针对破伤风毒素的抗体及其用途的制作方法

发明领域本发明通常涉及基因工程和抗体药物领域；具体而言，本申请涉及针对破伤风毒素的抗体及其用途。发明背景破伤风是由破伤风梭状芽孢杆菌分泌的神经毒素引起的急性、致死性疾病，人兽共患，最易感动物为奇蹄目的马、骡、驴等。人类对由破伤风梭状芽孢杆菌分泌的神经毒素也易感，可以在任何年龄发病。在经济不发达地区，新生儿破伤风是新生儿死亡的主要因素之一。破伤风的潜伏期通常为3-21天，大多数在10天左右，但根据伤口特征、范围和部位，也可能为1天至数月。典型的破伤风临床表现为牙关紧闭，运动神经中枢应激性增高，局部或全身肌肉痉挛性麻痹。患者多死于窒息及全身器官衰竭，即便有了现代加强监护的条件，病例死亡率也非常高，特别是在严重自然灾害后，破伤风死亡率可达19％至31％。破伤风的临床类型分为3种：全身型破伤风、局部型破伤风和头部型破伤风，其中全身型破伤风约占88％，局部型破伤风约占12％，头部型破伤风约占1％。破伤风梭状芽孢杆菌是严格厌氧的革兰氏阳性菌，有鞭毛无荚膜，其芽孢广泛存在于施肥土壤、街道尘土、腐臭污泥、动物肠道和污染物体表面。破伤风梭状芽孢杆菌主要通过伤口进入人体，若伤口狭且深，或者伤口同时感染了嗜氧的化脓菌，在厌氧条件下破伤风梭状芽孢杆菌会大量繁殖并产生三种外毒素，其中破伤风毒素引起破伤风的特征性症状，刺激保护性抗体产生1。但也有约20％的患者未发现明显的侵入伤口，推测破伤风梭状芽孢杆菌也能通过小的擦伤面侵入机体。破伤风梭状芽孢杆菌根据鞭毛抗原凝集反应分为10个血清型，但所有血清型都产生同一种神经毒素，各型菌株所产生的毒素可以被任何一型抗毒素中和。破伤风毒素的毒性非常强，仅次于肉毒毒素，对小鼠的致死剂量仅为2-6ng/kg。破伤风毒素(tetanustoxin)，又称为破伤风神经毒素(tetanusneurotoxin)，其是单链蛋白，相对分子质量为约150kda，由1315个氨基酸残基组成，被切割成由二硫键连接的轻链(片段a，50kda)和重链(hc，100kda)，从而变成活性形式2。片段a是锌金属蛋白酶，进入胞质后消化囊泡相关膜蛋白-2(vamp-2)，阻断甘氨酸和γ-氨基丁酸(gaba)等抑制性神经递质释放，引起肌肉痉挛性麻痹3。重链包括两个功能性结构域，c末端结构域(片段c)与神经细胞表面结合，使得毒素分子内吞入囊泡；n末端结构域(片段b)则穿过囊泡膜将片段a转运至神经元胞浆中4。片段c又分为c末端亚结构域(hcc)和n末端亚结构域(hcn)5。破伤风毒素进入神经细胞的过程尚未完全清楚，目前普遍接受的是双受体机制，一种是神经节苷脂受体，尤其是gt1b和gd1b，另一种是蛋白受体6。破伤风属于可预防性疾病，创伤后可以进行主动免疫和被动免疫。体液免疫对破伤风具有保护作用。中和抗体与毒素结合，干扰毒素与靶细胞上的受体作用以及随后内化进入细胞的过程。临床上对于免疫史不清或未免疫、未完成初始免疫、完成初始免疫但最近一次加强超过5年的外伤患者都建议进行被动免疫。目前临床上用于预防和治疗破伤风的被动免疫制剂有两种，一种是破伤风抗毒素(tat)，其为用破伤风类毒素免疫的马血浆经酶消化、盐析制成，使用前需皮试，容易引起过敏反应，过敏发生率为5％-30％，偶见过敏性休克。另一种是人破伤风免疫球蛋白(higt)，由乙型肝炎疫苗免疫后再经破伤风类毒素免疫的献血员中采集破伤风抗体效价高的血浆或血清，经低温乙醇法提取。higt使用时无需皮试，可直接注射，但由于其属于血液制品，存在感染丙肝、艾滋病等传染病的潜在风险，而且受来源限制，产量较低，成本较高，且批次间质量不均一7。抗体药物能够克服以上部分缺点，并且还具有一定优势，例如可以通过哺乳动物细胞表达系统稳定表达，成分明确等。基于临床需求，探索和研发可以中和破伤风毒素，预防和治疗破伤风的抗体具有重要的医学意义。发明概述第一方面，本申请提供了双特异性抗体，其包含结合破伤风毒素不同表位的第一抗原结合片段和第二抗原结合片段，并且所述双特异性抗体具有中和破伤风毒素的活性。在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含：氨基酸序列为sywiy(seqidno：1)的hcdr1，氨基酸序列为einptngfanynekfkt(seqidno：2)或einptagfanynekfkt(seqidno：3)或einptnafanynekfkt(seqidno：4)的hcdr2，氨基酸序列为hfrfpy(seqidno：5)的hcdr3，氨基酸序列为rasqdigsslt(seqidno：6)的lcdr1，氨基酸序列为atsslds(seqidno：7)的lcdr2和氨基酸序列为lqyasspyt(seqidno：8)的lcdr3；其中，hcdr和lcdr氨基酸序列根据kabat定义。在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段包含：氨基酸序列为dygvn(seqidno：9)的hcdr1，氨基酸序列为miwsdgttdyssalks(seqidno：10)的hcdr2，氨基酸序列为vdgyshyyamdy(seqidno：11)的hcdr3，氨基酸序列为raseniysyla(seqidno：12)的lcdr1，氨基酸序列为naktlae(seqidno：13)的lcdr2和氨基酸序列为qhhyglpft(seqidno：14)的lcdr3；其中，hcdr和lcdr氨基酸序列根据kabat定义。在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如seqidno：15所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqidno：18所示；或者所述第一抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如seqidno：16所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqidno：18所示；或者所述第一抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如seqidno：17所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqidno：18所示。在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如seqidno：19所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqidno：20所示。在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段和第二抗原结合片段的形式独立地选自单链抗体(scfv)或fab片段。在第二方面，本申请提供了结合破伤风毒素的单克隆抗体，其包含：氨基酸序列为sywiy(seqidno：1)的hcdr1，氨基酸序列为einptngfanynekfkt(seqidno：2)或einptagfanynekfkt(seqidno：3)或einptnafanynekfkt(seqidno：4)的hcdr2，氨基酸序列为hfrfpy(seqidno：5)的hcdr3，氨基酸序列为rasqdigsslt(seqidno：6)的lcdr1，氨基酸序列为atsslds(seqidno：7)的lcdr2和氨基酸序列为lqyasspyt(seqidno：8)的lcdr3；其中，hcdr和lcdr氨基酸序列根据kabat定义。