茄子SmWRKY转录因子及其在提高茄子青枯病抗性方面的应用的制作方法

2021-02-02 21:02:36|

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本发明属于分子生物学
技术领域：
，更具体地，涉及茄子smwrky转录因子及其在提高茄子青枯病抗性方面的应用。
背景技术：
：茄子(solanummelongenal.)是茄科(solanaceae)茄属(solanuml.)一年生或多年生作物，起源于亚洲东南亚的热带地区，是各地广泛栽培的夏秋季重要蔬菜。其营养丰富，具有重要的食用价值、药用价值和经济价值。而青枯病是茄子在种植过程中，一种较为常见的土传病害，可直接导致茄子减产和品质质量的显著下降(高达50％左右)。然而目前关于茄子对青枯病抗性相关的特定触发因子和机制尚不清楚。由于病原体可以在没有寄主植物的情况下长期在土壤中生存，因此很难通过农艺实践或化学处理加以控制，而控制青枯病最有效和最环保的方法就是通过遗传抗性的方法进行抗病植株的选育。wrky转录因子作为一个常见的基因家族，在植物界中广泛存在，属于wrky-gcm1锌指转录因子超家族，由其n端保守的wrkygqk氨基酸序列而得名。wrky转录因子具有wrky结构域，可以用来和dna进行特异性结合，从而对由转录因子激活合成的转录蛋白所调控的靶基因进行调控，进而调控植物生长发育，响应生物和非生物胁迫，并在植物的生理生化等过程中发挥着重要作用(caietal.，2017)。lloyd等(2017)研究表明wrky蛋白参与调节原花青素和花青素生物合成中的125个性状。水稻oswrky11能够调水稻的开花期和株高的生长过程(caiyetal.，2014)。tawrky2和tawrky19的过表达在拟南芥中表现出增强的耐盐和抗旱性(niuetal.，2012)。li等(2015)研究表明，cmwrky48过表达的菊花可以抑制蚜虫群体数量的增长；由此可以看出，存在于不同种类植物中的wrky转录因子均有不同的作用，控制的植物性状也不尽相同。青枯病是由青枯菌引起的一种土传病害，寄主范围广，其病原菌为茄科雷尔氏菌(r.solanacearum)，该病原菌可以在没有寄主植物的情况下在土壤中存活很多年。随着基因组的测序工作取得的突破性的进展，对茄子抗青枯病的分子标记基因的准确定位成为了可能(sheetal.，2015；guarischisousaetal.，2016)。然而，目前关于茄子对青枯病抗性相关的特定触发因子和致病机制尚不清楚，这导致了其在茄子青枯病育种中的应用十分的局限。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中缺乏茄子对青枯病抗性相关的特定触发因子和致病机制，首先提供了一种从茄子抗青枯病材料中分离得到的转录因子smwrky65。本发明的第二个目的是提供含有上述转录因子smwrky65的生物材料。本发明的第三个目的是提供上述转录因子smwrky65的应用。本发明的目的通过以下技术方案实现：一种茄子smwrky转录因子，编码该转录因子的核苷酸序列如seqidno：1所示。上述茄子smwrky转录因子的氨基酸序列如seqidno：2所示。本发明利用转录组分析，找到表达差异基因，进行测序分析，其中smwrky65就是一个在抗病材料中表达高，感病材料中表达低的基因，然后以茄子抗病品种“e-31”为材料，克隆出转录因子基因smwrky65，并对其进行生物信息学分析、表达特异性分析、亚细胞定位和基因功能鉴定；经rt-qpcr检测后，smwrky65主要在根中表达，smwrky65主要分布在细胞核中。以“e-31”为材料，通过vigs技术对smwrky65进行沉默，与对照组相比，ptrv2-smwrky65沉默植株目的基因表达量下降，vigs植株接种青枯病菌后，叶片均表现出明显的萎蔫症状。结果证实了smwrky65可以正向调控茄子对青枯病的抗性。本发明还提供含有茄子smwrky转录因子的生物材料，所述生物材料包括但不限于载体、质粒、宿主细胞、植物。本发明还提供用于扩增编码所述茄子smwrky转录因子的基因序列的引物对，所述引物对的序列如seqidno：3～4所示。本发明还提供所述茄子smwrky转录因子在提高茄子对青枯病抗性方面的应用。优选地，可以通过提高smwrky转录因子在茄子中的表达量，以达到提高茄子对青枯病的抗性的目的。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明公开了一种茄子smwrky转录因子，编码该转录因子的核苷酸序列如seqidno：1所示，前期通过获得在感青枯病材料中低表达，在抗青枯病材料中高表达的1个基因smwrky65对分离得到的目的基因进行生物信息学分析，表达特性分析和功能鉴定，以期为解释调控茄子青枯病抗性机制和茄子青枯病菌抗性育种提供一些理论依据，同时对未来创制茄子广谱抗性材料以及抗病品种的选育工作都有重要的意义。