测定COVID-19疫苗中结构蛋白含量的特异性肽段及方法与流程

本发明涉及测定covid-19疫苗中结构蛋白含量的特异性肽段及方法，具体涉及测定covid-19疫苗中结构蛋白s、s蛋白rbd区域、结构蛋白e、结构蛋白m和结构蛋白n含量的肽段和方法，属于疫苗质量评价技术领域。

背景技术：

新型冠状病毒肺炎是由新型冠状病毒引起的传染疾病。虽然各国或地区采取了非药物性干预措施，疫情在部分国家和地区得到控制。但从全球的角度评估，新型冠状病毒肺炎疫情并未得到有效遏制，疫苗成为人们控制疫情的希望。目前，主要的新型冠状病毒疫苗包括灭活疫苗、病毒载体疫苗和rna疫苗几种类型。无论是灭活疫苗还是载体疫苗均包括covid-19病毒蛋白的s1部分。灭活疫苗包括4种结构蛋白s，e，m和n，其中s包括s1和s2两种蛋白。s1蛋白的rbd区域对covid-19病毒的结合至关重要。研究s、e、m和n蛋白的含量及比例，有利于研究covid-19病毒疫苗的结构完整性和评价纯化工艺。当灭活covid-19疫苗中缺少e、m或n蛋白中的一种或多种但保留了s蛋白时，认为该疫苗含有主要抗原蛋白，但不具有结构完整性。当灭活covid-19疫苗中缺少s蛋白时，认为该疫苗不具有结构完整性且缺少有效抗原蛋白。当灭活covid-19疫苗含有s、e、m和n蛋白，但s蛋白的rbd区域较少时，认为该蛋白有效抗原区域丢失，可能无法激活免疫细胞，导致疫苗有效性较弱。当载体covid-19疫苗中s蛋白缺失时，认为载体蛋白未有效结合s蛋白。当载体covid-19疫苗中s蛋白的rbd减少时，认为载体covid-19疫苗在生产过程中丢失rbd区域，可能导致疫苗有效性减弱。因此，灭活covid-19疫苗和载体covid-19疫苗中s蛋白的含量、s蛋白中rbd区域的含量，以及s蛋白与rbd区域的含量与灭活covid-19疫苗和载体covid-19疫苗的有效性相关。灭活covid-19疫苗中s蛋白、e蛋白、m蛋白和n蛋白的含量和比例，反应了灭活疫苗的结构完整性。目前尚无covid-19疫苗结构蛋白s蛋白、s蛋白rbd区域、e蛋白、m蛋白和n蛋白的含量测定方法。

技术实现要素：

针对上述需求，本发明提供了测定covid-19疫苗中结构蛋白含量的特异性肽段，以及具体的测定方法。本发明筛选到了适合作为抗原蛋白定量测定的特异性肽段，采用高效液相色谱串联质谱方法，建立了一种高通量、高选择性、高灵敏度的covid-19疫苗结构蛋白s蛋白、s蛋白rbd区域、e蛋白、m蛋白和n蛋白的定量方法，用于灭活covid-19疫苗、载体covid-19疫苗中s蛋白、s蛋白rbd区域、e蛋白、m蛋白和n蛋白的定量分析。该方法可用于灭活covid-19疫苗、载体covid-19疫苗定量对照品筛查，同一厂家不同批次灭活covid-19疫苗、载体covid-19疫苗的结构完整性，不同厂家灭活covid-19疫苗、载体covid-19疫苗的质量对比，灭活covid-19疫苗、载体covid-19疫苗的稳定性测试。

本发明是通过以下技术方案实现的：

测定covid-19疫苗中结构蛋白含量的特异性肽段，包括测定s蛋白、s蛋白rbd区域、e蛋白、m蛋白和n蛋白的(covid-19疫苗中所含的4种结构蛋白和1种关键区域—rbd区域)的5种肽段，具体如下：

