Arg(NO2)-Gly-Asp-Val-吉西他滨,其合成,抗肿瘤活性和应用的制作方法

本发明涉及arg(no2)-gly-asp-val-吉西他滨,涉及它的制备方法,涉及它与吉西他滨比没有骨髓毒性,没有肝毒性,没有肾毒性及活性强等优点。因而本发明涉及它在制备没有骨髓毒性,没有肝毒性,没有肾毒性及活性强的抗肿瘤药物中的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术：

吉西他滨是抗代谢类抗肿瘤药物的代表。广泛应用于各种实体肿瘤治疗,如用于非小细胞肺癌,胰腺癌,乳腺癌和卵巢癌的治疗。目前,吉西他滨仍然是临床的重要一线化疗药物之一。可是,半衰期短,骨髓毒性,肝毒性,肾毒性以及耐药性严重限制了吉西他滨的应用及疗效。为克服吉西他滨的这些缺点,业内研究人员对吉西他滨进行了各种化学修饰。不过,问题仍然没有解决。本案对吉西他滨进行了广泛的化学修饰及活性评价之后,发明人发现下式的arg(no2)-gly-asp-val-吉西他滨不仅没有吉西他滨那样的毒副作用,而且抗肿瘤活性强。根据这些发现,发明人提出了本发明。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种制备下式的arg(no2)-gly-asp-val-吉西他滨的方法,以及由该方法制得的下式的arg(no2)-gly-asp-val-吉西他滨。实验证明,由本发明制备的下式的arg(no2)-gly-asp-val-吉西他滨是没有骨髓毒性,没有肝毒性,没有肾毒性及活性强的抗肿瘤药物。为了达到所述目的,本发明采用了五方面的技术手段。

第一方面的技术手段是提供了下式的arg(no2)-gly-asp-val-吉西他滨,特征在于它与下式的arg-gly-asp-val-吉西他滨一样在血液循环中可以稳定存在,不进入其它器官而是靶向肿瘤组织,在肿瘤组织中转化为arg-gly-asp-val-吉西他滨并释放吉西他滨,发挥抗肿瘤作用。

第二方面的技术手段是提出了一种所述arg(no2)-gly-asp-val-吉西他滨的制备方法,该方法的特征在于将boc-arg(no2)-gly-asp(otbu)与val-吉西他滨缩合代替boc-arg-gly-asp(otbu)与val-吉西他滨缩合,使肽部分的合成避免了脱no2步骤,使缩合收率提高从14％提高到32％。

第三方面的技术手段是提出arg(no2)-gly-asp-val-吉西他滨的抗肿瘤活性比吉西他滨强10倍。

第四方面的技术手段是提出arg(no2)-gly-asp-val-吉西他滨没有肾毒性,肝毒性和骨髓毒性。

第五方面的技术手段是提出了arg(no2)-gly-asp-val-吉西他滨具有肿瘤靶向作用。

第六方面的技术手段是披露arg(no2)-gly-asp-val-吉西他滨的所述内容适用于arg(no2)-gly-asp-ser-吉西他滨和arg(no2)-gly-asp-phe-吉西他滨。

附图说明

图1n^g-no2-arg-gly-asp-val-吉西他滨的合成路线.(i)二环己基碳二亚胺,n-羟基苯并三氮唑,无水四氢呋喃；(ii)naoh甲醇溶液(2m)；(iii)氯化氢的乙酸乙酯溶液。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明,下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的,它们仅用来对本发明进行具体描述,不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备boc-arg(no2)-gly-obzl

将3.19g(10mmol)boc-arg(no2)溶于100ml无水四氢呋喃(thf)。在冰浴与搅拌下向得到的溶液中依次加入1.35g(10mmol)n-羟基苯并三氮唑(hobt)和2.47g(12mmol)二环己基碳二亚胺(dcc)。搅拌30min之后,再加3.53g(12mmol)tos·gly-obzl。反应混合物用n-甲基吗啉(nmm)调节ph9。之后,室温搅拌10h,tlc(二氯甲烷/甲醇＝15/1)检测反应完。反应混合物过滤,除去二环己基尿(dcu)。滤液减压浓缩,得到的油状物用石油醚洗。洗后的残留物用150ml乙酸乙酯溶解,溶液静置30min,再滤除二环己基尿。滤液依次用5％碳酸氢钠水溶液洗(50ml×3),饱和氯化钠水溶液洗(50ml×3),5％硫酸氢钾水溶液洗(50ml×3)。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12h,过滤,滤液减压浓缩。得到的黄色油状物用50ml二氯甲烷溶解,静置,让固体充分析出。过滤,收集无色粉末。滤液减压浓缩,残留物经柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝35/1)。柱层析纯化得到的产物与过滤收集无色粉末合并,共得4.0g(86％)标题化合物。esi-ms(m/z):467.2[m+h]⁺¹；h-nmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝8.484(s,1h),8.288(t,j＝5.4hz,1h),7.902(s,2h),7.365(m,5h),6.915(d,j＝7.8hz,1h),5.123(s,2h),3.973(m,1h),3.898(m,2h),3.117(m,2h),1.638(m,1h),1.501(m,3h),1.379(s,9h)。

