一种鼠李糖脂的分离纯化方法与流程

2021-02-02 21:02:09|

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本发明属于微生物表面活性剂分离纯化领域，具体涉及一种鼠李糖脂的分离纯化方法。

背景技术：

生物表面活性剂是一种绿色无污染的纯天然表面活性剂，它不仅能发挥和化学表面活性剂相同的功能，同时具有良好的生物包容性、低毒以，甚至作为表面活性剂其发泡效果更优良，也在强碱、极端温度、极端ph等恶劣条件下有良好的应用效果。

鼠李糖脂(rhamnolipid，rha)是目前研究最为广泛的一类微生物表面活性剂，其具有低毒、可生物降解、且不易产生二次污染等优点，被广泛关注。但由于rha生产成本高，售价居高不下，使得目前市场仍以传统的化学表面活性剂为主。对于微生物表面活性剂，其成本主要由发酵成本与分离纯化成本组成，一般来说，分离纯化费用占总成本约60％-80％，因此，发展新型高效的鼠李糖脂分离纯化方法，有利于降低鼠李糖脂成本，增强其市场竞争力。

目前，常用的鼠李糖脂分离纯化方法主要有酸沉降、溶剂提取法、泡沫分离法、超滤法、吸附法与色谱分离法。其中酸沉降与溶剂萃取法联用是目前应用最多的一种纯化方法，但其过程一般涉及大量的有机溶剂，一方面污染环境，另一方面增加成本。泡沫分离法中，发酵菌体量很难得到保证；高成本与地分离效率是超滤法与传统活性炭吸附法中常用的问题。

为了解决上述问题，本发明提供一种鼠李糖脂的分离纯化方法。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供了一种鼠李糖脂的分离纯化方法，其制备的阳离子修饰氧化石墨烯，对鼠李糖脂的吸附量大、选择性好，使脱附后所得鼠李糖脂的纯度大大提高。

为了实现本发明的这些目的和其它优点，本发明提供了一种从发酵液中分离纯化鼠李糖脂的方法，包括以下步骤：

制备氧化石墨烯；

对所述氧化石墨烯进行阳离子修饰，得到阳离子修饰氧化石墨烯；

将所述阳离子修饰氧化石墨烯加入发酵液中进行吸附，得到鼠李糖脂吸附量。

优选的是，所述制备氧化石墨烯包括：

将石墨粉加入浓硫酸和浓磷酸的混合溶液中，降温后加入高锰酸钾，搅拌得到第一混合溶液；

向所述第一混合溶液加入双氧水，抽滤、离心、水洗、干燥后，得到氧化石墨烯。

优选的是，所述对氧化石墨烯进行阳离子修饰，得到阳离子修饰氧化石墨烯包括：

将3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵与naoh水溶液进行反应，得到混合溶液；

将氧化石墨烯加入上述混合溶液中，搅拌、烘干、洗涤、再烘干后，得到阳离子修饰氧化石墨烯。

优选的是，所述3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵与naoh的摩尔比值为0.15-3.35，且1g的所述氧化石墨烯所对应的3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵为7-19mmol。

其中，naoh溶液的浓度为3-18mol/l。

优选的是，所述3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵与naoh的摩尔比为0.3:1.5，且1g的所述氧化石墨烯所对应的3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵为17.2mmol。

优选的是，所述将所述阳离子修饰氧化石墨烯加入发酵液中进行吸附，得到鼠李糖脂包括：

所述鼠李糖脂的发酵液的制备；

将所述阳离子修饰氧化石墨烯加入所述发酵液中，吸附后，得到鼠李糖脂吸附量。

优选的是，所述鼠李糖脂的发酵液的制备包括：

在121℃温度下，将鼠李糖脂发酵培养基灭菌30min，形成无菌环境；

在无菌环境下，吸取铜绿假单胞菌ny3种子液加入发酵培养基中，在31℃，150r/min条件下，恒温振荡培养96h后，将发酵体系置于4℃和8000r/min的离心机中离心，收集上清液，得到所述鼠李糖脂的发酵液。