测定结构蛋白s的肽段：选自flpfqqfgr，tfllk，gvyypdk中的至少一条；

测定结构蛋白s核心区域rbd的肽段：选自cygvsptk，qiapgqtgk，snlkpfer中的至少一条；

测定结构蛋白e的肽段：选自ccnivnvsl,srvknl,srvknl中的至少一条；

测定结构蛋白m的肽段：选自eitvatsr，tlsyyk，vagdsgfaaysr，ignyk中的至少一条；

测定结构蛋白n的肽段：选自npannaaivlqlpqgttlpk，gfyaegsr，aynvtqafgr，lnqlesk，adetqalpqr，qqtvtllpaadlddfsk中的至少一条。

进一步的，所述测定covid-19疫苗中结构蛋白含量的特异性肽段，包括以下肽段(如seqidno.1～19所示)：

测定结构蛋白s的肽段：flpfqqfgr，tfllk，gvyypdk；

测定结构蛋白s核心区域rbd的肽段：cygvsptk，qiapgqtgk，snlkpfer；

测定结构蛋白e的肽段：ccnivnvsl,srvknl,srvknl；

测定结构蛋白m的肽段：eitvatsr，tlsyyk，vagdsgfaaysr，ignyk；

测定结构蛋白n的肽段：npannaaivlqlpqgttlpk，gfyaegsr，aynvtqafgr，lnqlesk，adetqalpqr，qqtvtllpaadlddfsk。

上述特异性肽段作为定量肽段在测定covid-19疫苗中结构蛋白含量中的应用。

一种covid-19疫苗中结构蛋白含量的测定方法：对待测样品进行胰蛋白酶酶解或smartdigest^tm酶解(smartdigest^tm为现有技术中已有的产品，可常规购买得到，比如可购自thermofisher，商品号60109-101)，得酶解液，对酶解液进行高效液相色谱串联质谱分析(lc-ms/ms分析)，得色谱图，计算上述5种特异性肽段的响应峰面积，代入标准工作曲线，计算得出待测样品中结构蛋白s、s蛋白rbd区域、结构蛋白e、结构蛋白m和结构蛋白n的含量。本领域技术人员应当理解，对于任意一种特异性肽段，若包含多于一条肽段，计算的响应峰面积为各条肽段的响应峰面积之和。

所述标准工作曲线，是通过以下方法得到的：取5种结构蛋白的标准对照品，5种结构蛋白分别为：结构蛋白s、s蛋白rbd区域、结构蛋白e、结构蛋白m和结构蛋白n；混合配制成系列浓度的标准品溶液，进行胰蛋白酶酶解或smartdigest^tm酶解，得酶解液，对酶解液进行高效液相色谱串联质谱分析，得色谱图，计算上述5种特异性肽段的响应峰面积，以浓度—响应峰面积制作标准工作曲线(以肽段峰面积加和做纵坐标，对应蛋白浓度做横坐标，做标曲)。

进一步的，所述对待测样品进行smartdigest^tm酶解的具体步骤如下：

(ⅰ)取待测样品，置于离心管中，加入smartdigest^tm溶液，70℃保持60min；

(ⅱ)加入无机酸或其溶液，37℃反应30min；

(ⅲ)离心，取上清液，浓缩至干，用适量水溶解后用于lc-ms/ms分析。

进一步的，在加入smartdigest^tm溶液前，先加入rapigest^tm溶液，60℃保持15min。

进一步的，所述无机酸选自甲酸，乙酸，三氟乙酸。

进一步的，所述无机酸溶液中，无机酸与水的体积比为1:0.1～1000。

进一步的，离心的具体条件为：14000r/min离心15min。

优选的，所述对待测样品进行smartdigest^tm酶解的具体步骤如下：

(ⅰ)取待测样品150μl，置于离心管中，加入同等体积的rapigest^tm，60℃保持15min；

(ⅱ)加入200μl的smartdigest^tm溶液，70℃保持60min；

(ⅲ)加入5μl的甲酸溶液，37℃反应30min；所述甲酸溶液中甲酸与水的体积比为1:200；

(iv)14000r/min离心15min，取上清液，浓缩至干，用200μl水溶解后用于lc-ms/ms分析。

进一步的，所述配制系列浓度的标准品溶液的具体操作方式为：分别取150μl，120μl，100μl，80μl，50μl，25μl的标准品母液，再分别加入0μl，30μl，50μl，70μl，100μl，125μl的碳酸氢铵溶液；所述碳酸氢铵溶液的浓度为10mmol/l～500mmol/l，优选50～100mmol/l。