实施例2制备boc-arg(no2)-gly

将4.0g(8.58mmol)boc-arg(no2)-gly-obzl用30ml甲醇溶解。之后,在冰浴与搅拌下用2mnaoh水溶液调ph12并搅拌。4h之后tlc(二氯甲烷/甲醇＝15/1)检测反应完成。反应混合物用饱和khso4水溶液调ph7并过滤。滤液减压浓缩,残留物用饱和khso4水溶液调ph2。之后,用乙酸乙酯萃取(100ml×3)。乙酸乙酯相减压浓缩至150ml。之后,用饱和氯化钠水溶液洗(60ml×3),用无水硫酸钠干燥12h。过滤,滤液减压浓缩,得到2.81g(88％)标题化合物,为无色粉末。esi-ms(m/z):375.1[m-h]^-；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝8.486(s,1h),8.081(t,j＝5.4hz,1h),7.928(s,1h),7.039(s,1h),6.900(d,j＝2.7hz,1h),3.957(m,1h),3.748(m,2h),3.128(m,2h),1.651(m,1h),1.502(m,3h),1.381(s,9h)。

实施例3制备boc-arg(no2)-gly-asp(otbu)-ome

采用实施例1的方法从2.81g(7.47mmol)boc-arg(no2)-gly和2.15g(8.96mmol)asp(otbu)-ome得到3.15g(75％)标题化合物,为无色粉末。esi-ms(m/z):562.2[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝8.481(s,1h),8.269(d,j＝7.8hz,1h),8.075(s,1h),6.968(d,j＝7.8hz,1h),4.650(q,j1＝6.6hz,j2＝14.1hz,1h),3.929(m,1h),3.734(m,2h),3.627(s,3h),3.122(m,2h),2.704(dd,j1＝6.3hz,j2＝16.2hz,1h),2.586(dd,j1＝6.3hz,j2＝16.2hz,1h),1.639(m,1h),1.494(m,3h),1.384(s,18h)。

实施例4制备boc-arg(no2)-gly-asp(otbu)

采用实施例2的方法从3.15g(5.6mmol)boc-arg(no2)-gly-asp(otbu)-ome得到2.55g(83％)标题化合物,为无色粉末。esi-ms(m/z):546.2[m-h]^-；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝12.681(s,1h),8.164(s,1h),8.146(s,1h),8.052(s,1h),6.949(d,j＝6.6hz,1h),4.553(m,1h),3.929(m,1h),3.734(m,2h),3.129(m,2h),2.669(m,2h),1.650(m,1h),1.498(m,3h),1.382(s,18h)。

实施例5制备boc-arg-gly-asp(otbu)

将2.55g(4.65mmol)boc-arg(no2)-gly-asp(otbu)溶于30ml甲醇,搅拌下加入500mgpd/c。室温通入氢气,12h之后tlc(二氯甲烷/甲醇＝15/1)监测反应完成。过滤除去pd/c,无色透明滤液减压浓缩,得到2.15g(92％)标题化合物,为无色粉末。esi-ms(m/z):503.2[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝9.312(s,1h),8.530(s,1h),7.462(d,j＝5.4hz,1h),7.202(s,2h),6.947(d,j＝7.2hz,1h),3.978(m,1h),3.844(m,2h),3.443(m,1h),3.135(m,1h),2.972(m,1h),1.897(m,1h),1.560(m,3h),1.364(s,18h)。

实施例6制备boc-val-吉西他滨(1)

采用实施例1的方法从2.34g(20mmol)boc-val和2.63g(10mmol)吉西他滨得到3.15g(68％)标题化合物,为无色粉末。esi-ms(m/z):463.2[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝11.035(s,1h),8.276(d,j＝7.5hz,1h),7.277(d,j＝7.5hz,1h),7.020(d,j＝7.8hz,1h),6.325(d,j＝6.6hz,1h),6.180(t,j＝7.2hz,1h),5.305(t,j＝5.1hz,1h),4.256(m,1h),4.127(m,1h),3.911(m,1h),3.810(m,1h),3.659(m,1h),1.987(m,1h),1.380(m,9h),0.882(t,j＝6.6hz,6h)。

