从木姜叶柯中提取三叶苷和根皮苷的方法与流程

本发明涉及从植物中提取三叶苷和根皮苷的方法，尤其涉及从木姜叶柯叶中提取三叶苷和根皮苷的方法，属于木姜叶三叶苷和根皮苷的提取领域。

背景技术：

木姜叶柯(lithocarpuslitseifolius(hance)chun)，别名甜茶，是一种活性成分丰富的天然植物。其中，黄酮是甜茶的主要化学成分组成之一，主要有根皮苷与三叶苷，属于甜茶黄酮中的二氢查尔酮类物质，具有很高的开发价值。据报道，木姜叶柯三叶苷和根皮苷具有降血糖、抗氧化、抗癌、抗衰老等功效，并安全无毒，极具健康功能应用价值。

迄今为止，有关甜茶三叶苷和根皮苷的提取方法的研究报道较少。其中，公开号为cn108948104a的中国专利公开了了一种从木姜叶柯中提取三叶苷的加热回流工艺，该方法存在生产周期长、工艺复杂、成本高等缺点；公开号为cn110143988a的中国专利公开了一种吸附法从甜茶中提取三叶苷的方法，该方法主要存在成本高、纯度低等问题；公开号为cn109134557a的中国专利公开了一种采用索氏回流提取甜茶根皮苷的方法，该方法存在的主要缺点是：提取次数多，温度高，易造成损失；公开号为cn106220693a的中国专利公开了一种超声提取甜茶根皮苷的方法，该方法的主要缺点是耗时过长。

综上可见，现有的甜茶三叶苷和根皮苷的提取方法均不同程度的存在诸如提取时间过长、有机溶剂消耗大、成本高、收率低、纯度低等诸多缺陷。因此，目前甜茶三叶苷和根皮苷的提取工艺还待进一步研究和改进。

技术实现要素：

本发明的主要目的是提供一种从木姜叶柯中提取三叶苷和根皮苷的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种从木姜叶柯中提取三叶苷和根皮苷的方法，包括：(1)将木姜叶柯叶进行处理得到木姜叶柯叶粉；(2)木姜叶柯叶粉与乙醇水溶液混合，在超声条件下进行三叶苷和根皮苷的提取；(3)提取液离心，取上清，即得。

作为一种优选的具体实施方式，步骤(1)中所述的处理方法包括：将木姜叶柯叶烘干、粉碎、过筛得到木姜叶柯叶粉；其中，所述的烘干温度优可以为40-60℃，优选为50℃；所述粉碎可以是将烘干的木姜叶柯叶在研磨机中在10000-20000rpm的转速下研磨0.5-5min；优选的，所述的是粉碎是将烘干的木姜叶柯叶在研磨机中在17800rpm的转速下研磨1min；所述过筛可以过40-100目筛，优选为过80目筛。

作为一种优选的具体实施方式，按照g:ml计，步骤(2)中木姜叶柯叶粉与乙醇水溶液的比例优选是1:(10～50)，更优选为1:(10～25)，最优选为1:(20～22)。

作为一种优选的具体实施方式，本发明中所述的乙醇水溶液的浓度可以为40～80％(v/v)，最优选为67-70％。

作为一种优选的具体实施方式，步骤(2)中所述的超声提取的时间可以为10-50min，优选为10-25min，最优选为20-25min。

作为一种优选的具体实施方式，步骤(2)中所述的超声条件中的超声提取功率可以为270-630w，优选为450w。

另外，步骤(2)中超声提取可以在室温下进行超声提取，譬如可以在10-35℃的温度下进行超声提取，所述超声模式为超1s停1s。

本发明根据超声条件下进行三叶苷和根皮苷的提取时所筛选出的4个影响甜茶三叶苷和根皮苷含量的因素，即乙醇浓度、茶粉与乙醇溶剂的料液比、超声功率及时间，进行单因素试验。以甜茶三叶苷和根皮苷含量为指标，单因素试验结果表明：乙醇浓度为70％，料液比为1:20，超声功率为450w，提取时间为20min时，甜茶三叶苷和根皮苷含量高。

