一种牛奶、小麦、花生及大豆过敏原融合蛋白及其构建方法、应用与流程

本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及一种牛奶、小麦、花生及大豆过敏原融合蛋白及其构建方法、应用。

背景技术：

过敏性疾病(anaphylactia)又称变态反应性疾病是患者吸入、摄食入或者注入含有致敏成分的物质(称为过敏原或变应原，allergen)如室内尘螨、植物花粉、动物皮毛等后触发机体的b细胞产生特异性免疫球蛋白e(immunoglobuline，ige)，从而引发过敏反应(或称变态反应，allergy)，导致哮喘、过敏性鼻炎、湿疹等临床疾病的发生。

其中，ige是1966年发现的一类ig，分子量为188kd，血清中含量极低，仅占血清总ig的0.002％，在个体发育中合成较晚。ige主要由鼻咽部、扁桃体、支气管、胃肠等粘膜固有层的浆细胞产生，这些部位常是变应原入侵和i型变态反应发生的场所。当过敏反应发生时，局部的外分泌液和血清中ige水平都明显升高。

近年来，由于饮食习惯的改变和环境污染加重等导致过敏性疾病发病率逐年增高。据统计，过敏性疾病的总发病率约40％以上。世界卫生组织(who)已明确规定，将过敏性疾病列为全球性重点防治的疾病。

而现有过敏原检测通常采用的是单一的蛋白的检测，灵敏度和特异性较差，容易导致漏检和错检。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种牛奶、小麦、花生及大豆过敏原融合蛋白，该融合蛋白能提高检测试剂盒的灵敏度和特异性，以减少漏检和错检。

此外，本发明还提供上述牛奶、小麦、花生及大豆过敏原融合蛋白的构建方法、应用。

本发明通过下述技术方案实现：

一种牛奶、小麦、花生及大豆过敏原融合蛋白，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

一种编码牛奶、小麦、花生及大豆过敏原融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

一种含有的编码牛奶、小麦、花生及大豆过敏原融合蛋白基因的重组质粒。

一种含有牛奶、小麦、花生及大豆过敏原融合蛋白的试剂盒。

牛奶、小麦、花生及大豆过敏原融合蛋白的构建方法，包括以下步骤：

s1、依次连接牛奶、小麦、花生及大豆过敏原核苷酸序列获得目的基因，其中，每相邻两种过敏原核苷酸序列之间加入linker序列；

s2、在目的基因n端加入真核kozak序列和信号肽序列，在上游加入限制性核酸内切酶位点bamhi，在下游加入noti酶切位点，c端加入6*his标签序列，获得全序列基因；

s3、将步骤s2获得的全序列基因与质粒进行双酶切获得酶切产物；

s4、将步骤s3获得的酶切产物通过t4连接酶连接，得到重组质粒；

s5、将重组质粒在昆虫细胞中表达获得牛奶、小麦、花生及大豆过敏原融合蛋白。

还包括对牛奶、小麦、花生及大豆过敏原融合蛋白的纯化。

本发明通过将牛奶、小麦、花生及大豆过敏原基因连接后连接到构建至pfastbac^tmhta载体中，制备一种含有牛奶、小麦、花生和大豆过敏原序列的重组杆粒，将该重组杆粒转染昆虫细胞，实现牛奶、小麦、花生和大豆过敏原融合表达，将其用于牛奶、小麦、花生和大豆过敏原检测试剂盒，能够实现同时批量筛查该四种过敏原，采用本发明所述方法只需要一次表达就能制备得到四种过敏原的融合蛋白。

进一步地，还包括对牛奶、小麦、花生及大豆过敏原融合蛋白的纯化。

采用上述构建方法所制备的融合蛋白。

牛奶、小麦、花生及大豆过敏原融合蛋白或包括牛奶、小麦、花生及大豆过敏原融合蛋白的试剂盒在制备免疫学诊断试剂中的应用。

牛奶、小麦、花生及大豆过敏原融合蛋白或包括牛奶、小麦、花生及大豆过敏原融合蛋白的试剂盒在制备过敏原诊断试剂中的应用。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明只需要一次表达就能制备得到一种牛奶、小麦、花生及大豆四种过敏原的融合蛋白，降低成本与时间。