在第三方面，本申请提供了结合破伤风毒素的单克隆抗体，其包含：氨基酸序列为dygvn(seqidno：9)的hcdr1，氨基酸序列为miwsdgttdyssalks(seqidno：10)的hcdr2，氨基酸序列为vdgyshyyamdy(seqidno：11)的hcdr3，氨基酸序列为raseniysyla(seqidno：12)的lcdr1，氨基酸序列为naktlae(seqidno：13)的lcdr2和氨基酸序列为qhhyglpft(seqidno：14)的lcdr3；其中，hcdr和lcdr氨基酸序列根据kabat定义。第四方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的双特异性抗体、或者第二方面或第三方面所述的单克隆抗体以及药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。第五方面，本申请提供了第一方面所述的双特异性抗体、第二方面或第三方面所述的单克隆抗体、或者第四方面所述的药物组合物在制备用于预防或治疗破伤风的药物中的用途。附图简述图1显示elisa分析抗tt-hc单克隆抗体s22e2-migg2a和s24b8-migg2a对s22e2纯化噬菌体与tt-hc结合的抑制作用。图2显示elisa分析抗tt-hc单克隆抗体s22e2-migg2a和s24b8-migg2a对s24b8纯化噬菌体与tt-hc结合的抑制作用。图3显示elisa分析抗tt-hc单克隆抗体s22e2-migg2a和s24b8-migg2a对tt-hc与神经节苷脂gt1b结合的抑制作用。图4显示了抗破伤风毒素单克隆抗体对破伤风毒素的中和作用。图5显示了抗破伤风毒素单克隆抗体联用对balb/c小鼠避免致死性破伤风毒素攻击的保护作用。图6显示了双特异性抗体s22e2h1-scfv-fch1+s24b8h3-igg1k对tt-hc与神经节苷脂gm1结合的抑制作用。图7显示了双特异性抗体s22e2h1-scfv-fch1+s24b8h3-igg1k对tt-hc与神经节苷脂gd3结合的抑制作用。图8显示了双特异性抗体s22e2h1-scfv-fch1+s24b8h3-igg1k对tt-hc与神经节苷脂gt1b结合的抑制作用。图9显示了抗破伤风毒素双特异性抗体s22e2h1-scfv-fch1+s24b8h3-igg1k的中和活性结果。序列说明seqidno：1显示人源化的重链可变区突变体s24b8vh-h1、s24b8vh-h2和s24b8vh-h3的hcdr1的氨基酸序列。seqidno：2显示人源化的重链可变区突变体s24b8vh-h1的hcdr2的氨基酸序列。seqidno：3显示人源化的重链可变区突变体s24b8vh-h2的hcdr2的氨基酸序列。seqidno：4显示人源化的重链可变区突变体s24b8vh-h3的hcdr2的氨基酸序列。seqidno：5显示人源化的重链可变区突变体s24b8vh-h1、s24b8vh-h2和s24b8vh-h3的hcdr3的氨基酸序列。seqidno：6-8分别显示了人源化的轻链可变区突变体s24b8vk-h1的lcdr1、lcdr2和lcdr3的氨基酸序列。seqidno：9-11分别显示人源化的重链可变区突变体s22e2vh-h1的hcdr1、hcdr2和hcdr3的氨基酸序列。seqidno：12-14分别显示人源化轻链可变区突变体s22e2vk-h1的lcdr1、lcdr2和lcdr3的氨基酸序列。seqidno：15显示人源化的重链可变区突变体s24b8vh-h1的氨基酸序列。seqidno：16显示人源化的重链可变区突变体s24b8vh-h2的氨基酸序列。seqidno：17显示人源化的重链可变区突变体s24b8vh-h3的氨基酸序列。seqidno：18显示人源化轻链可变区突变体s24b8vk-h1的氨基酸序列。seqidno：19显示人源化的重链可变区突变体s22e2vh-h1的氨基酸序列。seqidno：20显示人源化轻链可变区突变体s22e2vk-h1的氨基酸序列。seqidno：21显示为s24b8vh-h1+ch-igg1k的氨基酸序列。seqidno：22显示s24b8vh-h2+ch-igg1k的氨基酸序列。seqidno：23显示s24b8vh-h3+ch-igg1k的氨基酸序列。seqidno：24显示s24b8vk-h1+ck的氨基酸序列。seqidno：25显示s22e2-h1-scfv-fch1的氨基酸序列。seqidno：26显示破伤风毒素重链的c末端结构域重组蛋白(tt-hc)的氨基酸序列。seqidno：27显示his标签的氨基酸序列。seqidno：28显示人(homosapiens)重链恒定区igg1亚型的氨基酸序列。seqidno：29显示鼠(musmusculus)重链恒定区igg2a亚型的氨基酸序列。seqidno：30显示人igg1亚型突变体igg1h的氨基酸序列。seqidno：31显示人igg1亚型突变体igg1k的氨基酸序列。seqidno：32显示鼠igg2a亚型突变体migg2a-h的氨基酸序列。seqidno：33显示鼠igg2a亚型突变体migg2ak的氨基酸序列。seqidno：34显示人(homosapiens)轻链恒定区κ亚型的氨基酸序列。seqidno：35显示人(homosapiens)轻链恒定区λ亚型的氨基酸序列。seqidno：36显示鼠(musmusculus)轻链恒定区κ亚型的氨基酸序列。seqidno：37显示鼠(musmusculus)轻链恒定区λ亚型的氨基酸序列。seqidno：38显示引物pmcgr的核苷酸序列。seqidno：39显示引物pmckr的核苷酸序列。seqidno：40显示含有knob突变的fc段(fck)的氨基酸序列。seqidno：41显示含有hole突变的fc段(fch1)的氨基酸序列。发明详述本申请的发明人对针对破伤风抗体药物进行了深入研发，并通过抗体工程技术得到了新的针对破伤风毒素的双特异性抗体和单克隆抗体。破伤风毒素是大分子蛋白，由数个结构域组成，理论上有多个激发体液免疫的表位，从免疫个体中可以获得结合不同表位的抗体。破伤风毒素片段c是结合受体的结构域，针对片段c的抗体大概率具有中和活性，阻断毒素与神经节苷脂gt1b、gd1b和gm1结合的抗体，对毒素具有中和作用。在本申请的多个方面，提供了新的针对破伤风毒素的双特异性抗体和单克隆抗体，编码所述双特异性抗体或单克隆抗体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、制备和纯化所述双特异性抗体或单克隆抗体的方法及所述双特异性抗体或单克隆抗体的医学和生物学应用。根据本申请提供的双特异性抗体或单克隆抗体的可变区的序列，可构建全长的双特异性抗体分子或单克隆抗体分子作为药物在临床上用于预防或治疗破伤风。除非另外指明，本申请的实施采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。定义如本文所用术语“抗体”，是指能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合到标靶的免疫球蛋白分子。标靶包括但不限于碳水化合物、多聚核苷酸、脂质、多肽等。本文所使用的“抗体”不仅包括完整的(即全长的)抗体，而且还包括其抗原结合片段(例如fab、fab'、f(ab')2、fv)、其变异体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及任何其他包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修改配置，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及共价修饰的抗体。通常，完整或全长的抗体包含两个重链和两个轻链。每个重链含有重链变异区(vh)和第一、第二及第三恒定区(ch1、ch2及ch3)。