优选的是，所述将所述阳离子修饰氧化石墨烯加入所述发酵液中，吸附后，得到鼠李糖脂吸附量包括：

将所述阳离子修饰氧化石墨烯加入所述发酵液中，并将其置于恒温水浴中搅拌，每间隔固定时间取上清液，离心去除吸附剂，得到吸附后发酵液；

用硫酸-蒽酮法测定吸附前发酵液中鼠李糖脂浓度和吸附后发酵液中鼠李糖脂浓度的差值，计算鼠李糖脂吸附量。

优选的是，还包括洗脱步骤，具体如下：

选用脱附剂，对阳离子修饰氧化石墨烯吸附的鼠李糖脂进行洗脱，获得鼠李糖脂；

其中，所述脱附剂选择无水乙醇、甲醇及ph为9-13的naoh溶液中的任意一种或者任意两种。

优选的是，所述选用脱附剂，对阳离子修饰氧化石墨烯吸附的鼠李糖脂进行洗脱，获得鼠李糖脂包括：

将吸附有鼠李糖脂的阳离子修饰氧化石墨烯离心、过滤，将其置于60℃烘箱中烘干；

将烘干后的吸附有鼠李糖脂的阳离子修饰氧化石墨烯置于离心管中，加入5ml脱附剂并密封，在25℃的恒温水浴震荡锅中震荡30min，离心、分离上清液和吸附剂；

将上清液干燥处理，除去水分，获得鼠李糖脂。

本发明的有益效果

1、本发明提供的鼠李糖脂的分离纯化方法，其制备的阳离子修饰氧化石墨烯，对鼠李糖脂的吸附量大，选择性良好。

2、本发明提供的鼠李糖脂的分离纯化方法，其大大提高了脱附后鼠李糖脂的纯度，提高分离纯度。

3、本发明提供的鼠李糖脂的分离纯化方法，其工艺简单、且无环境污染。

4、本发明提供的鼠李糖脂的分离纯化方法，其制备的阳离子吸附剂，提高了现有微生物表面活性剂的分离效率。

附图说明

图1为本发明的分离纯化方法的流程图；

图2为自制go与阳离子修饰后go的傅里叶红外光谱；

图3为自制go与阳离子修饰后go的xrd图谱；

图4为阳离子化修饰后go的tem表征；

图5为不同洗脱剂洗脱后阳离子修饰go的重复利用效率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它组合的存在或添加。

本发明提供了一种从发酵液中分离提纯鼠李糖脂的方法，如图1所示，包括以下步骤：

步骤1，制备氧化石墨烯(go)：

101、将石墨粉加入浓硫酸和浓磷酸的混合溶液中，降温后加入高锰酸钾，搅拌得到第一混合溶液；

102、向所述第一混合溶液加入双氧水，抽滤、离心、水洗、干燥后，得到氧化石墨烯。

步骤2，对所述氧化石墨烯进行阳离子修饰，得到阳离子修饰氧化石墨烯(c-go)：

201、将3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵与naoh水溶液进行反应，得到混合溶液；

202、将氧化石墨烯加入上述混合溶液中，搅拌、烘干、洗涤、再烘干后，得到阳离子修饰氧化石墨烯。

步骤3，将所述阳离子修饰氧化石墨烯加入发酵液中进行吸附，得到鼠李糖脂吸附量；

301、所述鼠李糖脂的发酵液的制备；在121℃温度下，将鼠李糖脂发酵培养基灭菌30min，形成无菌环境；

302、在无菌环境下，吸取铜绿假单胞菌ny3种子液加入发酵培养基中，在31℃，150r/min条件下，恒温振荡培养96h后，将发酵体系置于4℃和8000r/min的离心机中离心，收集上清液，得到所述鼠李糖脂的发酵液；

303、将所述阳离子修饰氧化石墨烯加入所述发酵液中，吸附后，得到鼠李糖脂吸附量：将所述阳离子修饰氧化石墨烯加入所述发酵液中，并将其置于恒温水浴锅中搅拌，每间隔固定时间取上清液，离心去除吸附剂，得到吸附后发酵液；用硫酸-蒽酮法测定吸附前发酵液中鼠李糖脂浓度和吸附后发酵液中鼠李糖脂浓度的差值，计算鼠李糖脂吸附量。