实施例7制备val-吉西他滨(2)

将3.15g(6.8mmol)boc-val-吉西他滨(1)用10ml无水乙酸乙酯溶液溶解。冰浴与搅拌下向溶液中加30ml氯化氢的乙酸乙酯溶液(4m),室温搅拌。4h之后tlc(二氯甲烷/甲醇＝10/1)监测1消失。反应混合物减压浓缩,残留物用无水乙酸乙酯复溶后再减压浓缩,再用干燥乙酸乙酯复溶。该操作重复3次,使不再有氯化氢残留。残留物用无水乙醚磨洗,得到2.61g(92％)标题化合物,为无色粉末。esi-ms(m/z):363.1[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝11.568(s,1h),8.550(s,2h),8.383(d,j＝7.5hz,1h),7.240(d,j＝7.5hz,1h),6.177(t,j＝7.2hz,1h),5.500(s,1h),4.210(m,1h),3.925(m,2h),3.791(m,1h),3.643(m,1h),2.207(m,1h),0.975(t,j＝7.5hz,6h)。

实施例8制备boc-arg(no2)-gly-asp(otbu)-val-吉西他滨(3)

采用实施例1的方法从547mg(1mmol)boc-arg(no2)-gly-asp(otbu)和478mg(1.2mmol)val-吉西他滨(2)得到黄色油状物。该黄色油状物用甲醇和水溶解,用c18纯化(甲醇/水＝40/60),得到270mg(32％)标题化合物,为无色粉末。esi-ms(m/z):847.6[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝11.148(s,1h),8.278(m,2h),8.184(s,1h),7.920(m,2h),7.571(d,j＝6.6hz,1h),7.462(d,j＝6.6hz,1h),7.248(d,j＝7.8hz,1h),7.060(m,3h),6.534(s,1h),6.173(t,j＝7.2hz,1h),5.444(m,1h),4.676(q,j1＝8.4hz,j2＝15.0hz,1h),4.354(t,j＝7.2hz,1h),4.219(m,2h),3.946(m,2h),3.888(m,1h),3.735(m,4h),3.169(m,2h),3.094(m,2h),2.680(dd,j1＝12.8hz,j2＝6.0hz,1h),2.444(dd,j1＝12.8hz,j2＝6.0hz,1h),2.041(m,1h),1.670(m,1h),1.513(m,3h),1.372(s,9h),1.339(s,9h),0.867(t,j＝6.3hz,6h)。

实施例9制备arg(no2)-gly-asp-val-吉西他滨(4)

采用实施例7的方法从100mg(0.118mmol)boc-arg(no2)-gly-asp(otbu)-val-吉西他滨(3)得到63.7mg(76％)标题化合物,为无色粉末。ft-(esi+)-ms(m/z):736.28302[m+h]⁺；¹h-nmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝11.124(s,1h),8.859(s,1h),8.450(d,j＝4.8hz,

1h),8.359(s,3h),8.302(d,j＝8.4hz,1h),8.092(d,j＝7.8hz,1h),7.971(s,1h),7.250(d,j＝7.8hz,1h),6.182(t,j＝5.4hz,1h),4.670(q,j1＝8.4hz,j2＝15.0hz,1h),4.345(t,j＝7.2hz,1h),4.182(m,2h),3.885(m,6h),3.654(m,2h),3.143(m,2h),2.691(dd,j1＝12.8hz,j2＝6.0hz,1h),2.502(dd,j1＝12.8hz,j2＝6.0hz,1h),2.061(m,1h),1.751(m,2h),1.557(m,2h),0.883(t,j＝6.3hz,6h)。

实验例1测定arg(no2)-gly-asp-val-吉西他滨(4)抑制肿瘤细胞增殖活性

1)本发明的化合物4用含0.1％dmso的培养基配制成所需浓度。

2)实验用的肿瘤细胞为mcf-7(人乳腺癌细胞),hct-8(人结肠癌细胞),hepg2(人肝癌细胞),a549(人非小细胞肺癌细胞)和95d(人高转移肺癌细胞)。