附图说明图1为克隆产物pcr图；图2为smwrky65进化树；图3为smwrky65的表达特性分析，其中，图3a为smwrky65在抗感材料不同组织中的表达分析；图3b为青枯病病原诱导smwrky65在抗感材料叶片中的表达；r代表抗病型茄子(e31)，s代表感病型茄子(e32)，青代表接种了青枯病病原；图4为smwrky65的亚细胞定位分析；图5为目的基因特异性片段连接ptrv2后的电泳图；其中，图5a中，泳道1、泳道2和泳道3分别为smwrky65的特异性片段；图5b中，泳道1为ptrv2空载，泳道2-4为ptrv2-smwrky65；图6上图为smwrky65沉默后的基因表达检测；下图为ptrv2-smwrky65植株接种青枯病菌后抗病性的鉴定。具体实施方式下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。下述实施例以及实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料；所用的设备，如无特殊说明，均为常规实验设备。植物材料：茄子高抗青枯病材料“e-31”和感青枯病材料“e-32”由本实验室提供。菌株：青枯菌致病菌株从感病材料(e-32)中进行分离；vigs载体ptrv-1和ptrv-2由本实验室保存；dh5α大肠杆菌转化菌株和gv3101转农杆菌菌株均购自生工生物科技有限公司。实施例1目的基因分离及同源性分析根据转录组分析所得基因序列，后用primer5软件进行引物设计，引物序列如表1所示，由擎科公司合成。以茄子dna为模板，进行pcr扩增，pcr扩增体系(10μl)为：dna模板0.5μl、2×hifitaqpcrstarmix5μl、正向引物0.5μl、反向引物0.5μl、ddh2o3.5μl。pcr程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，32个循环；72℃延伸5min；12℃保存。将克隆所得产物连接至pmd19-t载体后送至公司测序。表1目的基因特异性引物序列引物名称forward(5’-3’)smwrky65-fatggaagataggctatacaaaagtcsmwrky65-rttatcctgtaccgccgcaacpcr结果如图1所示，将目的条带进行测序，序列如seqidno：1所示，其即为smwrky65序列，其编码的氨基酸序列如seqidno：2所示。利用ncbi上blast在线比对工具，检索wrky65同源性蛋白，将相似性高的序列下载后，用jalview2.11.0进行比对分析，结果发现该蛋白在不同物种中的序列保守性较强。使用mega工具对上述氨基酸序列进行upgma法构建系统发育进化树，进化树显示，茄子smwrky65与马铃薯wrky65的同源性达88.09％，与番茄wrky65的同源性达87.77％(图2)。实施例2表达特性分析运用primer5软件设计特异性引物，以茄子内参为对照对茄子不同组织部位进行实时荧光定量pcr(qrt-pcr)反应，实验采用sybrpremixextaqkit试剂盒(takara，中国)进行。荧光定量pcr特异性引物序列和茄子内参(18rrna)序列分别如表2。表2目的基因荧光定量pcr特异性引物序列引物名称forward(5’-3’)荧smwrky65-fggatattatcgatgcagtag荧smwrky65-rggtagatgtggtaggtgaac18srrna-fcgcgcgctacactgatgtattcaa18srrna-rtacaaagggcagggacgtagtcaaqrt-pcr的程序为：预变性，95℃，2min；接下来35个循环包括，95℃，10s变性，56℃，20s退火，72℃，35s延伸。溶液添加时每个样品重复三次，最后取平均值再进行分析，目的基因在根、茎、叶不同组织部位的相对表达量应用2-δct方法进行分析(livak&schmittgen，2001)。结果发现：smwrky65在抗性材料e-31根组织部位中的表达量最高，在叶中的表达量次之，茎中最低，在感病材料e-32根中表达最低。在抗/感(e-31/e-32)茄子苗期接种青枯病菌后，发现青枯病菌均能诱导smwrky65在抗病(e-31)和感病(e-32)材料中表达，且在抗病材料中表达量高于感病材料(图3)。实施例3亚细胞定位根据smwrky65基因序列，去除终止子，设计亚细胞定位引物，见表3，克隆出目的片段后，使用ecori和bmahi对亚细胞定位载体pc018和目的片段进行双酶切，并用连接酶组成重组质粒。