2、使用本发明所述牛奶、小麦、花生及大豆过敏原融合蛋白制备检测试剂盒，能够实现同时批量筛查该四种过敏原，提高检测试剂盒的灵敏度和特异性，减少漏检和错检，极大的提高了抗体的检测率。

3、用本发明所述牛奶、小麦、花生及大豆过敏原融合蛋白制备检测试剂盒能够大幅度提高了临床筛查效率，可以减少抽血量及抽血次数，降低被检测者痛苦。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为细胞表达鉴定结果图；

图2为纯化蛋白电泳图；

图3为纯化蛋白鉴定结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1：

融合基因(目的基因)的合成：

牛奶蛋白选择如下氨基酸序列：

eeivpnsveqkhiqkedvpserylgyleqllrlkkykvpqleivpnsaeerlggggseinqfyqkfpqylqylyggggstevftkktklteeeknrlnflkkisqryqkfalpqylktvyqhqkamkpwiqpkt。

小麦蛋白选择如下氨基酸序列：

ysvrfvanhggggsvlknkhrewescfqkq。

花生蛋白选择如下氨基酸序列：

sathaksspyqkktenpcaqrclqscqqepddlkqkacesrctkleydprcvydprghtgttnqrsppgertrgrqpgggggsrrytarlkegggggslaahasarqqwelqgdrrcqsqleranlrpceqhlmqkiqrd。

大豆蛋白选择如下氨基酸序列：

mgvftfedeinspvapatlykalvtdadnvipkaldsfksvenvegnggpgtikkitfledgetkfvlhkiesideanlgysysvvggaalpdtaekitfdsklvagpnggsagkltvkyetkgdaepnqdelktgkakadalfkaieayllahpdyn。

s1、依次连接牛奶、小麦、花生及大豆过敏原核苷酸序列获得目的基因，根据genbank所公开的序列信息，在连接两个基因片段之间去掉终止密码子和起始密码子，并加入5个氨基酸残基(ggggs)的柔性肽基因序列(linker序列)，在n端加入真核kozak序列和信号肽序列，在c端加入6*his，优化密码子后合成以上基因片段。全基因合成时各序列之间的排列顺序为：真核kozak-信号肽-牛奶蛋白1-linker-小麦蛋白1-linker-花生蛋白1-linker-大豆蛋白1-6*his。目的基因(融合基因)的核苷酸序列如seqidno.2所示。

实施例2：

含有融合基因的重组质粒构建：

2.1将实施例1中获得的全合成序列与经过限制性内切酶bamhi和noti双酶切的载体pfastbac^tmhta进行连接；

2.2连接产物转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，连接产物体积不超过感受态细胞的10％，轻轻旋转几次混匀内容物，冰浴30分钟，放入42℃水浴中定时60秒热休克，快速将管转移到冰浴120秒，每管加入400μllb培养基，37℃缓摇60分钟，低速离心2分钟，去上清，留100μl培养基在离心管内，重悬菌体，将菌液在lb板上铺匀；

2.3将平板倒置于37℃恒温培养箱，12-16小时后可出现菌落。挑取阳性克隆进行鉴定。

实施例3：

融合蛋白的表达

3.1将实施例2中获得的重组质粒转化至dh10bac感受态细胞中，体积不超过感受态细胞的5％，轻轻旋转几次混匀内容物，冰浴30分钟；将管放入42℃水浴定时90秒热休克；快速将管转移到冰浴120秒；每管加入800μllb培养基，37℃，缓摇4小时；将30μl菌液在抗性琼脂板上铺匀；将平板倒置于37℃恒温培养箱中，30-48小时后可出现蓝白斑菌落；

3.2挑取阳性白斑单菌落接入5ml抗性lb培养液中，缓摇12-16h，取菌液进行pcr鉴定，结果显示杆粒重组正确。将重组杆粒经转染试剂转染到昆虫细胞中，3-5天后收取细胞上清液作为第一代杆状病毒。用第一代杆状病毒感染昆虫细胞48-96小时后，获得第二代病毒，用于融合蛋白的表达；牛奶、小麦、花生及大豆过敏原融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。