3)mcf-7,hct-8,95d和a549细胞选用rpmi-1640培养基,培养基中含10％经灭活的胎牛血清和1×10⁵u/l青霉素和100mg/l链霉素。hepg2细胞选用rpmi-dmem培养基,培养基中含10％经灭活的胎牛血清和1×10⁵u/l青霉素和100mg/l链霉素。将生长状态良好处于对数生长期的细胞以3×10⁴个/ml的密度接种于96孔板,每孔100μl,置于37℃和5％co2的细胞孵育箱中培养4小时,然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物4与含0.1％dmso的培养基配制成的溶液,每孔25μl,对照组加入等体积溶媒。继续培养48小时后,每孔加25μl浓度为5mg/ml的mtt溶液,置于37℃和5％co2的细胞孵育箱中培养4小时。小心除去上清液后每孔加入100μl的dmso,振荡约10min溶解紫色残留物(甲瓒),立即于酶标仪上检测o.d.值(吸光度),检测波长为570nm。

4)按下式求出各个浓度下化合物抑制肿瘤细胞增殖的活性:

细胞增殖(％)＝化合物4组平均o.d.值/对照组平均o.d.值)×100％,实验重复3次,以细胞增殖对化合物4浓度作图,按作图法求出ic50(半数有效抑制浓度)。

5)表1表明化合物4抗肿瘤细胞增殖活性与吉西他滨处在同一水平。

表1化合物4抗肿瘤细胞增殖的ic50(均值±sdμm,n＝3)

实验例2化合物4的抗肿瘤活性评价

测定前将本发明的化合物4溶于生理盐水。无菌条件下取接种于icr小鼠10天的s180肉瘤,加入适量生理盐水配制成瘤细胞悬液,细胞数为2×10⁷/ml,接种于健康雄性icr小鼠(20±2g)前肢腋皮下,每只小鼠注射0.2ml。肿瘤接种5天后,化合物4组小鼠每3天腹腔注射一次化合物4,分别在第1,4,7和11天注射,剂量为8.4μmol/kg/天,0.84μmol/kg/天及0.084μmol/kg/天。阳性对照吉西他滨组小鼠每3天腹腔注射一次吉西他滨,分别在第1,4,7和11天注射,剂量为84μmol/kg/天。生理盐水组小鼠每3天腹腔注射一次生理盐水,分别在第1,4,7和11天注射,剂量为0.2ml/只/天。给药的第11天,称小鼠体重,乙醚麻醉,剖取各组小鼠的肿瘤称重,数据列入表2。数据表明在8.4μmol/kg/天剂量下化合物4的抗肿瘤活性与84μmol/kg/天剂量下吉西他滨的抗肿瘤活性无显著性差异。可见,化合物4的抗肿瘤活性是吉西他滨的抗肿瘤活性的10倍。在0.84μmol/kg/天的剂量下化合物4仍然具有抗肿瘤活性。可见,化合物4抗肿瘤的最低有效剂量是0.84μmol/kg/天。抗肿瘤活性比吉西他滨强10倍以及最低有效剂量低至0.84μmol/kg/天都显示本发明有突出的技术效果。

表2化合物4抑制s180荷瘤小鼠肿瘤生长活性

a)与生理盐水比p<0.01,与吉西他滨比p>0.05；b)与生理盐水及8.4μmol/kg/天剂量组

比p<0.05；c)与生理盐水比p>0.05,与0.84μmol/kg/天剂量组比p<0.05；n＝12.

实验例3化合物4对小鼠肝功能的影响

谷丙转氨酶和谷草转氨酶是反映肝损伤的重要生化指标。为了考察化合物4对肿瘤小鼠肝功能的潜在影响,本发明按照试剂盒说明书规定的标准操作测定了谷丙转氨酶与谷草转氨酶在s180小鼠血清中的浓度。结果见表3。数据表明在8.4μmol/kg/天剂量下化合物4治疗的s180小鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶的浓度与生理盐水治疗的s180小鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶的浓度没有差异。可见,化合物4治疗不损伤s180小鼠的肝功能。相反,在84μmol/kg/天剂量下吉西他滨治疗的s180小鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶浓度与生理盐水治疗的s180小鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶的浓度有显著性差异。可见,吉西他滨治疗损伤s180小鼠的肝功能。在抗肿瘤活性与吉西他滨相同的前提下化合物4治疗不损伤s180小鼠的肝功能,体现了本发明的突出技术效果。

表3化合物4对s180小鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶浓度的影响

a)与生理盐水比p<0.05；b)与生理盐水比p>0.05；n＝4.