每个轻链含有轻链变异区(vl)和恒定区(cl)。全长的抗体可以是任何种类的抗体，例如igd、ige、igg、iga或igm(或上述的子类)，但抗体不需要属于任何特定的类别。根据重链的恒定域的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同的类别。通常，免疫球蛋白有五种主要的类别：iga、igd、ige、igg及igm，而且这些类别中有几个可以再被进一步区分成子类(同型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1及iga2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ、以及μ。不同类别的免疫球蛋白的子单元结构和三维结构是公知的。如本文所用术语“双特异性抗体”是具有结合两种不同抗原能力的抗体。双特异性抗体可以具有多种结构构型。例如，双特异性抗体可以由两个fc片段以及分别与其融合的两个抗原结合部分组成(与天然抗体相似，区别在于两个臂结合不同的抗原靶标或表位)，抗原结合部可以为单链抗体(scfv)或fab片段两种形式。当针对给定的两种抗原时，双特异性抗体的两个不同的抗原结合部各自与一个fc片段的n端结合，两个臂的抗原结合部配置可以具有四种组合方式：scfv+fab片段、fab片段+scfv、scfv+scfv和fab片段+fab片段。fc片段可以包含能够确保重链异聚化的突变，kih技术(knob-in-hole，kih)是解决重链异聚化的一种策略。通常，kih技术是指通过改造ch3区的氨基酸序列，形成有利于异种半抗体相互配对的结构，可以在构成双特异性抗体的同时又尽可能地保持正常抗体的结构。关于kih技术的指导，例如可参见“anefficientroutetohumanbispecificigg”,a.margaretmerchantetal.,naturebiotechnology,volume16,1998，通过引用的方式将该文献全文并入本文。此外，双特异性抗体的结构可以是结合第一抗原的抗体(例如天然抗体形式)从ch3区的c端延伸出(可以通过柔性连接子)能结合第二抗原的抗原结合部分。如本文所用术语“抗原结合部分”或“抗原结合片段”可互换使用，是指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区域。抗原结合域可以包含重链变异区(vh)、轻链变异区(vl)或上述两者。vh和vl中的每个通常含有三个互补决定区cdr1、cdr2及cdr3。本领域技术人员公知，互补决定区(cdr，通常有cdr1、cdr2及cdr3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。vh或vl的cdr序列有两种常见的定义方式，即kabat定义和chothia定义。(参阅例如kabat,“sequencesofproteinsofimmunologicalinterest”，nationalinstitutesofhealth,bethesda，md.(1991)；a1-lazikanietal.，j.mol.biol.273:927-948(1997)；以及martinetal.，proc.natl.acad.sci.usa86:9268-9272(1989))。对于给定抗体的可变区序列，可以根据kabat定义或者chothia定义来确定vh和vl序列中cdr区序列。在本申请的实施方案中，利用kabat定义cdr序列。对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列中cdr区序列，例如可以利用在线软件abysis确定(http://www.abysis.org/)。对于一般抗体而言，抗原结合片段的实例包括但不限于：(1)fab片段，其可以是具有vl-cl链和vh-ch1链的单价片段；(2)f(ab')2片段，其可以是具有两个fab'片段的二价片段，该两个fab'片段由铰链区的二硫桥(即fab'的二聚物)连接；(3)具有抗体的单臂的vl和vh域的fv片段；(4)单链fv(scfv)，其可以是由vh域和vl域经由胜肽连接符组成的单一多胜肽链；以及(5)(scfv)2，其可以包含两个由胜肽连接符连接的vh域和两个vl域，该两个vl域是经由二硫桥与该两个vh域组合。在双特异性抗体构建中，“抗原结合部分”包括但不限于fab片段的形式或单链抗体(scfv)的形式。如本文所用术语“单链抗体(scfv,singlechainfragmentvariable)”是指一般利用基因工程技术构建的单链结构的抗体，包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的一条多肽链。在重链可变区和轻链可变区之间通常会设计一段柔性的连接肽(linker)以便重链可变区和轻链可变区可以折叠成为能够结合抗原的正确构象。如本文所用术语“fab(fragmentantigenbinding)片段”、“fab部分”或类似的术语是指完整的抗体用木瓜蛋白酶处理后产生的能够与抗原结合的抗体片段，包括完整的轻链(vl-cl)、重链可变区和ch1片段(vh-ch1)。如本文所用术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。本文所述单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而重链和/或轻链的余下部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，并且还包括这样的抗体的片段，只要它们能表现出所期望的生物学活性(美国专利号4,816,567；和morrison等人，proc.natl.acad.sci.usa81:6851-6855(1984))。如本文所用术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合。第一方面，本申请提供了双特异性抗体，其包含结合破伤风毒素不同表位的第一抗原结合片段和第二抗原结合片段，并且所述双特异性抗体具有中和破伤风毒素的活性。在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含：氨基酸序列为sywiy(seqidno：1)的hcdr1，氨基酸序列为einptngfanynekfkt(seqidno：2)或einptagfanynekfkt(seqidno：3)或einptnafanynekfkt(seqidno：4)的hcdr2，氨基酸序列为hfrfpy(seqidno：5)的hcdr3，氨基酸序列为rasqdigsslt(seqidno：6)的lcdr1，氨基酸序列为atsslds(seqidno：7)的lcdr2和氨基酸序列为lqyasspyt(seqidno：8)的lcdr3；其中，hcdr和lcdr氨基酸序列根据kabat定义。在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段包含：氨基酸序列为dygvn(seqidno：9)的hcdr1，氨基酸序列为miwsdgttdyssalks(seqidno：10)的hcdr2，氨基酸序列为vdgyshyyamdy(seqidno：11)的hcdr3，氨基酸序列为raseniysyla(seqidno：12)的lcdr1，氨基酸序列为naktlae(seqidno：13)的lcdr2和氨基酸序列为qhhyglpft(seqidno：14)的lcdr3；其中，hcdr和lcdr氨基酸序列根据kabat定义。