还包括洗脱步骤4，具体如下：

401、将吸附有鼠李糖脂的阳离子修饰氧化石墨烯离心、过滤，将其置于60℃烘箱中烘干；

402、将烘干后的吸附有鼠李糖脂的阳离子修饰氧化石墨烯置于离心管中，加入5ml脱附剂并密封，在25℃的恒温水浴震荡锅中震荡30min，离心、分离上清液和吸附剂；

403、将上清液干燥处理，除去水分，获得鼠李糖脂。

其中，所述脱附剂选择无水乙醇、甲醇及ph为9-13的naoh溶液中的任意一种或者任意两种。

其中，鼠李糖脂纯度测量：将上述洗脱液干燥处理，除去水分，获得鼠李糖脂。精确称量一定量鼠李糖脂，加入适量碳酸氢钠的去离子水溶液，使其完全溶解。然后以蒽酮－硫酸法测定溶液中鼠李糖脂含量，通过测量鼠李糖脂浓度与配制鼠李糖脂浓度的比值所得鼠李糖脂的纯度。

本发明还提供了下列实施例，来具体说明本发明的方法和应用。需要说明的是，本申请中发酵鼠李糖脂的铜绿假单胞菌ny3已有的菌种，参见文献：nie,m.,yin,x.,ren,c.,wang,y.,xu,f.,shen,q.,2010.novelrhamnolipidbiosurfactantsproducedbyapolycyclicaromatichydrocarbon-degradingbacteriumpseudomonasaeruginosastrainny3.biotechnoladv28,635-643。

实施例1

一种鼠李糖脂的分离纯化方法，包括以下步骤：

步骤1，制备氧化石墨烯(go)：

将360ml浓硫酸和40ml的浓磷酸加入三口烧瓶中同时持续冰浴搅拌。在缓慢加入3.0g石墨粉并持续搅拌。在控制体系温度低于20℃的条件下慢慢加入18.0g高锰酸钾。添加完成后，将温度升到50℃，搅拌反应12h。反应结束后待体系降温至室温再将其稀释至1l。再向其中加入10ml30％的双氧水，充分混合使其还原至溶液变为明亮的黄色。抽滤，用稀盐酸将滤纸冲洗3次，并离心，使溶液中的硫酸根离子除去。后将产物重复水洗直至上清液ph为7。在60℃的真空干燥箱中将固体烘干，得到go成品；

步骤2，制备阳离子修饰的氧化石墨烯(c-go)：

将17.2mmol3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵(cta)与8.4mol/l的naoh水溶液进行混合，充分搅拌混匀后在室温下反应一定时间。加入1g氧化石墨烯(go)，在室温下搅拌反应1h，然后在60℃的烘箱中反应4h后，纯化得到阳离子修饰的氧化石墨烯(c-go)。

本发明优化合成后，对go和c-go做了一系列表征如下：

自制go与阳离子修饰后go的傅里叶红外光谱，如图2所示，从图2可以观测出阳离子化后的氧化石墨烯的结构中的官能团。与未阳离子化的氧化石墨烯相比，其特征峰如3400cm^-1、1740cm^-1、1621cm^-1、1386cm^-1等代表活性基团的吸收峰仍存在，说明修饰后的go仍含有基本吸附活性基团羧基、羟基、碳碳双键等，但羟基含量明显降低，且增加了非极性的ch2和ch3成分，因此在2902cm^-1和2876cm^-1处出现了新的吸收峰。说明醚化剂与氧化石墨烯发生了反应，甲基丙烯酸羟乙酯基团被成功引入到氧化石墨烯片层表面。

自制go与阳离子修饰后go的xrd图谱，如图3所示，从图3可以看出，阳离子化go的xrd衍射在10.5°出现了特征峰，表现出与go相似的特征峰，表明改性后材料仍然保留了go的完整晶形结构，但是阳离子化go的衍射强度要比go弱，这可能是因为go阳离子化过程对结晶过程有阻碍作用，导致阳离子修饰后go的结构发生了轻微扭曲。

