一种桑黄抗肝癌细胞增殖的有效成分及其制备方法与流程

本发明涉及桑黄多糖制备技术领域，特别涉及一种桑黄抗肝癌细胞增殖的有效成分及其制备方法。

背景技术：

桑黄主要寄生于桑树、杨树、暴马丁香、松树、白桦等树干上，是一类药用真菌的总称。桑黄作为一种重要药用菌有着非常广泛的药理作用，主要表现在以下几个方面：抗突变作用；增强机体的免疫力；抗肿瘤作用；抗纤维化和脂质过氧化作用。我国是野生药用真菌出口大国，但目前对桑黄菌的研究还处于初步阶段，技术尚未成熟。由于我国有限的桑黄资源被过分采集，导致桑黄野生资源濒临枯竭，难以成为稳定的工业产品来源，远远不能满足市场的需求。因而，利用人工栽培技术来生产桑黄子实体来代替野生桑黄是克服利用野生资源生物量受限的最佳途径。桑黄子实体一般不能直接食用，或者若直接食用不易达到保健治疗效果，只有将有效成分浓缩或纯化，才能提高其功效。

真菌多糖作为一类重要的生物活性物质，国内外对真菌多糖的制备、结构、合成、药理学、临床学等方面做了很多工作，其多方面的生物学活性已经得到了开发和应用，如云芝多糖、猪苓多糖、香菇多糖、茯苓多糖等多种真菌制剂已经取得了良好的临床效果。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种桑黄抗肝癌细胞增殖的有效成分及其制备方法，桑黄多糖的制备效率高，增加桑黄多糖的得糖率。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

一种桑黄抗肝癌细胞增殖的有效成分，所述有效成分为桑黄多糖。

所述桑黄多糖的制备包括以下步骤：

称取50g桑黄细粉，过50-70目筛，加入到1500g水中进行热水提取，浸提时间为1-3h，浸提温度为75-95℃，按上述步骤重复提取两次，合并两次所得提取液；

桑黄细粉进行微波预处理，预处理的时间为4-10min，微波功率为350w，经微波预处理后，在桑黄细粉样品中添加0.5％复合蛋白酶、0.5％纤维素酶，调整ph值为6，设定超声时间为15-20min，超声温度为50-70℃，超声功率为240w，提取1.5-3小时；

将桑黄多糖水提液在60-70℃进行旋转蒸发，浓缩至原体积的1/10-1/5，在桑黄多糖溶液中加入80％的乙醇，在4℃的环境下沉淀12-18h，5000r/min离心30min得到桑黄多糖溶液；

正丁醇和氯仿混合配制成sevag溶液，将桑黄多糖溶液与sevag溶液在分液漏斗中混合，进行剧烈震荡30min，静置3h后分层，去上清液重复上述步骤，直到提取液与sevag溶液交界处无白色泡沫为止；

将桑黄多糖溶液加入相当于多糖溶液体积2-5％的活性炭，在40℃的温度下脱色1h，重复上述操作两次；

桑黄多糖用去离子水溶解，使桑黄多糖溶液的浓度为10mg/ml，沿着层析柱管壁缓缓注入，用去离子水进行洗脱。

优选的，所述去离子水进行洗脱的流速为0.2ml/min。

优选的，所述sevag溶液由正丁醇和氯仿按照体积比为1：4混合配制。

优选的，所述桑黄多糖溶液与sevag溶液按照体积比为3：1在分液漏斗中混合。

采用上述技术方案，由于采用了微波预处理，能够有效的提高桑黄多糖的得糖率，由于采用复合酶进行多糖提取，复合酶通过溶解细胞壁使得多糖大量溶出，其反应条件温和，提取时间短。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

桑黄多糖的制备包括以下步骤：

称取50g桑黄细粉，过50目筛，加入到1500g水中进行热水提取，浸提时间为1h，浸提温度为75℃，按上述步骤重复提取两次，合并两次所得提取液；

桑黄细粉进行微波预处理，预处理的时间为4min，微波功率为350w，经微波预处理后，在桑黄细粉样品中添加0.5％复合蛋白酶、0.5％纤维素酶，调整ph值为6，设定超声时间为15min，超声温度为50℃，超声功率为240w，提取1.5-3小时；

将桑黄多糖水提液在60℃进行旋转蒸发，浓缩至原体积的1/10，在桑黄多糖溶液中加入80％的乙醇，在4℃的环境下沉淀12h，5000r/min离心30min得到桑黄多糖溶液；

正丁醇和氯仿混合配制成sevag溶液，将桑黄多糖溶液与sevag溶液在分液漏斗中混合，进行剧烈震荡30min，静置3h后分层，去上清液重复上述步骤，直到提取液与sevag溶液交界处无白色泡沫为止；

