1,2,4三唑并4,3-B哒嗪衍生物在制备抗炎症因子风暴药物中的应用的制作方法

本发明医药技术领域，更具体地，涉及1,2,4三唑并4,3-b哒嗪衍生物在制备抗炎症因子风暴药物中的应用。

背景技术：

炎症因子和细胞因子是重要的体液免疫分子，其能调节免疫细胞和器官的各种生理功能帮助机体抵抗外来物质。正常情况下，炎症因子和细胞因子的表达受到细胞的严格调控，然而病毒感染或某些药物副作用等因素会引起细胞炎症因子调控机制紊乱，从而使得炎症因子过量产生导致炎症因子风暴。炎症因子风暴，也叫“细胞因子风暴”或“高细胞因子血症”，是一种严重的全身性炎症反应。这种反应表现为多种细胞因子在短时间内大量分泌，导致人体发热、呼吸困难、组织和器官严重损伤等症状，严重者甚至会发生多器官功能衰竭，甚至死亡。发生炎症因子风暴的患者体内往往c反应蛋白（crp）和红细胞沉降率（esr）升高。严重者d-二聚体升高、外周血淋巴细胞进行性减少。il-2、il-7、il-6、il-10、gm-csf、ip10、mcp1、mip1a、ccl2、tnf-α和vegfα等也显著高于正常值。

炎症因子风暴是一种严重的急性免疫系统疾病，往往导致多组织和器官迅速衰竭以及死亡，因此快速地抑制炎症因子风暴对于挽救患者生命具有重要作用。然而目前可用于抗炎症因子风暴的药物十分有限，多采用给予抗感染药物、糖皮质激素辅助等非特异性联合治疗措施。虽然糖皮质激素能非特异性地抑制炎症因子风暴，但其使用具有较大的副作用，长期使用容易引起二重感染、糖尿病、骨质疏松、高血压和骨坏死等副作用。近年来单抗类药物也被用于抗炎症因子风暴（例如il-6r受体单抗及gm-csf单抗），然而单抗类药物也具有一定副作用，并且其高昂的用药成本对患者家庭及医保体系都造成了严重负担。为此，开发新型高效、廉价的抗炎症因子风暴药物对于挽救患者生命具有重要意义。

技术实现要素：

本发明第一个方面的目的，在于提供1,2,4三唑并4,3-b哒嗪衍生物在制备抗炎症因子风暴药物中的应用。

本发明第二个方面的目的，在于提供。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物在制备抗炎症因子风暴药物中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物为式（i）所示化合物、其药学上可接受的盐或多晶型物；

（i）。

进一步地，根据本发明第一个方面所述的应用，所述炎症因子为上皮细胞和/或免疫细胞中的炎症因子。

进一步地，根据本发明第一个方面所述的应用，所述炎症因子包括il-1ra、il-1α、il-1β、il-6、il-10、il-18、il-22、ip-10、ccl2、gm-csf和tnf-α中的至少一种。

本发明的第二个方面，提供[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物在制备炎症因子抑制剂中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物为式（i）所示化合物、其药学上可接受的盐或多晶型物；

（i）。

进一步地，根据本发明第二个方面所述的应用，所述炎症因子为上皮细胞和/或免疫细胞中的炎症因子

进一步地，根据本发明第二个方面所述的应用，所述炎症因子包括il-1ra、il-1α、il-1β、il-6、il-10、il-18、il-22、ip-10、ccl2、gm-csf和tnf-α中的至少一种。

本发明的第三个方面，提供一种抗炎症因子风暴的药物，包括式（i）所示[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物、其药学上可接受的盐或多晶型物；

（i）。

进一步地，根据本发明第三个方面所述的药物，还包括药学上可接受的辅料。

优选地，根据本发明第三个方面所述的药物，所述药物的剂型为口服剂、注射剂。

式（i）所示[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物（c1632）为已知的小分子药物，能溶于水或者dmso，热稳定性良好，细胞毒性低，药物安全性好，具有良好的药代动力学特性，通过口服、肌肉注射和静脉注射等多种方式灵活给药。

本发明的第四个方面，提供一种炎症因子的抑制剂，包括式（i）所示[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物、其药学上可接受的盐或多晶型物；

（i）。

优选地，根据本发明第四个方面所述的抑制剂，所述炎症因子包活il-1ra、il-1α、il-1β、il-6、il-10、il-18、il-22、ip-10、ccl2、gm-csf和tnf-α中的至少一种。

本发明的有益效果是：

本发明提供了式（i）所示[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物（c1632）、其药学上可接受的盐或多晶型物在制备抗炎症因子风暴药物中的应用。炎症因子风暴是临床上一类常见的急性免疫系统紊乱，多种因素都能导致炎症因子风暴的发生。针对炎症因子风暴具有极高的致死率、极高的至残率并且缺乏安全、有效、廉价的临床药物这一现状，提供了小分子化合物c1632的一种全新的应用，即将c1632作为抗炎症因子风暴药物，为炎症因子风暴的治疗提供了新的思路、靶点和小分子药物。c1632药物具有较好的药物安全性和较强的炎症因子抑制效果，可以作为抗炎症因子风暴的候选药物。

c1632为已知的小分子药物，能溶于水或者dmso，热稳定性良好，细胞毒性低，药物安全性好，具有良好的药代动力学特性，通过口服、肌肉注射和静脉注射等多种方式灵活给药。c1632药物具有较好的药物安全性和较强的炎症因子抑制效果，可以作为抗炎症因子风暴的候选药物。