阳离子化修饰后go的tem表征，如图4所示，由图4可以发现，阳离子化修饰后go呈片状结构，图4中可以清晰的看到阳离子化go表面的褶皱。同时不同部位色彩明暗度不同，是由于各部分薄厚不同造成的，较薄的地方透光性较好所以颜色稍浅，可见本实验制得的阳离子化修饰后go片层数较低。

另外，还对go和c-go的比表面积进行了对比，数据如表1,；

表1自制go与阳离子修饰后go的比表面积

由表1可知，阳离子化go的比表面积相对于go略有增加，说明阳离子化过程对比表面积增加有促进作用。一般来说，比表面积越大吸附性能越好。由此可知，阳离子修饰后go的吸附性能要优于氧化石墨烯。

步骤3，a、鼠李糖脂发酵液的制备：

将90ml鼠李糖脂发酵培养基于121℃灭菌30min。在无菌环境下，吸取10ml铜绿假单胞菌ny3种子液加入发酵培养基中。在31℃，150r/min条件下，恒温振荡培养96h后，将发酵体系置于4℃和8000r/min的离心机中离心，收集上清液的即为鼠李糖脂发酵液；

b、c-go对发酵液中鼠李糖脂的吸附：

将烘干后的c-go吸附剂加入发酵液中，终浓度为5g/l，调节鼠李糖脂发酵液ph为4，并将其置于恒温水浴锅中搅拌，每间隔一段时间后取上清液，离心去除吸附剂，用硫酸-蒽酮法测定吸附前后发酵液中鼠李糖脂浓度，计算鼠李糖脂吸附量。

步骤4，将吸附在c-go上的鼠李糖脂进行洗脱：

对于吸附鼠李糖脂的吸附剂，选用乙醇进行洗脱，过离心将吸附有鼠李糖脂的吸附剂通从滤液中分离出来，置于60℃烘箱中烘干。然后将烘干后的吸附剂置于离心管中，加入5ml脱附剂乙醇并密封，在25℃的恒温水浴震荡锅中震荡30min，然后通离心分离上清液和吸附剂。

鼠李糖脂纯度测量：将上述洗脱液干燥处理，除去水分，获得鼠李糖脂。精确称量一定量鼠李糖脂，加入适量碳酸氢钠的去离子水溶液，使其完全溶解。然后以蒽酮－硫酸法测定溶液中鼠李糖脂含量，通过所测鼠李糖脂浓度与配制鼠李糖脂浓度的比值所得鼠李糖脂的纯度。

结果测试表征：

阳离子修饰后，所得c-go的zeta电位为+34.7mv，对发酵液中鼠李糖脂的吸附量达到2.01g/g；洗脱后的鼠李糖脂的纯度为90.2％。与之相比，未阳离子修饰的go对鼠李糖脂的吸附量未1.70g/g；洗脱后的鼠李糖脂的纯度为88.6％。红外谱图表明，c-go仍含有go中的羧基、羟基、碳碳双键等吸附活性基团，但羟基含量明显降低，同时增加了cta中ch2和ch3等特征吸收峰。比表面积也从215.46m²/g增加为223.12m²/g。

按照按照实施例1中步骤4的实验方法，取等量的富集了鼠李糖脂的阳离子修饰go，在25℃时置于不同的洗脱剂中进行洗脱。不同洗脱剂对富集了rha的阳离子化go的洗脱效果如表2所示。由表2可以看出，ph＝13的naoh水溶液的洗脱回收率最大，但洗脱完成后将naoh与鼠李糖脂的分离十分复杂。无水乙醇对阳离子化修饰go的脱附率略低于ph＝13的naoh水溶液，但在工业生产中，后续鼠李糖脂与洗脱剂分离将十分容易，且乙醇价格低，对环境无毒无污染。因此，综合考虑以上几种因素，选择无水乙醇作为最佳洗脱剂。