进一步的，所述lc-ms/ms分析中，色谱条件如下：

固定相：固定相1或/和固定相2或/和固定相3；

柱温：30℃；

流动相：a-离子交换剂水溶液；b-含离子交换剂的有机溶剂水溶液；

所述离子交换剂为质谱兼容的酸或盐，或酸和盐的混合物；

所述盐选自甲酸铵或乙酸铵；所述酸选自甲酸，乙酸，三氟乙酸；

所述有机溶剂选自甲醇，乙腈，乙醇；

所述有机溶剂水溶液中，有机溶剂与水的体积比为60～100：0～40；

流动相a中离子交换剂的浓度为0～20mmol/l，流动相b中离子交换剂的浓度为0～20mmol/l。

梯度：0-8min,5％b-40％b；8-8.1min,40％b-100％b；8.1-10min,100％b；10-10.1min,100％b-5％b；10.1-15min,5％b。

流速：0.2～0.5ml/min；

进样体积：10μl；

所述固定相1为peek材质内衬柱管填装的封端c18色谱柱；所述固定相2为极性基团封端的c18；所述固定相3为生物兼容c8色谱柱。

进一步的，所述lc-ms/ms分析中，质谱条件如下：

离子源：es+模式；质谱仪：三重四级杆质谱仪；雾化器流速：3l/min；

加热器流速：10l/min；接口温度：200℃；dl温度：235℃；加热模块温度：400℃；

干燥气流速：10l/min；

接口电压：1.5kv，喷雾针长度3mm，偏离0.5mm。

质谱检测器检测模式为多离子选择监控(mrm)，质谱检测参数见表1。

表15种抗原蛋白定量肽段及其质谱参数

*为定量离子

本发明的测定covid-19疫苗中结构蛋白含量的特异性肽段，是通过实验筛选得到的特异性强、灵敏度高，线性好，重复性好的肽段(每3～6条特定肽段对应一种抗原蛋白)。本发明通过酶解条件优化、质谱条件优化、稳定性、灵敏度、线性和重复性，筛选出5种蛋白适合的定量肽段；然后将优化所得方法用于疫苗成品稳定性和批次重复性考察，筛选出适合用作为疫苗结构蛋白定量的标准品的疫苗成品。本发明可用于不同厂家、不同批次灭活covid-19疫苗、载体covid-19疫苗中5种蛋白的含量测定(比如用于不同批次疫苗成品稳定性评价，为企业提供参考；用于不同厂家疫苗成品对比，为疫苗检验机构提供参考；用于疫苗结构蛋白的检测，为研发、生产和质量评价环节的应用提供参考)，对改进疫苗研发、生产和质量评价具有借鉴意义。本方法弥补了灭活covid-19疫苗、载体covid-19疫苗结构蛋白缺失的现状，具有以下优点：

1)本发明首次实现了灭活covid-19疫苗、载体covid-19疫苗中4结构蛋白s、结构蛋白e、结构蛋白m和结构蛋白n和1种关键区域—rbd区域的含量测定。

2)本方法适用范围广，可用于不同厂家灭活(载体)covid-19疫苗、同一厂家不同批次或\和不同工艺covid-19疫苗中结构蛋白s、结构蛋白e、结构蛋白m和结构蛋白n和rbd区域的含量测定，有利于监管机构评价不同厂家covid-19疫苗的质量以及厂家自评不同批次或\和不同工艺covid-19疫苗的质量。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：s蛋白的定量肽段谱图。

图2：rbd区域的定量肽段谱图。

图3：n蛋白的定量肽段谱图。

图4：m蛋白的定量肽段谱图。

图5：e蛋白的定量肽段谱图。

图6：特异性考察结果示意图(s蛋白方法分析m,e,n和空白基质酶解液)。

图7：特异性考察结果示意图(m蛋白方法分析s,e,n和空白基质酶解液)。

图8：特异性考察结果示意图(n蛋白方法分析s,e,m和空白基质酶解液)。

图9：特异性考察结果示意图(e蛋白方法分析s,n,m和空白基质酶解液)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例一