根据上述单因素试验结果，保持提取功率450w，选取对甜茶三叶苷和根皮苷含量影响较显著的三个因素乙醇浓度(x1)、提取料液比(x2)和提取时间(x3)为自变量，以甜茶三叶苷和根皮苷含量为评价指标(y)，采用box-benhnken实验设计三因素三水平的分析试验。根据试验结果可见当乙醇浓度为69.09％，液料比为17.86v/w，提取时间为18.44min时，提取物的甜茶三叶苷和根皮苷的含量最高；根据提取工艺考察结果并结合生产实际，本发明确定超声提取时的最优提取工艺为：乙醇浓度为70％，料液比为1：20:(g/ml)，提取时间为20min；按照上述提取工艺各制备了3批甜茶三叶苷和根皮苷进行验证实验，验证三叶苷和根皮苷测量值为162.93±5.92μmolmg/g和32.76±2.11mg/g与乙醇浓度为69.09％，料液比1：17.86v(g/ml)，提取时间为18.44min时，三叶苷和根皮苷含量的试验值162.296mg/g和33.9679mg/g接近，验证结果，充分证明了所得甜茶提取液三叶苷和根皮苷含量高，抗氧化活性强。

本发明的从木姜叶柯中提取三叶苷和根皮苷的方法与现有的提取技术相比，主要具有如下的显著效果：

(1)本发明方法显著降低了液料比和乙醇浓度，减少了有机溶剂的使用，从根本上解决了甜茶三叶苷和根皮苷有机溶剂的大量使用所带来的高成本、高危害及高污染等一系列问题。

(2)缩短了提取时间，提高了提取效率，从根本上解决了甜茶三叶苷和根皮苷一般提取技术生产周期长的问题。

(3)与常规提取方法相比，本发明方法操作简单。

(4)与常规提取方法相比，本发明方法提高了三叶苷和根皮苷的提取量，降低了后期纯化的难度。

(5)通过本发明制备方法得到的甜茶三叶苷和根皮苷含量高，抗氧化活性强，经试验证明，本发明的甜茶三叶苷含量、根皮苷含量、三叶苷抗氧化值和根皮苷抗氧化值比无超声辅助(浸泡法)提取的甜茶分别高出63.30％、47.28％、39.40％、13.27％。

总之，本发明甜茶三叶苷和根皮苷的提取方法显著降低了液料比和乙醇浓度，缩短了提取时间，减少了有机溶剂的使用量；采用本发明提取方法所得到的提取物中甜茶三叶苷含量大于162.93mg/g，根皮苷含量大于32.76mg/g，三叶苷抗氧化值大于53.29％，根皮苷抗氧化值大于42.90％。所得到的提取物中甜茶三叶苷和根皮苷含量高，抗氧化活性强，在提取效率得到极大提高的情况下，提高了三叶苷和根皮苷的抗氧化值，具备实际推广应用价值。

附图说明

图1超声提取与无超声提取三叶苷和根皮苷的含量和抗氧化值对比。

图2三叶苷标准曲线图。

图3根皮苷标准曲线图。

图4乙醇浓度对甜茶三叶苷和根皮苷含量的影响图。

图5料液比对甜茶三叶苷和根皮苷含量的影响图。

图6超声功率对甜茶三叶苷和根皮苷含量的影响图。

图7提取时间对甜茶三叶苷和根皮苷含量的影响图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1本发明甜茶三叶苷和根皮苷的提取(小试)

取木姜叶柯嫩叶(甜茶)，50℃烘干，于17800rpm的转速下研磨1min，过80目筛，得到茶粉，并将其密封于干燥的容器中，4℃下保存待用；将1g样品粉末放入烧杯中，并与20ml乙醇水溶液(70％)混合，室温(25℃)超声提取20min后，收集上清得提取液，所述的超声功率为450w。