表2不同洗脱剂对富集了鼠李糖脂的阳离子化go的洗脱效果

实施例2

一种鼠李糖脂的分离纯化方法，包括以下步骤：

步骤1，制备氧化石墨烯(go)：参照实施例1中的步骤1；

步骤2，制备阳离子修饰的氧化石墨烯(c-go)：

将18.4mmol3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵(cta)与8.4mol/l的naoh水溶液进行混合，充分搅拌混匀后在室温下反应一定时间。加入1g氧化石墨烯(go)，在室温下搅拌反应1h，然后在60℃的烘箱中反应4h后，纯化得到阳离子修饰的氧化石墨烯(c-go)。

步骤3，a、鼠李糖脂发酵液的制备与实施例1相同；

b、c-go对发酵液中鼠李糖脂的吸附：

将烘干后的c-go吸附剂加入发酵液中，终浓度为5g/l，调节鼠李糖脂发酵液ph为4，并将其置于恒温水浴锅中搅拌，每间隔一段时间后取上清液，离心去除吸附剂，用硫酸-蒽酮法测定吸附前后发酵液中鼠李糖脂浓度，计算鼠李糖脂吸附量；

结果测试表征：

阳离子修饰后，所得c-go的zeta电位为+6mv，对发酵液中鼠李糖脂的吸附量达到1.80g/g。

实施例3

一种鼠李糖脂的分离纯化方法，包括以下步骤：

步骤1，制备氧化石墨烯(go)：参照实施例1中的步骤1；

步骤2，制备阳离子修饰的氧化石墨烯(c-go)：

将17.7mmol3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵(cta)与17.7mol/l的naoh水溶液进行混合，充分搅拌混匀后在室温下反应一定时间。加入1g氧化石墨烯(go)，在室温下搅拌反应1h，然后在60℃的烘箱中反应4h后，纯化得到阳离子修饰的氧化石墨烯(c-go)。

步骤3，a、鼠李糖脂发酵液的制备与实施例1相同；

b、c-go对发酵液中鼠李糖脂的吸附：

结果测试表征：

阳离子修饰后，所得c-go的zeta电位为-40.6mv，对发酵液中鼠李糖脂的吸附量达到1.66g/g。

实施例4

一种鼠李糖脂的分离纯化方法，包括以下步骤：

步骤1，制备氧化石墨烯(go)：参照实施例1中的步骤1；

步骤2，制备阳离子修饰的氧化石墨烯(c-go)：

将17.2mmol3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵(cta)与10.0mol/l的naoh水溶液进行混合，充分搅拌混匀后在室温下反应一定时间。加入1g氧化石墨烯(go)，在室温下搅拌反应1h，然后在60℃的烘箱中反应4h后，纯化得到阳离子修饰的氧化石墨烯(c-go)。

步骤3，a、鼠李糖脂发酵液的制备与实施例1相同；

b、c-go对发酵液中鼠李糖脂的吸附：

结果测试表征：

阳离子修饰后，所得c-go的zeta电位为+24.3mv，对发酵液中鼠李糖脂的吸附量达到1.74g/g。

实施例5

一种鼠李糖脂的分离纯化方法，包括以下步骤：

步骤1，制备氧化石墨烯(go)：参照实施例1中的步骤1；

步骤2，制备阳离子修饰的氧化石墨烯(c-go)：

步骤3，a、鼠李糖脂发酵液的制备与实施例1相同；

b、c-go对发酵液中鼠李糖脂的吸附：

将烘干后的c-go吸附剂加入发酵液中，终浓度为5g/l，调节鼠李糖脂发酵液ph为3-12，并将其置于恒温水浴锅中搅拌，每间隔一段时间后取上清液，离心去除吸附剂，用硫酸-蒽酮法测定吸附前后发酵液中鼠李糖脂浓度，计算鼠李糖脂吸附量；

结果测试表征：

阳离子修饰后，所得c-go的zeta电位为2.03mv，对发酵液中鼠李糖脂的吸附量随着鼠李糖脂发酵液ph的变化而变化，在ph值为4时，吸附量达到最大，为1.74g/g。