1.实验仪器与设备：

高压二元泵、脱气机、自动进样器、柱温箱和三重四级杆质谱仪。

2.实验试剂：

结构蛋白s、结构蛋白e、结构蛋白m和结构蛋白n和rbd区域蛋白对照品。

3.检测条件：

色谱柱：固定相1(peek材质内衬柱管填装的封端c18色谱柱)；

流动相：a-甲酸：水(1:1000，v/v)；b-甲酸：乙腈(1:1000，v/v)；

梯度：0-8min5％b-40％b，8-8.1min40％-100％b，8.1-10min100％b,10-10.1min100％-5％b，10.1-15min5％b；柱温：35℃；流速：0.2-0.5ml/min；进样体积：10μl。

质谱条件：

离子源：es+模式；质谱仪：三重四级杆质谱仪；雾化器流速：3l/min；加热器流速：10l/min；接口温度：200℃；dl温度：235℃；加热模块温度：400℃；干燥气流速：10l/min；接口电压：1.5kv，喷雾针长度3mm，偏离0.5mm。质谱检测器检测模式为多离子选择监控(mrm)，质谱检测参数见表1。

4.酶解酶种类考察：分别配置5种蛋白的对照品溶液，每种溶液取相同体积三份，一份用胰蛋白酶酶解，一份用smartdigest^tm酶解，一份用糜蛋白酶酶解。

胰蛋白酶酶解步骤如下：

(ⅰ)取5种蛋白对照品，用50mmol/l的碳酸氢铵溶液稀释成浓度为100μg/ml的溶液；取对照品溶液150μl，置于离心管中，加入等体积的rapigest^sf溶液，置于柱温箱中，60℃孵育15min；

(ⅱ)加入10μl的二硫苏糖醇溶液，60℃反应60min；所述二硫苏糖醇溶液的浓度为0.5mol/l；

(ⅲ)冷却至室温，加入10μl碘代乙酰胺溶液，室温，避光，反应30min；所述碘代乙酰胺溶液的浓度为1mol/l；

(ⅳ)加入5μl的胰蛋白酶溶液，37℃反应12h；所述胰蛋白酶溶液的浓度为0.1mg/ml；

(ⅴ)加入5μl的甲酸溶液，37℃反应30min；所述甲酸溶液中甲酸与水的体积比为1:200；

(ⅵ)14000r/min离心15min，取上清液，浓缩至干，用200μl水溶解后用于lc-ms/ms分析。

糜蛋白酶酶解步骤如下：

除步骤(ⅳ)中反应温度为25℃以外，糜蛋白酶酶解步骤与胰蛋白酶酶解步骤相同。

smartdigest^tm酶解步骤如下：

(ⅰ)取待测样品150μl，置于离心管中，加入同等体积rapigest^tm,60℃保持15min；

(ⅱ)加入200μl的smartdigest^tm溶液，70℃保持60min；

(ⅲ)加入5μl的甲酸溶液，37℃反应30min；所述甲酸溶液中甲酸与水的体积比为1:200；

(iv)14000r/min离心15min，取上清液，浓缩至干，用200μl水溶解后用于lc-ms/ms分析。

对比糜蛋白酶、胰蛋白酶、smartdigest^tm酶解所得肽段，胰蛋白酶酶解，除e蛋白以外的其它蛋白，每种蛋白均可获得至少五条质谱响应较好的肽段，但酶解同等浓度的蛋白，糜蛋白酶仅能获得1～2条质谱效应较好的肽段。用胰蛋白酶酶解e蛋白所得肽段较弱，用糜蛋白酶酶解可获得4条响应较好的肽段。

胰蛋白酶酶解所得肽段：

测定结构蛋白s的肽段：flpfqqfgr，tfllk，gvyypdk，tqlppaytnsftr、qgnfk、gwifgttldsk；

测定结构蛋白s核心区域rbd的肽段：cygvsptk，qiapgqtgk，snlkpfer、sftvek、vvvlsfellhapatvcgpk，lqslqtyvtqqlir；

测定结构蛋白e的肽段：lcayccnivnvslvk、psfyvysr，nlnssrvpdllv；

测定结构蛋白m的肽段：eitvatsr，tlsyyk，vagdsgfaaysr，ignyk，flyiik、iaghhlgr，lntdhssssdniallvq；

测定结构蛋白n的肽段：npannaaivlqlpqgttlpk，gfyaegsr，aynvtqafgr，lnqlesk，adetqalpqr，qqtvtllpaadlddfsk，dqvillnk、dhigtr，dlspr。