将得到的提取液稀释200倍，所得稀释样品用hplc测定甜茶三叶苷和根皮苷的含量，再用dpph-spiking法测抗氧化活性。测定结果:三叶苷和根皮苷的含量分别为162.93±9.321mg/g，32.76±4.419mg/g；抗氧化值分别为53.29±0.116％，42.90±0.516％。

实施例2本发明甜茶三叶苷和根皮苷的提取(小试)

取木姜叶柯嫩叶(甜茶)，50℃烘干，于17800rpm的转速下研磨1min，过80目筛，得到茶粉，并将其密封于干燥的容器中，4℃下保存待用；将1g样品粉末放入烧杯中，并与20ml乙醇水溶液(40％)混合，室温(25℃)超声提取10min后，收集上清得提取液，所述的超声功率为270w。

将得到的提取液稀释200倍，所得稀释样品用hplc测定甜茶三叶苷和根皮苷的含量，再用dpph-spiking法测抗氧化活性。测定结果:三叶苷和根皮苷的含量分别为136.58±0.02mg/g，29.31±0.03mg/g。

实施例3本发明甜茶三叶苷和根皮苷的提取(小试)

取木姜叶柯嫩叶(甜茶)，50℃烘干，于17800rpm的转速下研磨1min，过80目筛，得到茶粉，并将其密封于干燥的容器中，4℃下保存待用；将1g样品粉末放入烧杯中，并与20ml乙醇水溶液(70％)混合，室温(25℃)超声提取30min后，收集上清得提取液，所述的超声功率为450w。

将得到的提取液稀释200倍，所得稀释样品用hplc测定甜茶三叶苷和根皮苷的含量，再用dpph-spiking法测抗氧化活性。测定结果:三叶苷和根皮苷的含量分别为142.51±0.15mg/g，30.21±0.03mg/g。

实施例4本发明甜茶三叶苷和根皮苷的提取(小试)

取木姜叶柯嫩叶(甜茶)，50℃烘干，于17800rpm的转速下研磨1min，过80目筛，得到茶粉，并将其密封于干燥的容器中，4℃下保存待用；将1g样品粉末放入烧杯中，并与20ml乙醇水溶液(60％)混合，室温(25℃)超声提取10min后，收集上清得提取液，所述的超声功率为270w。

将得到的提取液稀释200倍，所得稀释样品用hplc测定甜茶三叶苷和根皮苷的含量，再用dpph-spiking法测抗氧化活性。测定结果:三叶苷和根皮苷的含量分别为157.68±0.13mg/g，32.00±0.05mg/g。

实施例5本发明甜茶三叶苷和根皮苷的提取(小试)

取木姜叶柯嫩叶(甜茶)，50℃烘干，于17800rpm的转速下研磨1min，过80目筛，得到茶粉，并将其密封于干燥的容器中，4℃下保存待用；将1g样品粉末放入烧杯中，并与20ml乙醇水溶液(70％)混合，室温(25℃)超声提取10min后，收集上清得提取液，所述的超声功率为630w。

将得到的提取液稀释200倍，所得稀释样品用hplc测定甜茶三叶苷和根皮苷的含量，再用dpph-spiking法测抗氧化活性。测定结果:三叶苷和根皮苷的含量分别为158.9±0.46mg/g，30.12±0.12mg/g。

对比实施例1

取木姜叶柯嫩叶(甜茶)，50℃烘干，于17800rpm的转速下研磨1min，过80目筛，得到茶粉，并将其密封于干燥的容器中，4℃下保存待用；按照提取料液比1：20w/v，时间20min，乙醇浓度70％的提取条件，用无超声辅助(浸泡法，浸泡20min)提取甜茶三叶苷和根皮苷，此时甜茶三叶苷和根皮苷的含量和抗氧化值为103.55±0.118mg/g，23.40±1.38mg/g，37.21±0.43％，32.54±0.11％。无超声辅助(浸泡法)比超声辅助提取甜茶的三叶苷和根皮苷的含量和抗氧化值分别降低了36.44％、28.57％、39.40％、13.27％。