实验例4化合物4对小鼠肾功能的影响

肌酐和尿素氮是反映肾损伤的重要生化指标。为了考察化合物4对肿瘤小鼠肾功能的潜在影响,本发明按照试剂盒说明书规定的标准操作测定了肌酐和尿素氮在s180小鼠血清中的浓度。数据见表4。数据表明在8.4μmol/kg/天剂量下化合物4治疗的s180小鼠血清肌酐和尿素氮浓度与生理盐水治疗的s180小鼠血清肌酐和尿素氮浓度没有差异。可见,化合物4治疗不损伤s180小鼠的肾功能。相反,在84μmol/kg/天剂量下吉西他滨治疗的s180小鼠血清肌酐和尿素氮浓度与生理盐水治疗的s180小鼠血清肌酐和尿素氮浓度有显著性差异。可见,吉西他滨治疗损伤s180小鼠的肾功能。在抗肿瘤活性与吉西他滨相同的前提下化合物4治疗不损伤s180小鼠的肾功能,体现了本发明的突出技术效果。

表4化合物4对小鼠血清肌酐和尿素氮浓度的影响

a)与生理盐水比p<0.01；b)与生理盐水比p>0.05；n＝4.

实验例5化合物4对s180小鼠的骨髓毒性

骨髓抑制毒性主要表现在降低血液中红细胞,白细胞,血小板及中性粒细胞计数。不降低淋巴细胞计数。为了考察化合物4治疗的潜在骨髓毒性,本发明采用迈瑞全自动三分类血球分析仪bc3000测定了化合物4治疗的s180小鼠血液中红细胞,白细胞及血小板计数。结果见表5。数据表明在8.4μmol/kg/天剂量下化合物4治疗的s180小鼠血液中红细胞,白细胞及血小板计数与生理盐水治疗的s180小鼠血液中红细胞,白细胞及血小板计数没有显著性差异。可见,化合物4治疗对s180小鼠没有骨髓毒性。相反,在84μmol/kg/天剂量下吉西他滨治疗的s180小鼠血液中红细胞,白细胞及血小板计数与生理盐水治疗的s180小鼠血液中红细胞,白细胞及血小板计数有显著性差异。可见,吉西他滨对s180小鼠有骨髓毒性。在抗肿瘤活性与吉西他滨相同的前提下化合物4没有骨髓毒性,体现了本发明的突出技术效果。

表5化合物4对小鼠红细胞,白细胞和血小板计数的影响

a)与生理盐水比p<0.01；b)与生理盐水比p>0.05；n＝8.

实验例6化合物4的肿瘤靶向性

为考察化合物4的肿瘤靶向性,本发明将实验例2获得的生理盐水及化合物4治疗的s180小鼠的肿瘤组织,肝脏,脾脏,肾脏,脑,心脏和血制备匀浆。制备肿瘤组织,肝脏,脾脏,肾脏,脑,心脏的匀浆时按1g/9ml(w/v)将它们分别与生理盐水混合,用组织匀浆机将打匀浆,定量吸取匀浆液,按1ml匀浆液/3ml色谱纯甲醇(v/v)将匀浆液与色谱纯甲醇混合,室温超声30min,12000rmp/分钟离心10min,吸取上清液测傅里叶变换电喷雾(+)串联质谱,即ft-(esi+)/ms。测定表明,在肝脏,脾脏,肾脏,脑和心脏的匀浆中均未发现任何与化合物4相关的峰。在血液匀浆中发现了质量数为736.28332的峰,这是化合物4的[m+h]⁺,理论值为736.28260。不过没有发现化合物4的任何代谢产物峰。结果见图1。在血浆中能够检测到化合物4的精确分子量,而没有检测到吉西他滨的精确分子量,说明化合物4在血浆中可以稳定存在。这为化合物4靶向运送到肿瘤部位奠定了基础。

在化合物4治疗的小鼠肿瘤匀浆的ft-ms(esi⁺)谱中测到质量数为736.28302的离子(化合物4的离子峰,精确[m+h]⁺为736.28260)；测到质量数为691.30136的离子(化合物4减no2的离子峰,也就是rgdv-吉西他滨的离子峰,精确[m+h]⁺为691.29697)；测到质量数为557.17313的离子(gdv-吉西他滨的离子峰,精确[m+na]⁺为557.17780)；测到质量数为478.16946的离子(dv-吉西他滨的离子峰,精确[m+h]⁺为478.16439)；测到质量数为363.20608的离子(v-吉西他滨的离子峰,精确[m+h]⁺为363.20939)；测到质量数为264.07717的离子(吉西他滨的离子峰,精确[m+h]⁺为264.07903)；测到质量数为468.21153的离子(rgdv的离子峰,精确[m+na]⁺为468.21771。测定到的这些离子说明,化合物4从血液循环进入肿瘤组织之后,先丢失no2生成arg-gly-asp-val-吉西他滨,然后释放吉西他滨发挥抗肿瘤作用。

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