糜蛋白酶酶解所得肽段：

测定结构蛋白s的肽段：vssqcvnl，dsktqsl；

测定结构蛋白s核心区域rbd的肽段：erdisteiy，vknkcvnf；

测定结构蛋白e的肽段：ccnivnvsl,srvknl,vseetgtl，srvknl；

测定结构蛋白m的肽段：anrnrf，itggiaiamacl；

测定结构蛋白n的肽段：nvtqaf，irqgtdy。

对比胰蛋白酶和smartdigest^tm酶解所得肽段，结果显示smartdigest^tm可获得更多响应较好的肽段。用smartdigest^tm酶解和胰蛋白酶酶解，每种蛋白均可获得至少五条质谱响应较好的肽段，但酶解同等浓度的蛋白，smartdigest^tm酶解所得肽段响应更高，如表2所示。

表2胰蛋白酶酶解和smartdigest^tm酶解的质谱响应强度

注：无，表示无该肽段检出。

5.酶解效率提高试剂考察：考察样品中是否添加酶解试剂提高剂rapigest^tm溶液对酶解效率的影响。在smartdigest^tm溶液中加入rapigest^tm溶液，可显著提高酶解效率。如表3所示，肽段的质谱响应强度均在添加rapigest^tm溶液后得到显著提高。

表3添加rapigest^tm溶液前后肽段的质谱响应强度

6.灵敏度：将上述样品用质谱分析，每种蛋白选择若干条灵敏度最高的肽段，作为该抗原蛋白的准定量肽段1，相关信息如下：

测定结构蛋白s的肽段：flpfqqfgr，tfllk，gvyypdk，tqlppaytnsftr，gwifgttldsk；

测定结构蛋白s核心区域rbd的肽段：cygvsptk，qiapgqtgk，snlkpfer、sftvek，lqslqtyvtqqlir；

测定结构蛋白e的肽段：ccnivnvsl,srvknl,srvknl；

测定结构蛋白m的肽段：eitvatsr，tlsyyk，vagdsgfaaysr，ignyk，flyiik，lntdhssssdniallvq；

测定结构蛋白n的肽段：npannaaivlqlpqgttlpk，gfyaegsr，aynvtqafgr，lnqlesk，adetqalpqr，qqtvtllpaadlddfsk，dqvillnk，dlspr。

7.线性：将上述6中所得抗原蛋白的准定量肽段1用于线性考察，考察样品的准备步骤如下：

(1)混合标准品溶液母液：取5种结构蛋白对照品，混合，用50mmol/l的碳酸氢铵溶液稀释成浓度为100μg/ml的溶液，作为标准品母液，备用；

(2)工作曲线的准备：

(ⅰ)分别取150μl，120μl，100μl，80μl，50μl，25μl的标准品母液，再分别加入0μl，30μl，50μl，70μl，100μl，125μl的碳酸氢铵溶液(浓度50mmol/l)；置于离心管中，加入等体积的rapigest^tm溶液，置于柱温箱中，60℃孵育15min；

(ⅱ)加入200μl的smartdigest^tm溶液，70℃保持60min；

(ⅲ)加入5μl的甲酸溶液，37℃反应30min；所述甲酸溶液中甲酸与水的体积比为1:200；

(iv)14000r/min离心15min，取上清液，浓缩至干，用200μl水溶解后用于lc-ms/ms分析。

(3)绘制标准工作曲线：根据溶液浓度与对应色谱峰面积的关系得到标准工作曲线，剔除线性不好的肽段；剔除的肽段如下：tqlppaytnsftr，sftvek，lcayccnivnvslvk，flyiik，dqvillnk。

筛选出作为线性较好的准定量抗原蛋白的准定量肽段2，相关肽段如下：

测定结构蛋白s的肽段：flpfqqfgr，tfllk，gvyypdk，gwifgttldsk；

测定结构蛋白s核心区域rbd的肽段：cygvsptk，qiapgqtgk，snlkpfer，lqslqtyvtqqlir；

测定结构蛋白e的肽段：ccnivnvsl,srvknl,srvknl；

测定结构蛋白m的肽段：eitvatsr，tlsyyk，vagdsgfaaysr，ignyk，lntdhssssdniallvq；

测定结构蛋白n的肽段：npannaaivlqlpqgttlpk，gfyaegsr，aynvtqafgr，lnqlesk，adetqalpqr，qqtvtllpaadlddfsk，dlspr。