对比实施例2

取木姜叶柯嫩叶(甜茶)，50℃烘干，于17800rpm的转速下研磨1min，过80目筛，得到茶粉，并将其密封于干燥的容器中，4℃下保存待用；采用索氏回流提取甜茶三叶苷和根皮苷，提取工艺参数为：提取温度80℃，提取液料比30:1v/w，提取时间20min，乙醇浓度70％。此时甜茶三叶苷和根皮苷的含量和抗氧化值133.55±0.118mg/g，28.40±1.38mg/g，33.21±0.43％，30.54±0.11％。索氏回流提取法比超声辅助提取甜茶的三叶苷和根皮苷的含量和抗氧化值分别降低了18.03％、13.30％、43.12％、22.03％。

实施例2本发明甜茶三叶苷和根皮苷的提取(中试)

取木姜叶柯嫩叶(甜茶)适量，50℃烘干，于17800rpm的转速下研磨2min，过80目筛，得到茶粉，并将其密封于干燥的容器中，4℃下保存待用；将200g样品粉末与4l乙醇水溶液(60％)混合，于50℃下超声提取25min后，将混合物用流水冷却，并收集上清得提取液，所述的超声功率为270-630w。提取液稀释200倍，所得稀释样品用hplc法测定甜茶三叶苷和根皮苷含量，再用dpph-spiking法测抗氧化活性，甜茶三叶苷和根皮苷的含量和抗氧化值分别为148.56±0.918mg/g，29.26±1.38mg/g，55.23±0.11％，47.91％。

试验例1甜茶三叶苷和根皮苷的提取工艺优化试验

1、提取和分析方法

(1)取木姜叶柯嫩叶(甜茶)，50℃烘干，于17800rpm的转速下研磨1min，过80目筛，得到茶粉，并将其密封于干燥的容器中，4℃下保存待用。

(2)将步骤(1)得到的所述茶粉1g放入烧杯中，并与不同浓度和体积的乙醇水溶液混合。在室温(25℃)下，用能量积累探针式超声仪对甜茶样品进行提取(直径8mm的超声探头在烧杯中居中，以确保每次处理时头部底部距离液位1.0-1.5cm)。超声提取在超声功率水平(270w、360w、450w、540w和630w)、超声时间(10min、20min、30min、40min和50min)下进行。在一定的功率和时间组合下，采用1s运行1s停止的间隙模式进行处理。每个实验处理重复三次。收集上清液用于后续实验。

(3)色谱条件：agilentzorbaxeclipsexdb-c18(4.6×250mm,μ5m)色谱柱子，以0.1％甲酸水溶液(a)-乙腈(b)为流动相，流动相比例0～10min：5％～25％b；10～15min：25％～30％b；15～20min：30％～95％b；20～25min：95％～95％b；25～30min：95％～5％b；30～35min：95％～5％b。流速为1ml/min，柱温为30℃，进样量20μl；在280nm波长处进行hplc检测。

(4)三叶苷和根皮苷标准系列溶液的配制：精密称取0.002g三叶苷和根皮苷分别溶于1ml甲醇(50％)中，得到浓度为200μg/ml的三叶苷和根皮苷标准储备液，随后，分别移取不同体积三叶苷和根皮苷标准储备液至2ml离心管中，并用甲醇(50％)将所有体积补足至刻度，获得浓度不同的三叶苷和根皮苷标准系列溶液，于室温下保存待用。