本发明还提供了式（i）所示[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物（c1632）、其药学上可接受的盐或多晶型物在在制备炎症因子抑制剂中的应用，能广谱抑制上皮细胞和免疫细胞中的炎症因子的表达，尤其是能够抑制形成炎症因子风暴的关键因子il-1ra、il-1α、il-1β、il-6、il-10、il-18、il-22、ip-10、ccl2、gm-csf、和tnf-α等的表达和分泌。

附图说明

图1c1632抑制多种炎症因子的表达。（a）c1632能抑制thp1细胞炎症反应中il-1β、il-6、il-8、ccl2、gm-csf和vegfα的mrna水平；thp1分化为巨噬细胞后用240μm的c1632处理2天，接着qrt-pcr检测炎症因子的表达水平。（b）c1632能抑制pbmc细胞炎症反应中il-1β、il-6、il-8、ccl2、gm-csf、tnf-α和vegfα的mrna水平；c1632处理pbmc细胞1天后，加lps刺激，随后用qrt-pcr检测il-6和ccl2的表达水平。

图2lps和tnf-α能刺激thp1和pbmc细胞炎症反应。用于说明lps和tnf-α可以刺激thp1(a)和pbmc(b)细胞表达炎症因子。（a）lps和tnf-α可以刺激thp1细胞表达炎症因子。（b）lps和tnf-α可以刺激pbmc细胞表达炎症因子。thp1衍生的巨噬细胞和pbmc细胞分别用lps和tnf-α处理后qrt-pcr检测炎症因子的表达水平。

图3c1632浓度对lps和tnfα刺激thp1和pbmc细胞炎症因子表达的影响。用于说明c1632的浓度对thp1和pbmc细胞炎症因子表达的影响。qrt-pcr检测不同浓度c1632处理过的thp1细胞（a，b）和pbmc细胞（c，d）分别在lps和tnf-α刺激下各炎症因子的表达水平。

具体实施方式

下面结合具体实施例与附图进一步说明本发明的技术方案。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的试剂原料。除非特别说明，下述实施例中使用的系统为本领域常规使用的设备。

实验材料：

人类肝癌细胞株huh-7、人白血病细胞株thp1、人胚肾上皮细胞hek293t、肺腺癌细胞株a549，均购自中国典型物种保藏中心（ctcc）。

pbmc细胞购自雷德贝尔。

[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物c1632由本实验室合成，其结构式如式（i）所示：

（i）。

合成路径如下所示：

c1632为已知的小分子药物，能溶于水或者dmso，热稳定性良好，细胞毒性低，药物安全性好，具有良好的药代动力学特性，通过口服、肌肉注射和静脉注射等多种方式灵活给药。

实施例1c1632抑制多种炎症因子的表达

发明人团队用c1632处理a549、huh-7、thp1和pbmc细胞，检测c1632对hek293t、a549、huh-7中炎症因子表达水平的影响：细胞以2×10⁶/孔，铺6孔板，每孔2mldmem完全培养基，次日加240μmc1632处理48h，用trizol裂解细胞提取rna，进行qrt-pcr分析。

c1632处理thp1细胞：thp1细胞按5×10⁵每孔种12孔板，每孔1mlprmi1640完全培养基，种板同时加入终浓度为100ng/μl的pma诱导细胞分化。次日，将培养基更换为新鲜培养基并加入c1632处理2天。加入终浓度为100ng/ml的lps或tnf-α刺激8~12h，收集细胞培养上清进行luminex分析（由金域诊断公司完成），细胞用trizol裂解提取rna进行qrt-pcr分析，结果如附图1所示。

结果显示，c1632处理能显著下调a549、huh-7、thp1和pbmc（图1中a，b，c，d）中il-1β、il-6、il-8、ccl2、gm-csf和vegfα的mrna水平。值得注意的是c1632能抑制a549和huh-7细胞中tnf-α的表达，但不能抑制免疫来源的细胞thp1和pbmc细胞中tnf-α的表达。虽然c1632不能抑制免疫细胞分泌tnf-α但是在c1632存在的情况下tnf-α也无法诱发thp1和pbmc细胞il-6和il-8等炎症因子的升高，这表明c1632存在的情况下tnf-α的促炎症活性被阻断。

为了进一步阐明c1632能够调控哪些炎症因子的蛋白表达，发明人团队通过用lps刺激c1632预处理过的thp1细胞，接着取细胞培养上清通过luminex技术高通量检测c1632所调控的炎症因子（如表1所示），结果表明c1632处理能显著降低il-10、ip-10、il-1ra、ccl2、il-6、il-18、il-1β、gm-csf、il-1α和il-22等炎症因子的表达水平，这进一步证明了c1632对炎症因子风暴的抑制作用。

lps和tnf-α能刺激thp1和pbmc细胞炎症反应

为了进一步研究c1632对炎症的调控作用，发明人团队构建了细胞炎症模型。采用lps和tnf-α刺激thp1（图2中a）和pbmc（图2中b）细胞后发现，细胞中的il-1β、il-6、il-8、ccl2、gm-csf、tnf-α和vegfα等炎症因子受到刺激后表达水平显著升高。这表明lps和tnf-α刺激thp1和pbmc细胞能作为细胞炎症模型。

c1632浓度对lps和tnfα刺激thp1和pbmc细胞炎症因子表达的影响

为了进一步明确c1632抗炎症因子表达的有效浓度，发明人团队采用一系列浓度的c1632处理thp1（图3中a和b）和pbmc（图3中c和d）细胞，再分别给予lps和tnf-α刺激。

结果表明7.5μm的c1632就可以有效抑制大多数炎症因子的表达，而随着药物浓度的增加其抑制效果可以进一步增强。

综合以上结果可见，式（i）化合物c1632能有效抑制炎症因子的表达水平，可作为抗炎症因子风暴的药物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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