8.重复性：取120μg/ml、60μg/ml、30μg/ml的5种结构抗原蛋白溶液，每种溶液平行取样三份，用smartdigest^tm酶解，从上述7所得抗原蛋白的准定量肽段2中剔除重复性不好的肽段，剔除的肽段如下：gwifgttldsk，lqslqtyvtqqlir，nlnssrvpdllv，lntdhssssdniallvq，dlspr。

筛选出重复性较好(峰面积rsd％<20％)的肽段作为抗原蛋白的定量肽段，如表4所示。

表4各抗原蛋白定量参数

9.质谱条件的优化：选择1kv、1.5kv、2.0kv、2.5kv、3.0kv、3.5kv和4.0kv作为接口电压，考察上述8中所得抗原蛋白定量肽段的响应，得到各肽段的最佳喷雾电压为1.5kv。考察了喷雾针的长度0.5mm,1.0mm,1.5mm,2.0mm,3mm对肽段响应强度的影响，以及喷雾针位置偏离0.5mm,1mm，2mm,3mm,4mm对肽段响应强度的影响。结果显示喷雾针长度为3mm，偏离位置为0.5mm时，肽段响应强度最高，所有肽段的响应强度相比常规质谱条件有8～10倍的提升。该结论与质谱常用参数(喷雾针长度1～2mm，偏离位置1mm)有显著差异，是通过大量实验所得结论。对比数据表5所示。

表5质谱常用参数(接口电压4.0kv，喷雾针长度1mm,偏离1mm)和本发明所用参数(接口电压1.5kv，喷雾针长度3mm,偏离0.5mm)各肽段响应强度对比

10.特异性考察：

用s蛋白的质谱方法分析m，n，e和空白基质样品的酶解液，无明显响应，说明s蛋白肽段在m，n，e和空白基质样品的酶解液中不存在，即所选s蛋白的肽段具有特异性。

用m蛋白的质谱方法分析s，n，e和空白基质样品的酶解液，无明显响应，说明m蛋白肽段在s,n，e和空白基质样品的酶解液中不存在，即所选m蛋白的肽段具有特异性。

用n蛋白的质谱方法分析m，s，e和空白基质样品的酶解液，无明显响应，说明n蛋白肽段在m,s，e和空白基质样品的酶解液中不存在，即所选n蛋白的肽段具有特异性。

用e蛋白的质谱方法分析m，n，s和空白基质样品的酶解液，无明显响应，说明e蛋白肽段在m,n，s和空白基质样品的酶解液中不存在，即所选e蛋白的肽段具有特异性。

相关谱图见图6～图9。

实施例二

1.实验仪器与设备：

高压二元泵、脱气机、自动进样器、柱温箱和三重四级杆质谱仪。

2.实验试剂：

s、e、m、n和rbd蛋白标准品、smartdigest^tm、rapigest^tm、nsmol溶液、厂家1灭活covid-19疫苗(3批次)、厂家2灭活covid-19疫苗(2批次)。

3.检测条件：

色谱柱：固定相1；

流动相：a-乙酸：水(1:1000，v/v)；b-乙酸：乙腈(1:1000，v/v)；

梯度：0-8min5％b-40％b，8-8.1min40％-100％b，8.1-10min100％b,10-10.1min100％-5％b，10.1-15min5％b；柱温：35℃；流速：0.2-0.5ml/min；进样体积：10μl。

质谱条件：

离子源：es+模式；质谱仪：三重四级杆质谱仪；雾化器流速：3l/min；加热器流速：10l/min；接口温度：200℃；dl温度：235℃；加热模块温度：400℃；干燥气流速：10l/min；接口电压1.5kv，喷雾针长度3mm,偏离0.5mm；质谱检测器检测模式为多离子选择监控(mrm)，质谱检测参数见表1。