在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如seqidno：15所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqidno：18所示；或者所述第一抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如seqidno：16所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqidno：18所示；或者所述第一抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如seqidno：17所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqidno：18所示。在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如seqidno：19所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqidno：20所示。在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段和第二抗原结合片段的形式独立地选自单链抗体(scfv)或fab片段。在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段为fab片段，所述第二抗原结合片段为单链抗体(scfv)。在第一方面的一些实施方案中，所述双特异性抗体包含seqidno:21、22和23之一所示的氨基酸序列以及seqidno:24所示的氨基酸序列。在第一方面的一些实施方案中，所述的双特异性抗体包含seqidno:25所示的氨基酸序列。在第二方面，本申请提供了结合破伤风毒素的单克隆抗体，其包含：氨基酸序列为sywiy(seqidno：1)的hcdr1，氨基酸序列为einptngfanynekfkt(seqidno：2)或einptagfanynekfkt(seqidno：3)或einptnafanynekfkt(seqidno：4)的hcdr2，氨基酸序列为hfrfpy(seqidno：5)的hcdr3，氨基酸序列为rasqdigsslt(seqidno：6)的lcdr1，氨基酸序列为atsslds(seqidno：7)的lcdr2和氨基酸序列为lqyasspyt(seqidno：8)的lcdr3；其中，hcdr和lcdr氨基酸序列根据kabat定义。在第二方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体包含：如seqidno：15所示的重链可变区氨基酸序列，如seqidno：18所示的轻链可变区氨基酸序列；或者如seqidno：16所示的重链可变区氨基酸序列，如seqidno：18所示的轻链可变区氨基酸序列；或者如seqidno：17所示的重链可变区氨基酸序列，如seqidno：18所示的轻链可变区氨基酸序列。在第三方面，本申请提供了结合破伤风毒素的单克隆抗体，其包含：氨基酸序列为dygvn(seqidno：9)的hcdr1，氨基酸序列为miwsdgttdyssalks(seqidno：10)的hcdr2，氨基酸序列为vdgyshyyamdy(seqidno：11)的hcdr3，氨基酸序列为raseniysyla(seqidno：12)的lcdr1，氨基酸序列为naktlae(seqidno：13)的lcdr2和氨基酸序列为qhhyglpft(seqidno：14)的lcdr3；其中，hcdr和lcdr氨基酸序列根据kabat定义。在第三方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体包含如seqidno：19所示的重链可变区氨基酸序列，如seqidno：20所示的轻链可变区氨基酸序列。第四方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的双特异性抗体、或者第二方面或第三方面所述的单克隆抗体以及药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。在第四方面的一些实施方案中，所述药物组合物用于预防或治疗破伤风。在第四方面的一些实施方案中，所述药物组合物还可包含下述物质中的一种或多种：润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂，如苯甲酸、山梨酸和丙酸钙；增甜剂和/或调味剂等。在第四方面的一些实施方案中，可以将本申请中的药物组合物配制为片剂、丸剂、粉剂、锭剂、酏剂、悬液、乳剂、溶液、糖浆、栓剂或胶囊等形式。在第四方面的一些实施方案中，可以利用任何生理上可接受的给药方式递送本申请的药物组合物，这些给药方式包括但不限于：口服给药、肠胃外给药、经鼻给药、直肠给药、腹膜内给药、血管内注射、皮下给药、经皮给药、吸入给药等。在第四方面的一些实施方案中，可以通过混合具有所需纯度的试剂与视情况的药学上可接受的载体、赋形剂等，以冻干制剂或水溶液的形式配制用于治疗用途的药物组合物用于存储。第五方面，本申请提供了第一方面所述的双特异性抗体、第二方面或第三方面所述的单克隆抗体、或者第四方面所述的药物组合物在制备用于预防或治疗破伤风的药物中的用途。第六方面，本申请提供了预防或治疗破伤风的方法，包括向有需要的个体给予第一方面所述的双特异性抗体、第二方面或第三方面所述的单克隆抗体、或者第四方面所述的药物组合物。在其他方面，本申请提供了核酸分子，其编码第一方面所述的双特异性抗体、第二方面或第三方面所述的单克隆抗体。在一些实施方案中，所述核酸分子可操作地连接到调控序列，调控序列可以被用所述载体转化过的宿主细胞识别。本申请还提供包含编码第一方面所述的双特异性抗体、第二方面或第三方面所述的单克隆抗体的分离的核酸分子的载体以及包含所述核酸分子或载体的宿主细胞。在其他方面，本申请还提供产生第一方面所述的双特异性抗体、第二方面或第三方面所述的单克隆抗体的方法。在一些实施方案中，产生第一方面所述的双特异性抗体、第二方面或第三方面所述的单克隆抗体的方法包括培养宿主细胞以便于表达核酸。在一些实施方案中，产生第一方面所述的双特异性抗体、第二方面或第三方面所述的单克隆抗体的方法还包括从宿主细胞培养基中回收双特异性抗体或单克隆抗体。应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。实施例实施例1：重组破伤风毒素抗原以及重组抗体的制备1.1.重组破伤风毒素抗原的制备制备抗破伤风毒素单克隆抗体的过程中需要用到破伤风毒素重链的c末端结构域重组蛋白(tt-hc，seqidno:26)。这个蛋白源于破伤风梭菌，不存在翻译后修饰，因而可以利用大肠杆菌表达系统进行表达。此外，在这个重组蛋白的c端添加了his标签(his，seqidno:27)，将更有利于重组蛋白的纯化和单克隆抗体功能的鉴定。根据uniprot数据库的tt-hc重组蛋白的氨基酸序列，设计并合成编码tt-hc的基因(包含his标签)。利用常规的分子生物学技术将合成的基因克隆至合适的真核表达载体(如invitrogen公司的pet-22b等)，表达质粒转化大肠杆菌感受态(如索莱宝公司的bl21(de3)等)，表达tt-hc-his重组蛋白的大肠杆菌用iptg(如索莱宝公司的i8070-1g等)诱导表达。然后通过离心等方式收集菌体，用超声波细胞破碎仪(如sonics公司的vcx130等)超声破碎菌体，通过离心等方式收集上清。利用金属螯合亲和层析柱(如ge公司的histrapff等)对上清中的重组蛋白进行一步纯化。然后利用脱盐柱(如ge公司的hitrapdesaulting等)将重组蛋白保存缓冲液置换为pbs(ph7.0)或者其他合适的缓冲液。