表3亚细胞定位引物将重组质粒smwrky65-gfp转化农杆菌gv3101，并将其侵染洋葱表皮组织。划线活化农杆菌并阔摇过夜培养12～16h，至od600＝0.6～1.2，将菌液分装于50ml离心管中，5000rpm，10min，弃上清，用侵染缓冲液(0.2mmol/l乙酰丁香酮0.02g+10mmol/lmgcl2·6h2o1.02g+10mmol/lmes10g+水500ml)重悬菌体，至od600＝0.4～0.6，重悬菌液静置1～2h(as活化农杆菌诱导基因)。在无菌工作台中，将洋葱剥开，切成方形组织块(带肉)，浸泡于重悬菌液中，抽真空5～10min，取出置于铺上湿润滤纸的培养皿中，封膜，置于25℃恒温培养室中，黑暗下培养2～4d，最佳观察时间为48～72h。结果如图4所示，转化农杆菌后侵染洋葱表皮组织，三天后观察，发现smwrky65转录因子定位在细胞核中。实施例4vigs载体构建及接种一、目的基因的vigs载体构建将目的基因全长序列通过在线工具(vigs.solgenomics.net)寻找适合构建vigs载体区域，使用primer5.0软件设计引物时，在其上下游5'端分别加入相应的酶切位点和保护性碱基，根据目的基因序列和ptrv2载体多克隆酶切位点中的ecori和bamhi两个酶的酶切位点基因片段设计特异性引物，其特异性引物序列分别如表4。表4多克隆酶切位点特异性引物序列引物名称forward(5’-3’)smwrky65-eb-ftaaggttaccgaattcggatattatcgatgcagtagsmwrky65-eb-rgctcggtaccggatccggtagatgtggtaggtgaac用cdna为模板进行pcr获得长度为200～300bp的pcr产物，将产物片段和ptrv2载体同时用双酶切法，将酶切后的产物片段与ptrv2载体酶切产物相连接，转入大肠杆菌dh5α，涂在含卡那霉素的lb培养上，过夜培养后用牙签挑取阳性单菌落进行pcr菌落鉴定，送测序，保证连接片段和读码方向正确。结果如图5所示，构建的vigs载体中smwrky65基因特异性片段为203bp，由图5a可知目的基因特异性片段克隆成功。图5b为目的基因连接ptrv2后转化农杆菌的凝胶电泳检测图，结果表明目的基因的vigs载体构建成功。二、青枯病菌分离分离前准备：配制95％的酒精、75％的酒精溶液、2％的次氯酸钠溶液、2mltzc溶液、剪刀等，250ml锥形瓶2只、500ml锥形瓶2只、500ml的青枯菌液体培养基、中枪头(100μl)、报纸、牙签、镊子、手术刀、蒸馏水(4～5瓶)在灭菌锅中高温121℃灭菌20min，报纸、牙签、镊子、手术刀放置于烘箱里烘干备用。从大田里采集茄子感病材料的植株，洗净后用剪刀将茎基部剪成一个个的小段备用。以下操作均在无菌的超净工作台中进行，具体的实验步骤如下：(1)将剪碎成小段的材料用75％的酒精溶液进行消毒90s～2min，用灭菌水冲洗2～3次以去除酒精残留液；(2)用无菌蒸馏水洗净后，再将材料放入2％的次氯酸钠溶液中进行消毒5～10min，用无菌水冲洗3～4次，去除次氯酸钠溶液残留；(3)将消毒后的材料置于灭菌的报纸上吹干，除去水分后用手术刀将材料切开，露出木质部；(4)将(3)中切碎的材料全部转移到无菌水中，室温下，静置15～20min后，可观察到有白色菌液溢出；(5)用移液枪向含有青枯菌的无菌水中吸取50μl菌液，涂布于含tzc的固体培养基中(10g蔗糖，5g蛋白胨，3g牛肉浸膏，15g琼脂，蒸馏水定容至1l，调节ph至7.0)。28℃倒置培养过夜后用于后续实验或是置于4℃冰箱内保存备用；(6)用挑针蘸取无菌水中的青枯病菌于含有tzc的固体培养基上z字划线，28℃倒置培养过夜后直接用于后续实验或置于4℃冰箱内保存留用；(7)用牙签挑取培养过后的青枯菌菌落于液体培养基中(10g/l蔗糖，5g/l蛋白胨，3g/l牛肉浸膏，ph7.0)，28℃，200rpm振荡培养8～10h，用分光光度计将青枯菌液的悬浮密度调成为1×108cfu/ml，置于4℃冰箱内备用。三、接种采用伤根—灌根法人工接种，菌液浓度调制成108cfu/ml悬浊液，将50ml的菌液倒入种植茄子的营养钵，以后1～2天浇1次水以保持土壤湿润，保持温度白天(30±2)℃，夜间(20±2)℃，rh>95％。接种后7～10d观察发病状况。发病情况以0～4级标准进行记录。抗性划分标准为：抗病(r)：di<10；中抗(mr)：di在10～20；中感(ms)：di在21～40；感病(s)：di>40。在抗性材料e-31茄子苗期三四片叶子的时，进行vigs侵染，而后对苗株进行青枯病菌接种，由图6可知，在所有ptrv2-smwrky65沉默的植株中，接种7天后全部发病，均出现萎蔫症状，而茄子抗病材料“e-31”在清水处理和ptrv2空载浸染后，接种病原后，植株叶片都未出现萎蔫症状。