(5)三叶苷和根皮苷标准曲线的绘制：分别取2ml不同浓度的三叶苷和根皮苷标准品，过0.22μm滤膜，进hplc分别于280nm波长下测定峰面积；同时，以2ml双蒸水代替三叶苷和根皮苷标准溶液，按上述方法进行空白实验。最终制作三叶苷和根皮苷的浓度标准曲线(如图2所示)，得到线性回归方程，表明三叶苷和根皮苷标准品均在10-120μg/ml的范围内呈现良好的线性关系。

(6)甜茶提取液中三叶苷和根皮苷的含量测定：分别取2ml稀释的样品，过0.22μm滤膜，随即进hplc，于280nm波长下测定峰面积；同时，以0.5ml双蒸水代替三叶苷和根皮苷标准溶液，按上述方法进行空白实验；)根据三叶苷和根皮苷浓度标准曲线计算甜茶提取液三叶苷和根皮苷含量，公式如下：

三叶苷含量(mg/g茶粉干重)＝10^-3*(a-1.3685)*n*v/42.331/m，其中，a为样品峰面积(mau)，n为稀释倍数，v为甜茶提取液体积(ml)，m为甜茶粉干重(g)，三叶苷含量表示为mg/gdw；

根皮苷含量(mg/g茶粉干重)＝10^-3*(a+20.171)*200*v/35.493/m，其中，a为样品峰面积(mau)，n为稀释倍数，v为甜茶提取液体积(ml)，m为甜茶粉干重(g)，根皮苷含量表示为mg/gdw；

2、甜茶三叶苷和根皮苷提取工艺优化

(1)根据前期研究结果筛选出4个影响甜茶三叶苷和根皮苷含量的因素，包括乙醇浓度、茶粉与乙醇溶剂的料液比、超声功率及时间，进行单因素试验。以甜茶三叶苷和根皮苷含量为指标，每次处理重复三次。

单因素试验结果表明：乙醇浓度为70％(如图4所示)，料液比为1:20(如图5所示)，超声功率为450w(如图6所示)，提取时间为20min(如图7所示)时，甜茶三叶苷和根皮苷含量高。

(2)根据上述单因素试验结果，保持提取功率450w，选取对甜茶三叶苷和根皮苷含量影响较显著的三个因素乙醇浓度(x1)、提取料液比(x2)和提取时间(x3)为自变量，以甜茶三叶苷和根皮苷含量为评价指标(y)，采用box-benhnken实验设计三因素三水平的分析试验，试验设计因素与水平如表1所示，实验设计方案与结果如表2所示。

表1试验设计因素与水平

表2实验设计与结果

从表2的试验结果可知：当乙醇浓度为67.53％，液料比为21.96v/w，提取时间为20.92min时，提取物的甜茶三叶苷和根皮苷的含量最高。

(3)dpph工作溶液：称取0.01gdpph完全溶解于20ml甲醇中，得0.05mg/ml的dpph甲醇溶液。

(4)dpph-spiking法测三叶苷和根皮苷的抗氧化值：取1ml最优提取工艺下的稀释提取液加入0.5mldpph工作液，混合均匀，避光反应6min，进hplc，测定280nm波长处的峰面积。抗氧化值表示为色谱峰面积消减率。

抗氧化值(％)＝(a1-a2)/a1*100，其中，a1为提取液峰面积(mau)，a2为提取液与dpph工作溶液的反应液峰面积(mau)

3、提取工艺验证实验

根据提取工艺考察结果，结合生产实际，确定最优提取工艺为乙醇浓度为70％，料液比为1：20:(g/ml)，提取时间为20min；按照上述提取工艺各制备了3批甜茶三叶苷和根皮苷进行验证实验，验证三叶苷和根皮苷测量值为162.93±5.92μmolmg/g和32.76±2.11mg/g与乙醇浓度为69.09％，料液比1：17.86v(g/ml)，提取时间为18.44min时，三叶苷和根皮苷含量的试验值162.296mg/g和33.9679mg/g接近。验证结果，充分证明了所得甜茶提取液三叶苷和根皮苷含量高，抗氧化活性强。

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