将桑黄多糖溶液加入相当于多糖溶液体积2的活性炭，在40℃的温度下脱色1h，重复上述操作两次；

桑黄多糖用去离子水溶解，使桑黄多糖溶液的浓度为10mg/ml，沿着层析柱管壁缓缓注入，用去离子水进行洗脱；

去离子水进行洗脱的流速为0.2ml/min；

sevag溶液由正丁醇和氯仿按照体积比为1：4混合配制；

桑黄多糖溶液与sevag溶液按照体积比为3：1在分液漏斗中混合。

实施例2

桑黄多糖的制备包括以下步骤：

称取50g桑黄细粉，过70目筛，加入到1500g水中进行热水提取，浸提时间为3h，浸提温度为95℃，按上述步骤重复提取两次，合并两次所得提取液；

桑黄细粉进行微波预处理，预处理的时间为10min，微波功率为350w，经微波预处理后，在桑黄细粉样品中添加0.5％复合蛋白酶、0.5％纤维素酶，调整ph值为6，设定超声时间为20min，超声温度为70℃，超声功率为240w，提取3小时；

将桑黄多糖水提液在70℃进行旋转蒸发，浓缩至原体积的1/5，在桑黄多糖溶液中加入80％的乙醇，在4℃的环境下沉淀18h，5000r/min离心30min得到桑黄多糖溶液；

正丁醇和氯仿混合配制成sevag溶液，将桑黄多糖溶液与sevag溶液在分液漏斗中混合，进行剧烈震荡30min，静置3h后分层，去上清液重复上述步骤，直到提取液与sevag溶液交界处无白色泡沫为止；

将桑黄多糖溶液加入相当于多糖溶液体积5％的活性炭，在40℃的温度下脱色1h，重复上述操作两次；

桑黄多糖用去离子水溶解，使桑黄多糖溶液的浓度为10mg/ml，沿着层析柱管壁缓缓注入，用去离子水进行洗脱；

去离子水进行洗脱的流速为0.2ml/min；

sevag溶液由正丁醇和氯仿按照体积比为1：4混合配制；

桑黄多糖溶液与sevag溶液按照体积比为3：1在分液漏斗中混合。

人肝癌细胞hepg2培养于含体积分数为10％fbs的dmem培养基中，于37℃、5％co2条件下传代培养，当细胞融合度约为80％时，即进行细胞传代，实验时取对数生长期细胞，采用mtt法检测细胞的存活率，调整细胞为5×10⁴个/ml，100μl/孔接种于96孔板中，设立空白组、正常对照组、不同浓度桑黄细粉多糖溶液、不同浓度桑黄菌丝体多糖溶液，每孔加入上述溶液100μl，于37℃、5％co2培养箱中分别培养24h和48h后，每孔加入5g/l的mtt20μl，继续培养4h后，吸去上清，每孔加入150μl的dmso，室温置于摇床10min，于酶标仪490nm处测定od值，计算细胞存活率和半数抑制浓度(ic50)，存活率(％)＝(od样品-od空白)/(od正常-od空白)*100，倒置显微镜观察细胞形态，细胞处理同上，在不同浓度桑黄细粉多糖溶液及桑黄菌丝体溶液作用24h和48h后，采用倒置显微镜观察，物镜20倍，拍照记录各组细胞形态；

结果如表1所示，为桑黄细粉多糖溶液、桑黄菌丝体多糖溶液24h和48h时对人肝癌细胞存活率表，随着桑黄细粉多糖溶液、桑黄菌丝体多糖溶液浓度增加和作用时间延长，mtt结果显示细胞存活率下降，光镜下观察细胞数量减少，贴壁不紧密，部分脱落，体积变小，形态损伤程度逐渐加深，作用时间24h时，桑黄细粉多糖溶液、桑黄菌丝体多糖溶液浓度达到6.4mg/ml，对人肝癌hepg2细胞呈现明显细胞增殖抑制作用(p＜0.05)，作用时间48h时，桑黄细粉多糖溶液、桑黄菌丝体多糖溶液浓度达到3.2mg/ml，对人肝癌hepg2细胞呈现明显细胞增殖抑制作用(p＜0.05)。

细粉作用于人肝癌hepg2细胞24h和48h的ic50分别为7.896和5.580mg/ml，95％置信区间分别为3.978～15.67mg/ml和3.775～8.249mg/ml，桑黄菌丝体多糖溶液作用24h和48h的ic50分别为8.413和6.051mg/ml，95％置信区间分别为4.511～15.690mg/ml和3.924～9.332mg/ml。

表1

注：*p<0.05,**p<0.01与空白对照组(0.0mg/ml)比

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

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