同时检测植株中smwrky65是否被成功沉默，结果如图6，与对照组相比，smwrky65表达量均显著降低，这说明目的基因分别在感病植株中被成功沉默，结果证实smwrky65对茄子青枯病起着正向调控作用。wrky转录因子响应植物的生物和非生物胁迫，到目前为止，部分相关的wrky蛋白已经被证明能够调控与植物相关的一系列生长发育和植物抗病抗逆有关。当植物感知到环境胁迫时，自身会形成一种复杂的调控网络，以此进行自身免疫的调节。常见的信号通路，例如mapk级联(rodriguezetal.，2010；mengetal.，2013)和涉及钙的途径(knightetal.，2000)和活性氧(ros)等。但是，大多数信号传导成分的确切作用以及它们如何在功能上联系起来的了解却很少。植物对多种逆境的反应中的关键步骤是通过各种转录因子(tf)对许多与防御相关的基因进行转录重编程。wrky蛋白的特点是存在一个或两个高度保守的wrky结构域，是最大的tf家族之一。wrkytf是植物生长和发育以及对环境刺激的防御反应的重要正负调节剂(eulgemetal.，2000；rushtonetal.，2010)。tf家族主要参与调节植物的免疫反应(sarrisetal.，2015)，一些wrkytf参与了多个生物过程，这表明wrky是植物免疫力与其他生物过程之间串扰的关键节点(rushtonetal.，2010)。此外，大多数第三类wrky基因的表达会因病原体侵袭和sa途径而被修饰(kaldeetal.，2003)。正如最近的研究表明，iii类wrky基因在植物应对非生物胁迫中起重要作用(lietal.，2013)，我们认为这些基因可能参与了植物对病原体侵袭和非生物胁迫之间的相互影响，可能调节了植物对这些胁迫的反应。有关wrky转录因子调控植物青枯病抗性的报道不多，本研究发现smwrky65转录因子在对青枯病抗性相关的调控中起到了正向的调节作用，对于阐明茄子抗青枯病分子机理有重要作用，同时对未来创制茄子广谱抗性材料以及抗病品种的选育工作都有重要的意义。以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。序列表<110>华南农业大学<120>茄子smwrky转录因子及其在提高茄子青枯病抗性方面的应用<130>zm201308zl<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1008<212>dna<213>solanummelongenal.<400>1taccaactctttcttagcaaactttttattttctctcattttttcttctaatttctatat60gatataaaacaaaatttagttaatcctcaaaaagtttttattttctttcttttttttttc120taagttatataagttatttttgtgttttttgatcatggaagatagttcatacaaaaatct180attttttcataaacaagaagattccaccggaactccaccggataatgctgctgattcttg240tttttccggtgatgaagcggcggaagttagcatgccatcacctagaaaaagtaggagagg300agcaaaaaagaaagtaatttcagtgccaataattgaaggtgatggatcaagaagtaaagg360ggaagtttatccaccacaagattcttggtcttggagaaaatatggacaaaaaccaattaa420aggatcaccttatcccaggggatattatcgatgcagtagctccaaaggctgtcccgccag480aaaacaagtcgagcgtagccgcctggaccccaccatgcttctcattacctattgctccga540acacaatcaccaaatcccggccgccgccgccgccaaacaccaccatcacaaccaccctac600taccaccaccagttcacccactacctctaccggcaccgccggagacaataatgctactgc660ggctgtagccacggactctaccgtagtagacaaatcatcccccgaagaaccagatctatt720tgcttatcaacacgataatggattttcagagctcgcggtgagttaggttggttttccgat780atgggaacaacaactacgtttatggagagtacgtcgtcgtccatggcgggatccacgtgg840aacgacagtgacgtggcgttaatgttgccgattcgagaagaggatcagtcgttgtacggt900gatctcggtgaattaccggaatgttcagttgttttccggcggtacagtgtggaaactccc960tgctgcggaggtacaggataattaaaaaaaaaaagaaatatactttga1008<210>2<211>276<212>prt<213>solanummelongenal.