实施例6

一种鼠李糖脂的分离纯化方法，包括以下步骤：

步骤1，制备氧化石墨烯(go)：参照实施例5中的步骤1；

步骤2，制备阳离子修饰的氧化石墨烯(c-go)：参照实施例5中步骤2；

步骤3，a、鼠李糖脂发酵液的制备与实施例5相同；

b、c-go对发酵液中鼠李糖脂的吸附：

将烘干后的c-go吸附剂加入发酵液中，终浓度为2-16g/l，调节鼠李糖脂发酵液ph为4，并将其置于恒温水浴锅中搅拌，每间隔一段时间后取上清液，离心去除吸附剂，用硫酸-蒽酮法测定吸附前后发酵液中鼠李糖脂浓度，计算鼠李糖脂吸附量；

结果测试表征：

阳离子修饰后，所得c-go的zeta电位为+24.3mv，对发酵液中鼠李糖脂的吸附量随着发酵液中鼠李糖脂初始浓度的变化而变化，在鼠李糖脂初始浓度为14g/l时，吸附量达到最大，为2.11g/g。

本发明还提供了对比试验a，对比实验a为未修饰的氧化石墨烯对发酵液中的鼠李糖脂进行吸附。

试验a包括以下步骤：

一种鼠李糖脂的分离纯化方法，按照实施例1中步骤，具体步骤与实施例1的如下步骤相同：

步骤1，制备氧化石墨烯(go)；

步骤2，a、鼠李糖脂发酵液的制备；

b、go对发酵液中鼠李糖脂的吸附；

步骤3，将吸附在go上的鼠李糖脂进行洗脱。

结果测试表征：

阳离子修饰后，所得c-go的zeta电位为+34.7mv，对发酵液中鼠李糖脂的吸附量达到2.01g/g；洗脱后的鼠李糖脂的纯度为90.2％。与之相比，未阳离子修饰的go对鼠李糖脂的吸附量为1.70g/g；洗脱后的鼠李糖脂的纯度为88.6％。红外谱图表明，c-go仍含有go中的羧基、羟基、碳碳双键等吸附活性基团，但羟基含量明显降低，同时增加了cta中ch2和ch3等特征吸收峰。比表面积也从215.46m²/g增加为223.12m²/g。

另外，本发明还对自制氧化石墨烯洗脱再生后对鼠李糖脂的吸附效率及重复利用性进行了测试，实验方法如下：

量取100ml12g/l鼠李糖脂发酵液置于250ml锥形瓶中以120r/min的速度进行恒温水浴震荡，投入0.5g的吸附剂(5g/l)吸附2min后离心，用不同洗脱剂进行脱附烘干，再进行吸附，如此反复进行6次，测量每次go对鼠李糖脂的吸附量。

将吸附后的阳离子化氧化石墨烯经不同洗脱剂处理烘干后，再次用于对发酵液中鼠李糖脂的吸附，观察吸附效率随重复利用次数的变化情况。用不同的洗脱剂洗脱后的阳离子化go重复利用效率如图5所示。

从图5结果看，用naoh洗脱在重复利用6次后，吸附rha的效率可达到初始效果的68％。但用naoh与正己烷的混合溶液洗脱，重复6次后，吸附rha效率可达到初始吸附效果的85％以上。随着重复利用的次数的增加，再生后的阳离子修饰go对鼠李糖脂的吸附效率会下降。这说明阳离子修饰go吸附rha的同时，还有其他杂质被吸附，而其他杂质对阳离子化go的污染降低了吸附剂点位的活性，在阳离子修饰go表面的活性点位逐渐被杂质占据，洗脱后重复利用时，其吸附的点位逐渐减少，对鼠李糖脂的吸附效率降低。当选择了氢氧化钠和正己烷合适的洗脱和再生剂比例时，阳离子化go还是能重复利用至少6次，仍具有十分乐观的应用前景。

综上所述，本发明提供的一种鼠李糖脂的分离纯化方法，其制备的阳离子修饰氧化石墨烯，对鼠李糖脂的吸附量大，对发酵液中鼠李糖脂的吸附量能达到2.01g/g，且选择性良好，使得脱附后所得鼠李糖脂的纯度也大大提高，洗脱后的鼠李糖脂的纯度为可达90.2％，整个分离纯化过程环保无污染，有很大的推广空间。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出的实施例。

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