4.标准曲线绘制：

(1)混合标准品溶液母液：取5种蛋白对照品，混合，用100mmol/l的碳酸氢铵溶液稀释成溶液，作为标准品母液(标准品母液中各抗原蛋白的浓度为100μg/ml)，备用；

(2)工作曲线的准备：

(ⅰ)分别取150μl，120μl，100μl，80μl，50μl，25μl的标准品母液，再分别加入0μl，30μl，50μl，70μl，100μl，125μl的碳酸氢铵溶液(浓度100mmol/l)；置于离心管中，加入等体积的rapigest^tm溶液，置于柱温箱中，60℃孵育15min；

(ⅱ)加入300μlsmartdigest^tm溶液，70℃保持60min；

(ⅲ)加入5μl的三氟乙酸溶液，37℃反应30min；所述甲三氟乙酸溶液中三氟乙酸与水的体积比为1:200；

(iv)14000r/min离心15min，取上清液，浓缩至干，用200μl水溶解后用于lc-ms/ms分析，如图1～图5所示。

(3)绘制标准工作曲线：根据溶液浓度与对应色谱峰面积的关系得到标准工作曲线。

5.样品检测：取样品按对照品的方式酶解，再用液相色谱串联质谱进行分析检测，根据待测组分的响应峰面积和标准工作曲线，得出待测组分的含量。测试结果如表6所示。

表62个厂家样品中s、e、m、n和rbd含量测定

实施例三

1.实验仪器与设备：

高压二元泵、脱气机、自动进样器、柱温箱和三重四级杆质谱仪。

2.实验试剂：

s、e、m、n和rbd蛋白标准品、smartdigest^tm、rapigest^tm、nsmol溶液，厂家3covid-19疫苗。

3.检测条件：

色谱柱：固定相2(极性基团封端的c18)；

流动相：a-乙酸：水(1:1000，v/v)；b-乙酸：乙腈(1:1000，v/v)；

梯度：0-8min5％b-40％b，8-8.1min40％-100％b，8.1-10min100％b,10-10.1min100％-5％b，10.1-15min5％b；柱温：35℃；流速：0.2-0.5ml/min；进样体积：10μl。

质谱条件：

离子源：es+模式；质谱仪：三重四级杆质谱仪；雾化器流速：3l/min；加热器流速：10l/min；接口温度：200℃；dl温度：235℃；加热模块温度：400℃；干燥气流速：10l/min；接口电压1.5kv，喷雾针长度3mm,偏离0.5mm；质谱检测器检测模式为多离子选择监控(mrm)，质谱检测参数见表1。

4.对照曲线和样品酶解测试方法同实施例二。样品测试结果如表7所示。

表7厂家3样品中s、e、m、n和rbd含量测定

实施例4

1.实验仪器与设备：

高压二元泵、脱气机、自动进样器、柱温箱和三重四级杆质谱仪。

2.实验试剂：

s、e、m、n和rbd蛋白标准品、smartdigest^tm、rapigest^tm、nsmol溶液，厂家4covid-19疫苗。

3.检测条件：

色谱柱：固定相3(生物兼容c8色谱柱)；

流动相：a-乙酸：水(1:1000，v/v)；b-乙酸：乙腈(1:1000，v/v)；

梯度：0-8min5％b-40％b，8-8.1min40％-100％b，8.1-10min100％b,10-10.1min100％-5％b，10.1-15min5％b；柱温：35℃；流速：0.2-0.5ml/min；进样体积：10μl。

质谱条件：

离子源：es+模式；质谱仪：三重四级杆质谱仪；雾化器流速：3l/min；加热器流速：10l/min；接口温度：200℃；dl温度：235℃；加热模块温度：400℃；干燥气流速：10l/min；接口电压：1.5kv，喷雾针长度0.5mm，偏离3mm；质谱检测器检测模式为多离子选择监控(mrm)，质谱检测参数见表1。

4.对照曲线制作方法同实施例二。样品测试结果如表8所示。

表8厂家4样品中s、e、m、n和rbd含量测定

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

序列表

<110>中国食品药品检定研究院

岛津企业管理(中国)有限公司

北京民海生物科技有限公司

<120>测定covid-19疫苗中结构蛋白含量的特异性肽段及方法

<141>2020-09-24

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