<400>2metgluaspargleutyrlysserprophephehislysglngluasp151015serthrglythrproproaspasnalaalaaspsercysphesergly202530aspglualaalagluilesermetproserproarglysargarggly354045alalyslyslysvalileservalproileileglualaaspglyser505560argserlysglygluvaltyrproproglnaspsertrpsertrparg65707580lystyrglyglnlysproilelysglyserprotyrproargglytyr859095tyrargcysserserserlysglycysproalaarglysglnvalglu100105110argserargleuaspprothrmetleuleuilethrtyrcysserasp115120125hisasnhisglnileproalaalaalaalathrlyshishishishis130135140asnhisprothrilealathrthrproserasnserserprothrthr145150155160serthrglythralagluaspasnasnalaalaalaalaalavalthr165170175aspalaalavalglnasplysserserproglugluproaspprophe180185190alatyrglnasnaspasnglyphesergluleualaglygluleugly195200205trpphesertyrmetglythrthrthrphemetgluserthrserthr210215220seralavalglyserthrtrpasnaspseraspvalalaleumetleu225230235240proileargglugluaspglnserleupheglyaspleuglygluleu245250255proglucysservalvalpheargargtyrglyvalgluthrprocys260265270cysglyglythr275<210>3<211>25<212>dna<213>solanummelongenal.<400>3atggaagataggctatacaaaagtc25<210>4<211>20<212>dna<213>solanummelongenal.<400>4ttatcctgtaccgccgcaac20<210>5<211>20<212>dna<213>solanummelongenal.<400>5ggatattatcgatgcagtag20<210>6<211>20<212>dna<213>solanummelongenal.<400>6ggtagatgtggtaggtgaac20<210>7<211>24<212>dna<213>solanummelongenal.<400>7cgcgcgctacactgatgtattcaa24<210>8<211>24<212>dna<213>solanummelongenal.<400>8tacaaagggcagggacgtagtcaa24<210>9<211>52<212>dna<213>solanummelongenal.<400>9gataagcttgatatcgaattcatggaagatagttcatacaaaaatctatttt52<210>10<211>41<212>dna<213>solanummelongenal.<400>10tttacccatactagtggatcctcctgtacctccgcagcagg41<210>11<211>36<212>dna<213>solanummelongenal.<400>11taaggttaccgaattcggatattatcgatgcagtag36<210>12<211>36<212>dna<213>solanummelongenal.<400>12gctcggtaccggatccggtagatgtggtaggtgaac36当前第1页1 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