必要时，可以对样品进行过滤除菌，然后分装保存于-20℃。1.2.重组抗体制备利用常规的分子生物学手段，将编码抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列分别克隆至融合有编码重链恒定区和轻链恒定区核苷酸序列的真核表达载体(如invitrogen公司的pcdna3.1等)中，组合表达全抗体。抗体的重链恒定区可以是人igg1亚型(seqidno：28)、鼠igg2a亚型(seqidno：29)、基于kih(knob-into-hole)技术的人igg1亚型突变体igg1h(seqidno：30)和igg1k(seqidno：31)、或者鼠igg2a亚型突变体migg2a-h(seqidno：32)和migg2ak(seqidno：33)，轻链恒定区可以是人κ亚型(seqidno：34)、人λ亚型(seqidno：35)、鼠κ亚型(seqidno：36)或者鼠λ亚型(seqidno：37)。利用脂质体(如invitrogen公司的293fectin等)或其它转染试剂(如pei等)将制备的重组抗体表达质粒转染入hek293细胞(如invitrogen公司的hek293f)，在无血清悬浮培养条件下培养3-5天。然后通过离心等方式收获培养上清，利用proteina/g亲和层析柱(如ge公司的mabselectsure等)进行一步纯化。然后利用脱盐柱(如ge公司的hitrapdesaulting等)将重组蛋白保存缓冲液置换为pbs(ph7.0)或者其它合适的缓冲液。必要时，可以对抗体样品进行过滤除菌，然后分装保存于-20℃。实施例2:小鼠免疫以及免疫库的构建以实施例1中制备的重组蛋白tt-hc-his为抗原，免疫6-8周龄的balb/c小鼠，免疫剂量为50μg/只小鼠，每14天加强免疫1次，初免后8周处死小鼠并收集脾细胞。使用小鼠淋巴细胞分离液(达科为生物技术股份有限公司，cat#dkw33-r0100)对小鼠脾脏淋巴细胞进行分离，利用细胞总rna提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，cat#dp430)，将分离的淋巴细胞进行总rna的提取。以提取的总rna为模板，利用第一链cdna合成试剂盒(thermoscientific，cat#k1621)分别合成抗体重链可变区和轻链可变区，反转录引物采取基因特异性引物，引物配对区分别位于抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区，具体序列分别为pmcgr:tgcatttgaactccttgcc(seqidno：38)和pmckr:ccatcaatcttccacttgac(seqidno：39)。将合成的cdna立即存放于-70℃保存备用。然后以反转录得到的cdna为模板，参考文献(krebbera,bornhausers,burmesterj,etal.reliablecloningoffunctionalantibodyvariabledomainsfromhybridomasandspleencellrepertoiresemployingareengineeredphagedisplaysystem.jimmunolmethods.1997；201(1):35-55，通过引用方式将上述文献的全部内容并入本文中)合成引物，并利用pcr分别扩增编码鼠抗体vh和vk的核苷酸序列，然后利用重叠延伸pcr技术，构建单链抗体(scfv)基因。最后将制备的小鼠单链抗体核苷酸序列克隆至载体padscfv-s(实验技术流程可参见中国专利申请第201510097117.0号的实施例1，通过引用方式将上述专利申请的全部内容并入本文中)，构建scfv库。抗体库的库容达到5×10e8，正确率为50％。实施例3：小鼠免疫库的筛选和初步鉴定3.1.小鼠免疫库的筛选参照文献(中国专利申请第201510097117.0号，通过引用方式将上述专利申请的全部内容并入本文中)，以实施例1制备的重组人tt-hc-his为抗原，利用固相筛选策略(实验方案参考噬菌体展示：通用实验指南/(美)克拉克森(clackson,t.)，(美)洛曼(lowman,h.b.)编；马岚等译。化学工业出版社，2008.5)筛选实施例2构建的展示小鼠单链抗体的噬菌体库，通过结合、洗脱、中和、感染、扩增的方式共进行三轮筛选，最终获得两株特异结合人tt-hc-his的单链抗体s22e2和s24b8。利用常规的分子生物学手段，将编码s22e2和s24b8的重链及轻链核苷酸序列分别克隆至融合有编码小鼠migg2a重链恒定区和小鼠κ轻链恒定区核苷酸序列的真核表达载体，制备重组鼠源抗体。3.2.重组抗tt-hc单克隆抗体的亲和力分析利用biacorex100通过表面等离子共振技术测定抗tt-hc抗体的亲和力。氨基偶联试剂盒(br-1000-50)、鼠抗体捕获试剂盒(br-1008-38)，cm5芯片(br100012)和ph7.4的10×hbs-ep(br100669)等相关试剂和耗材均购自gehealthcare。依照试剂盒中的说明书，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochlorid，edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(n-hydroxysuccinimide，nhs)对羧基化cm5芯片表面进行活化，将抗鼠igg(fc)抗体(捕获抗体)用10mmph5.0乙酸钠稀释至25μg/ml，之后以流速10μl/min注射以实现大约高达10000个响应单位(ru)的偶联量。注射捕获抗体之后，注射1m乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，稀释抗tt-hc抗体至0.5-1μg/ml，10μl/min注射，保证50ru左右的抗体被抗鼠fc的抗体捕获。然后将tt-hc-his设置一系列的浓度梯度(例如6.17nm、18.5nm、55.6nm、167nm和500nm)，于25℃下以30μl/min从低浓度到高浓度进行注射，结合时间为120s，解离时间为3600s，以10μl/min注射10mmph2.0的甘氨酸-hcl溶液30s对芯片表面进行再生。使用biacorex100评估软件2.0.1版，通过1:1结合模型拟合结合和解离传感图来计算结合速率(ka)和解离速率(kd)。以比率kd/ka计算解离平衡常数(kd)。拟合结果如表1所示。表1.重组抗tt-hc单克隆抗体结合tt-hc-his亲和力常数kakdkds22e2-migg2a6.424e+41.589e-42.473e-9s24b8-migg2a5.488e+41.015e-51.849e-10实施例4：抗破伤风毒素单克隆抗体的表位分析使用重组蛋白tt-hc-his包被96孔elisa板(3μg/ml，100μl/孔)，4℃冰箱包被过夜。利用封闭液pbs-0.1％tween20-3％牛奶在37℃封闭1小时。用固定浓度(1*1011cfu/ml)的s22e2纯化噬菌体(s22e2噬菌体)对s22e2-migg2a和s24b8-migg2a鼠源抗体进行梯度稀释，起始浓度50μg/ml，3倍梯度稀释，共11个浓度滴度，100μl/孔加入封闭好的96孔elisa板中，37℃孵育1小时。使用pbs-0.1％tween20洗涤elisa板，然后加入hrp抗m13二抗(北京义翘神州科技股份有限公司，11973-mm05t-h)，37℃孵育1小时。使用pbs-0.1％tween20洗涤elisa板，加入opd底物显色液，5-10分钟后用1m的h2so4终止显色，使用酶标仪测定492nm/630nm双波长光密度值。