ml，且对乙环唑、三唑醇和己唑醇的交叉反应率均低于1％。

实施例5检测丙环唑的酶联免疫试剂盒的制备

组建检测丙环唑的酶联免疫试剂盒，使其包含下述各部分：

(1)包被有包被原的酶标板的制备：用包被缓冲液将包被原(丙环唑半抗原与蛋白的偶联物bhc-hs-bsa)稀释成1μg/ml，每孔加入100μl，37℃避光孵育过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μl封闭液，25℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存；包被缓冲液为ph值为9.6，0.05mol/l的碳酸盐缓冲液，封闭液为ph值为7.1～7.5，含有1％～3％酪蛋白、0.1～0.3mol/l的磷酸盐缓冲液。

(2)丙环唑标准品溶液：6个浓度梯度，分别为0μg/l，0.1μg/l，1μg/l，10μg/l，100μg/l，1000μg/l。

(3)实施例3制备的丙环唑多克隆抗体

(4)酶结合物：辣根过氧化物酶标记的丙环唑多克隆抗体。

(5)底物显色液由a液和b液组成，a液为过氧化脲，b液为四甲基联苯胺。

(6)终止液为2mol/l硫酸。

(7)洗涤液为ph值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/l的磷酸盐缓冲液。

实施例6丙环唑技术参数的确定试验

1、试剂盒灵敏度和检测限

按照常规方法测定试剂盒灵敏度，标准曲线的范围为0.1～8.1μg/l，ic50(50％抑制浓度)浮动范围为0.29～61.83ng/ml；对20份样品进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光度值的浓度，以20份样本浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果显示，该方法对蔬菜和水果的检测限分别为0.4μg/kg、0.6μg/kg。

2、试剂盒稳定性试验

试剂盒保存条件为2～8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、丙环唑添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置7天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻7天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃至少保存12个月以上。

实施例7一种丙环唑胶体金快速检测试纸条

1、金标抗体和金标结合物垫的制备

(1)胶体金标记的丙环唑农药多克隆抗体的制备

采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法，制备平均直径在40nm的胶体金悬浮液。在回流条件下，把100ml0.01％的氯金酸溶液加热至沸腾，不停的搅拌，迅速加入1.1ml1％的柠檬酸三钠。当反应溶液颜色变成葡萄红色时继续加热搅拌5min。冷却至室温后，加入0.05％的叠氮化钠4℃保存。

胶体金在与抗体标记前以0.2mol的k2co3溶液调到ph为8.2左右，采用经典nacl滴定法确定30μg抗体标记1ml胶体金溶液。然后按最佳标记量进行标记，标记1小时后，搅拌下加入10％bsa(使最终bsa浓度为1％)，孵育1小时后4℃10000rpm离心25min，并去上清。加入胶体金溶液同体积的5％bsa溶液重悬，4℃10000rpm离心25min，重复两次。最后，用1/5胶体金溶液体积的tb溶液(含3％bsa、3％蔗糖、0.01mol/l硼酸钠和0.05％叠氮化钠)重悬，4℃保存。

(2)金标结合物垫的制备

用xyz-3000三维喷膜仪把4％的bsa溶液以8μl/cm的量喷在玻璃纤维棉上，使用干燥箱42℃干燥50min，再把金标记抗体以6μl/cm的量喷在玻璃纤维棉上，干燥箱42℃干燥50min，真空干燥保存。

2、偶联抗原羊抗兔包被纤维素膜

用xyz-3000三维喷膜仪把浓度为1mg/ml的包被抗原(bhc-hs-bsa)以1.2μl/cm的量喷在纤维素膜的偏下侧，作为检测线。用xyz-3000三维喷膜仪把浓度为120μg/l的羊抗兔igg以1.2μl/cm的量喷在纤维素膜的偏上侧，作为对照线，两线间隔10mm。

3、快速试纸条的组装

把纤维素膜4粘贴在衬板1中间部位上，吸水垫7粘贴在纤维素膜4上侧和纤维素膜4重叠1mm。金标结合物垫3粘贴在纤维素膜4下方重叠1mm。样品垫2粘贴在金标结合物垫3下方重叠2mm。组装好的试纸板用斩切机切成3.08mm宽的试纸条。图5为丙环唑农药胶体金快速检测试纸条的侧面结构示意图；图6丙环唑农药胶体金快速检测试纸条的俯瞰结构示意图；其中：1、衬板；2、样品垫；3、金标结合垫；4、纤维素膜；5、隐形检测线；6、隐形对照线；7、吸水垫；8-1、样品浸入端保护膜；8-2、手柄端保护膜；9、标识线。

当待测样品溶液加入试纸条或试纸卡测试端后，待测溶液通过虹吸作用带动待测物及金标结合物垫3中的金标抗体一起向纤维素膜4扩散，并最终渗入吸水垫7端。在扩散过程中，如果样品中有待测物时，待测物和金标抗体结合，进而占据了金标抗体上的抗原结合点，阻止金标抗体与纤维素膜4上隐形检测线5(半抗原与载体蛋白的结合物)的结合，使隐形检测线5不显色或者显色很弱即表示检测样品阳性或者弱阳性；如果样品中没有待测样品时，金标抗体在上移过程中，遇隐形检测线5显示一条清晰红线即表示检测样品阴性。同样，金标抗体也与纤维素膜4上的隐形对照线6(羊抗兔igg)结合，使隐形对照线6显红色。隐形对照线6颜色的有或无分别表示此试纸条的有效或无效。

实施例8丙环唑胶体金快速检测试纸条对样品的检测

1、对蔬菜样品的检测

(1)检测样品液的制备

蔬菜样品溶液的预处理。称取10g样品，匀浆后移入50ml离心管中，加入20ml甲醇，涡旋3min，超声提取10min，4000rpm离心5min，取1ml上清液用工作缓冲液(pbs)稀释一定倍数后测定溶液中丙环唑农药含量。

(2)检测及结果判断

如图7所示：将胶体金检测试纸条样品端插入以上预处理的待检测样品中，插入深度不超过标识线9，待测溶液通过虹吸作用带动待测物及金标结合物垫3中的金标抗体一起向纤维素膜4扩散，并最终渗入吸水垫7端。在扩散过程中，如果样品中的待测物能够阻止金标抗体与纤维素膜4上隐形检测线5(半抗原与载体蛋白的结合物)的结合，使隐形检测线5不显色即表示检测样品为阳性(如图7c)；如果样品中的待测物阻止部分金标抗体与纤维素膜4上隐形检测线5的结合，使隐形检测线5显示很弱的红色即表示检测样品为弱阳性(如图7b)；如果样品中待测物不能阻止金标抗体与纤维素膜4上隐形检测线5的结合，使隐形检测线5显示一条清晰红线即表示检测样品为阴性(如图7a)。同样，金标抗体也与纤维素膜4上的隐形对照线6(羊抗兔igg)结合，使隐形对照线6显红色，隐形对照线6颜色的有或无分别表示此试纸条的有效或无效(如图7a、b、c为有效d、e为无效)。3-5分钟判定检测结果。

以200μl的加药蔬菜样品的提取液测试试纸条的灵敏度，结果如图8所示，通过目视观察，丙环唑检测试纸条(图8)的可视检测线为20ng/ml,可视检测限lod明显低于国家标准中丙环唑最大残留限量(部分蔬菜为0.05mg/kg)，实验结果表明，该方法具有检测速度快、直观、操作方便等优点。

2、稳定性试验

将试纸条放入铝铂袋中真空包装，并且室温保存，3个月后各项指标均稳定，即灵敏度基本不变，检测显色深度均一，反应结果一致。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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