3.3使用第二代病毒以1:200体积比感染密度为2x10⁶/ml的昆虫细胞sf9，继续培养72小时后，离心分别收细胞与上清。

实施例4：

融合蛋白鉴定：

4.1分别将实施例3中的上清与细胞进行非还原性sds-page电泳，使用12％分离胶浓度，电泳约90分钟；

4.2将sds-page电泳凝胶进行转膜(pvdf)，湿转90v，100分钟；收集pvdf，使用5％脱脂奶粉封闭；

4.3将4.2封闭后的pvdf膜加入anti-hismab，再洗净后加入鼠二抗，ecl显色；确定蛋白表达于细胞上清中，结果如图1所示，a：细胞上清；b：细胞裂解液；其中，a条带为细胞上清电泳结果，b条带为细胞裂解液电泳结果。a条带出现显色反应，而b条带未出现显色反应，结果说明蛋白表达于细胞上清中。

实施例5：

融合蛋白纯化

5.1收集培养表达的上清约1l，用5000ml预冷的上样缓冲液(20mmtris-hclph8.0；500mmnacl)透析，换液3次，每次不少于4小时；

5.2收集上清，12000rpm/min，离心后收集上清弃掉沉淀，上清与50ml用平衡缓冲液平衡好的ni-ntaresin一起孵育过夜，次日，弃上清，加入适量平衡缓冲液重悬填料，将填料转移到自流柱里；

5.3依次用冲洗缓冲液1(20mmtris-hclph8.0；500mmnacl)洗10个柱体积；

5.4冲洗缓冲液2(20mmtris-hclph8.0；500mmnacl；20mm咪唑)洗10个柱体积；

5.5冲洗缓冲液3(20mmtris-hclph8.0；500mmnacl；60mm咪唑)洗5个柱体积；

5.6冲洗缓冲液3(20mmtris-hclph8.0；500mmnacl；500mm咪唑)洗脱目的蛋白，1×pbs透析纯化后得到的目的蛋白保存在-80℃；

5.7sds-page电泳检测表达蛋白纯度及浓度。

a：上柱前上清；b上柱后未结合上清；c：20mm咪唑洗脱；d：60mm咪唑洗脱；e：300mm咪唑洗脱；m：maker；将5.2中上柱前的上清液、上柱后的上清液及5.4-5.6中纯化所得的蛋白用电泳检测，确认蛋白纯度、浓度及效价，结果如图2所示。

5.8wb鉴定，将纯化后的蛋白分别上样8ng、5ng、1ng，wb鉴定，进一步确认蛋白效价，结果如图3所示。

实施例6

6.1一种牛奶、小麦、花生及大豆过敏原组合检测试剂盒，包含有实施例3表达的融合蛋白，其主要成分如下表1所示：

表1一种牛奶、小麦、花生及大豆过敏原组合检测试剂盒主要成分

6.2本试剂盒的性能评估：

(1)临床符合率

(1)阳性符合率：本发明试剂盒对69例临床诊断为(牛奶26例、小麦8例、花生13例、大豆22例)过敏及100例健康人的样本进行了测定。结果表明，本发明试剂盒阳性符合率为100％，阴性符合率为100％(表2)，说明本试剂盒临床灵敏度及特异性高。

表2检测试剂盒临床样本比对

(2)精密度：分别对高、中、低值质控品进行测定，每天两次，分上下午检测，每次进行4个重复，共检测10天，每种浓度共测定80次，计算变异系数，检查试剂在高值、中值和低值标本时的测定精密度。计算变异系数，结果分别为3.18％、4.98％、4.32％，均在8％以内，重复性好。

(3)稳定性：将检测试剂盒各组分37℃分别放置7天，测定高、中、低3种浓度质控的信号保留率。结果均＞95％，将试剂表明试剂盒稳定好，符合临床要求。

(4)特异性：对高、中、低不同浓度值的血清添加不同浓度的胆红素、血红蛋白、类风湿因子、脂、rf、hama检测结果显示，添加物质对本试剂盒检测结果没有影响。

本发明的检测试剂盒，将牛奶、小麦、花生和大豆过敏原基因序列连接后构建至pfastbac^tmhta载体中，于昆虫细胞中表达，制备一种含有牛奶、小麦、花生和大豆过敏原融合蛋白，以该融合蛋白用于检测，灵敏度高；同时，利用sa的级联放大作用，增强超低含量ige的检测灵敏度；利用磁微粒化学发光法进行试剂盒的开发，检测时间短，20分钟内出结果，重复性好，全自动操作。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>四川携光生物技术有限公司

<120>一种牛奶、小麦、花生及大豆过敏原融合蛋白及其构建方法、应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>482

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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