elisa分析结果(图1)显示，s22e2-migg2a可以完全抑制s22e2噬菌体和tt-hc重组蛋白的结合信号，但s24b8-migg2a对s22e2噬菌体和tt-hc的结合没有影响。类似地，用固定浓度的s24b8纯化噬菌体(s24b8噬菌体)对s22e2-migg2a和s24b8-migg2a进行梯度稀释，用hrp抗m13二抗检测s24b8噬菌体和tt-hc的结合信号。elisa结果(图2)显示，s24b8-migg2a可以完全抑制s24b8噬菌体和tt-hc重组蛋白的结合信号，但s22e2-migg2a对s24b8噬菌体和tt-hc的结合基本没有影响。综上所述，抗tt-hc单克隆抗体s22e2-migg2a和s24b8-migg2a结合tt-hc的不同表位。实施例5：破伤风毒素单克隆抗体抑制tt-hc与神经节苷脂的结合破伤风毒素可以通过hc结构域与神经细胞表面的特异性受体结合，目前普遍接受的是双受体机制，一种是神经节苷脂受体，另一种是蛋白受体。将神经节苷脂gt1b，用甲醇稀释至10μg/ml，100μl/孔包被96孔elisa板，室温放置过夜使甲醇挥发。使用封闭液pbs-0.1％tween20-1％bsa在37℃封闭1小时。用pbs对tt-hc进行梯度稀释，起始浓度100μg/ml，3倍梯度稀释，共7个浓度梯度；将抗tt-hc鼠源单克隆抗体用pbs稀释至40μg/ml，与tt-hc等体积混合后100μl/孔加入封闭好的96孔elisa板中，同时设置不加抗体的tt-hc对照组，37℃孵育1小时。使用pbs-0.1％tween20洗涤elisa板，加入hrp抗tt多克隆抗体(实验室制备)，100μl/孔，37℃孵育1小时。使用pbs-0.1％tween20洗涤elisa板，加入opd底物显色液，5-10分钟后用1m的h2so4终止显色，使用酶标仪测定492nm/630nm双波长光密度值。elisa分析结果(图3)显示，以tt-hc的结合曲线作为基准，加入s22e2-migg2a后结合曲线明显右移，说明s22e2-migg2a可以有效抑制tt-hc和神经节苷脂gt1b的结合，而s24b8-migg2a不抑制tt-hc与神经节苷脂的结合，相反具有一定的促进作用。实施例6：抗破伤风毒素单克隆抗体的中和活性通过将抗体和致死剂量破伤风毒素体外混合后注射balb/c小鼠确定抗体中和活性。将破伤风毒素与抗破伤风毒素单克隆抗体或抗毒素混合，37℃放置1小时，注射入balb/c小鼠右后腿肌肉。破伤风毒素注射剂量为20×ld50/只；商业化来源的马破伤风免疫球蛋白(f(ab')2)(标记为tat，上海赛伦生物技术股份有限公司)注射剂量为1iu/只，单克隆抗体s22e2和s24b8的注射剂量均为10μg/只，s24b8与s22e2联用的剂量为各抗体1.25μg/只；将注射20×ld50的破伤风毒素的balb/c小鼠作为对照组，共计5组，8只/组。用硼酸缓冲液将破伤风毒素稀释至800×ld50/ml(即与抗体等量混合后每50微升注射量中含20×ld50)；用硼酸缓冲液将马破伤风免疫球蛋白稀释至40iu/ml(即与破伤风毒素等量混合后每50微升注射量中含1iu)；用硼酸缓冲液将抗体s22e2和s24b8稀释至0.4mg/ml(或0.1mg/ml)(即s22e2或s24b8单用，与破伤风毒素等量混合后每50微升注射量中含10μg；s24b8与s22e2联用，等量混合的两种抗体再与破伤风毒素等量混合后每50微升注射量中各含1.25μg)。每只动物注射量为50μl的破伤风毒素和抗体混合物。实验结果如图4所示：对照组的所有balb/c小鼠都在攻击3天内死于破伤风，实验条件下，单克隆抗体s24b8或s22e2能部分中和毒素，延长小鼠存活期，而s24b8与s22e2联用可以完全中和毒素，小鼠在实验期内全部存活，与马破伤风免疫球蛋白tat的中和活性一致。实施例7：抗破伤风毒素单克隆抗体联用保护balb/c小鼠避免致死性破伤风毒素攻击balb/c小鼠进行免疫球蛋白暴露前免疫，再对已注射抗体的小鼠进行致死剂量破伤风毒素的攻击，确定抗体的保护效果。单克隆抗体s22e2和s24b8的注射剂量均为10μg/只，s24b8与s22e2联用组抗体注射剂量为各抗体1.25μg/只；将注射20×ld50的破伤风毒素的balb/c小鼠作为对照组，共计4组，8只/组。用硼酸缓冲液将破伤风毒素稀释至400×ld50/ml(即每50微升注射量中含20×ld50)；用硼酸缓冲液将抗体s22e2和s24b8稀释至0.2mg/ml(或0.05mg/ml)(即s22e2或s24b8单用，每50微升注射量中含10μg；s24b8与s22e2联用，两种抗体等量混合后每50微升注射量中各含1.25μg)。给予小鼠50μl抗破伤风毒素抗体，并在24小时后使用破伤风毒素对balb/c小鼠进行右后腿肌肉攻击，每只动物注射量为50μl破伤风毒素。实验结果如图5所示：对照组的所有balb/c小鼠都在攻击4天内死于破伤风，实验条件下，s24b8与s22e2联用能完全保护balb/c小鼠，在实验期内全部存活。实施例8：破伤风毒素单克隆抗体的人源化及脱氨基位点突变8.1.s24b8鼠单克隆抗体的人源化对鼠源单克隆抗体s24b8进行人源化研究以降低其免疫原性。人源化方案采取经典的框架移植策略(参见tanp,mitchellda,busstn,holmesma,anasettic,footej."superhumanized"antibodies:reductionofimmunogenicpotentialbycomplementarity-determiningregiongraftingwithhumangermlinesequences:applicationtoananti-cd28.jimmunol.2002；169(2):1119-1125，通过引用方式将上述文献的全部内容并入本文中)。将编码s24b8的重链可变区和轻链可变区的基因分别与imgt数据库中的人抗体胚系基因序列相比较，选择合适的胚系基因序列以提供抗体的框架区1至3(fr1+fr2+fr3)，选择合适的j区基因序列以提供框架区4(fr4)。这个模板可以根据多种因素选出，如：抗体的相对总长度、cdr的大小、位于抗体框架区(fr)和超变区(cdr)之间连接处的氨基酸残基、序列整体的同源性等。所选的模板可以是多个序列的混合物或者可以是共有模板，目的是尽可能维持亲本互补决定区(cdr)的合适构象。同时，为避免抗体超变区(cdr)中脱氨基位点ng可能带来的蛋白异质性，对人源化后的抗体重链可变区进行了突变设计。最终得到了3个人源化的重链可变区突变体s24b8vh-h1(seqidno：15)、s24b8vh-h2(seqidno：16)、s24b8vh-h3(seqidno：17)和1个人源化的轻链可变区突变体s24b8vk-h1(seqidno：18)。8.2.s22e2鼠单克隆抗体的人源化s22e2鼠单克隆抗体的人源化采用经典的框架移植策略。参照实施例8.1，对s22e2的轻重链可变区进行cdr移植得到人源化的重链可变区突变体s22e2vh-h1(seqidno：19)和人源化轻链可变区突变体s22e2vk-h1(seqidno：20)。根据s24b8和s22e2人源化抗体的氨基酸序列，设计并合成抗体的可变区基因，克隆至合适的真核基因表达载体，参照实施例1制备全抗体。s24b8的三个人源化版本命名为s24b8-h1、s24b8-h2和s24b8-h3。人源化s22e2命名为s22e2-h1。8.3.人源化s24b8和s22e2的亲和力测定参考实施例3.2，使用人抗体捕获试剂盒(br-1008-39)，用biacorex100检测人源化抗tt-hc抗体结合tt-hc的亲和力，拟合结果如表2所示。各人源化抗体的重链恒定区均为人igg1亚型。表2.重组抗tt-hc单克隆抗体结合tt-hc-his亲和力常数实施例9：双特异性抗体的制备基于抗破伤风毒素单克隆抗体s24b8和s22e2联用的中和活性优于单独使用，将结合破伤风毒素hc蛋白不同表位的抗原结合片段s24b8-h3和s22e2-h1分别设计成fab形式和scfv形式，构建基于kih(knob-into-hole)技术的人igg1异二聚体。即将fab形式的s24b8-h3抗原结合片段融合在含有knob突变的fc段(fck，seqidno：40)的n端，将scfv形式的s22e2-h1的抗原结合片段融合在含有hole突变的fc段(fch1，seqidno：41)的n端，构建抗破伤风毒素蛋白(hc)的双特异性抗体。分别将构建的表达s22e2-h1-scfv-fch1、表达s24b8vh-h3+ch-igg1k和表达s24b8vk-h1+ck的3个真核表达载体利用脂质体共转染入hek293f细胞，在无血清悬浮培养条件下培养3-5天，然后通过离心等方式收获培养上清。培养上清中的双特异性抗体用proteina/g亲和层析柱(如ge公司的mabselectsure等)进行纯化，然后利用脱盐柱(如ge公司的hitrapdesaulting等)将重组抗体保存缓冲液置换为pbs缓冲液(ph7.0)或者其它合适的缓冲液。将脱盐后蛋白溶液通过尺寸排阻层析(sec)使用superdex200(ge)纯化得到双特异性抗体s22e2h1-scfv-fch1+s24b8h3-igg1k。必要时，可以对抗体样品进行过滤除菌，然后分装保存于-20℃。实施例10：双特异性抗体的功能验证10.1.抑制tt-hc与神经节苷脂的结合参照实施例5，检测抗tt-hc抗体对tt-hc与三种神经节苷脂gd3、gt1b和gm1a结合的抑制能力。elisa结果(图6、图7和图8)显示：单克隆抗体s22e2-h1-scfv-fch1和双特异性抗体s22e2h1-scfv-fch1+s24b8h3-igg1k对tt-hc与三种神经节苷脂的结合均具有明显的抑制作用，单克隆抗体s24b8-h3-igg1不影响tt-hc与三种神经节苷脂的结合。10.2.中和活性参考实施例6，破伤风毒素注射剂量为20×ld50/只,单克隆抗体s24b8-h3和s22e2-h1单独使用的注射剂量为10μg/只，单克隆抗体s24b8-h3和s22e2-h1联合使用的注射剂量为各1.2μg/只，双特异性抗体s22e2h1-scfv-fch1+s24b8h3-igg1k的注射剂量为2.4μg/只；将注射20×ld50的破伤风毒素的balb/c小鼠作为对照组，共计5组，8只/组。用硼酸缓冲液将破伤风毒素稀释至800×ld50/ml(即与抗体等量混合后每50微升注射量中含20×ld50)；用硼酸缓冲液将抗体s22e2-h1和s24b8-h3稀释至0.4mg/ml(或0.096mg/ml)(即s22e2-h1或s24b8-h3单用，与破伤风毒素等量混合后每50微升注射量中含10μg；s24b8-h3与s22e2-h1联用，等量混合的两种抗体再与破伤风毒素等量混合后每50微升注射量中各含1.2μg)单克隆抗体，用硼酸缓冲液将双特异性抗体s22e2h1-scfv-fch1+s24b8h3-igg1k稀释至0.096mg/ml(即与破伤风毒素等量混合后每50微升注射量中含2.4μg)。每只动物注射量为50μl破伤风毒素和抗体混合物。实验结果如图9所示：对照组的所有balb/c小鼠都在攻击3天内死于破伤风，s24b8-h3与s22e2-h1联用组的balb/c小鼠，以及双特异性抗体s22e2h1-scfv-fch1+s24b8h3-igg1k组的balb/c小鼠在实验期内全部存活，双特异性抗体s22e2h1-scfv-fch1+s24b8h3-igg1k的中和活性优于单克隆抗体。实施例11：抗体效价测定基于实施例6中测定抗体中和活性的方法测定双特异性抗体s22e2h1-scfv-fch1+s24b8h3-igg1k的效价，将供试品与标准品进行对比实验，推算出每1mg供试品中所含的抗破伤风毒素抗体国际单位数(iu)。破伤风毒素的稀释：用硼酸缓冲液将破伤风毒素稀释至每毫升含40个试验量(l+1/10)(即与抗体等量混合后每50微升注射量中含1个试验量(l+1/10))。人破伤风免疫球蛋白标准品的稀释：用硼酸缓冲液将人破伤风免疫球蛋白标准品稀释至4iu/ml(即与毒素等量混合后每50微升注射量中含1/10iu)。用硼酸缓冲液将双特异性抗体s22e2h1-scfv-fch1+s24b8h3-igg1k稀释成5个稀释度，依次为14.40μg/ml、16.80μg/ml、20μg/ml、23.6μg/ml和27.6μg/ml(即与毒素等量混合后每50微升注射量中含双抗0.36μg、0.42μg、0.50μg、0.59μg和0.69ug)，稀释度的间隔为15％。稀释后的人破伤风免疫球蛋白标准品溶液及不同稀释度的双特异性抗体溶液，分别与等量的稀释破伤风毒素混合，37℃结合1小时后立即注射，每只小鼠肌肉注射量50μl。每日观察小鼠1次，记录发病及死亡情况。结果显示，对照组的所有balb/c小鼠都在攻毒72小时死于破伤风，与对照组小鼠同时死亡的双特异性抗体最高剂量组是0.42μg，计算双抗的效价为238iu/mg。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。参考文献1.thwaitescl,beechingnj,newtoncr(2015)maternalandneonataltetanus.lancet385:362–370.2.yousefim,tahmasebif,younesiv,razavia,khoshnoodij,bayataa,abbasie,rabbanih,jeddi-tehranim,shokrif(2014a)characterizationofneutralizingmonoclonalantibodiesdirectedagainsttetanustoxinfragmentc.jimmunotoxicol11:28–34.3.ashtonac,liy,doussauf,welleru,dougang,poulainb,dollyjo(1995)tetanustoxininhibitsneuroexocytosisevenwhenitszn21-dependentproteaseactivityisremoved.jbiolchem270:31386–31390.4.scottn,qazio,wrightmj,fairweathernf,deonarainmp(2010)characterisationofapanelofanti-tetanustoxinsingle-chainfvsrevealscooperativebinding.molimmunol47:1931–1941.5.yousefim,khosravi-eghbalr,rezamahmoudia,jeddi-tehranim,rabbanih,shokrif(2014b)comparativeinvitroandinvivoassessmentoftoxinneutralizationbyanti-tetanustoxinmonoclonalantibodies.humvaccinimmunother10:344–351.6.petrusicv,zivkovici,stojanovicm,stojicevici,marinkovice,dimitrijevicl(2012)production,characterizationandapplicationsofatetanustoxinspecificmonoclonalantibodyt-62.actahistochem114:480–486.7.langab,cryzsjjr,schurchu,ganssmt,brudereru(1993)immunotherapywithhumanmonoclonalantibodies.fragmentaspecificityofpolyclonalandmonoclonalantibodiesiscrucialforfullprotectionagainsttetanustoxin.jimmunol151:466–472。序列表<110>北京智仁美博生物科技有限公司智翔（上海）医药科技有限公司重庆智翔金泰生物制药有限公司<120>针对破伤风毒素的抗体及其用途<160>41<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>5<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1sertyrtrpiletyr15<210>2<211>17<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gluileasnprothrasnglyphealaasntyrasnglulysphelys151015thr<210>3<211>17<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gluileasnprothralaglyphealaasntyrasnglulysphelys151015thr<210>4<211>17<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gluileasnprothrasnalaphealaasntyrasnglulysphelys151015thr<210>5<211>6<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>5hispheargpheprotyr15<210>6<211>11<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>6argalaserglnaspileglyserserleuthr1510<210>7<211>7<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>7alathrserserleuaspser15<210>8<211>9<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>8leuglntyralaserserprotyrthr15<210>9<211>5<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>9asptyrglyvalasn15<210>10<211>16<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>10metiletrpseraspglythrthrasptyrserseralaleulysser151015<210>11<211>12<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>11valaspglytyrserhistyrtyralametasptyr1510<210>12<211>11<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>12argalasergluasniletyrsertyrleuala1510<210>13<211>7<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>13asnalalysthrleualaglu15<210>14<211>9<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>14glnhishistyrglyleuprophethr15<210>15<211>115<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>15glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyser151015servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr202530trpiletyrtrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpile354045glygluileasnprothrasnglyphealaasntyrasnglulysphe505560lysthrlysalathrilethrvalasplysserthrserthralatyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alailehispheargpheprotyrtrpglyglnglythrmetvalthr100105110valserser115<210>16<211>115<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>16glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyser151015servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr202530trpiletyrtrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpile354045glygluileasnprothralaglyphealaasntyrasnglulysphe505560lysthrlysalathrilethrvalasplysserthrserthralatyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alailehispheargpheprotyrtrpglyglnglythrmetvalthr100105110valserser115<210>17<211>115<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>17glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyser151015servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr202530trpiletyrtrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpile354045glygluileasnprothrasnalaphealaasntyrasnglulysphe505560lysthrlysalathrilethrvalasplysserthrserthralatyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alailehispheargpheprotyrtrpglyglnglythrmetvalthr100105110valserser115<210>18<211>107<212>prt<213>人工序列(artificialse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