水稻抗盐胁迫相关基因ONAC103及编码蛋白与应用的制作方法

本发明涉及分子生物学、基因工程技术领域，尤其是涉及水稻抗盐胁迫相关基因onac103及其编码的蛋白的应用。

背景技术：

水稻是世界上主要的粮食作物之一，其产量对粮食安全至关重要。同时水稻也可以作为模式植物应用于植物学研究当中，对于植物耐盐胁迫机制的研究具有重要意义。研究水稻各个时期生长发育的分子生物学机理以及对逆境胁迫的调控，不仅有助于了解水稻的生长发育机制，同时对水稻产量的提高具有重要的意义。

我国虽然幅员辽阔，国土面积广大，但因我国人口众多，造成人均耕地面积不足，使我国的可使用土地面积严重不足。同时，在干旱、半干旱地区等地区，还存在大面积的无法利用的盐碱地。水稻作为粮食作物对盐胁迫的响应机制以及抗性机制的研究是农业发展过程中重要的一环。通过筛选水稻抗盐相关的基因，分析其调控机理对培育耐盐胁迫的水稻品种具有非常重要的意义，同时有助于农业生产的可持续发展，节约水资源，减少对环境的污染与破坏。

水稻中存在大量调控抗盐胁迫相关的基因，在研究这些基因在水稻盐胁迫中的调控作用时，通常会通过分子生物学的手段将目的基因表达量上调或者下调来观察目的基因在盐胁迫过程中的调控作用。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供水稻盐胁迫抗性相关基因onac103。

本发明的第二目的在于提供水稻盐胁迫抗性相关基因onac103编码的蛋白。

本发明的第三目的在于提供水稻盐胁迫抗性相关基因onac103在培育盐胁迫抗性增强的水稻中的应用。

所述水稻盐胁迫抗性相关基因onac103的核苷酸序列如序列表中的seqidno：1所示。

所述水稻盐胁迫抗性相关基因onac103编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中的seqidno：2所示。

所述水稻盐胁迫抗性相关基因onac103可在提高水稻对盐胁迫的抗性，培育盐胁迫抗性增强的水稻中应用。

所述培育盐胁迫抗性增强的水稻可采用如下方法：

构建水稻盐胁迫相关基因onac103的过表达载体，并将其转化到水稻，筛选获得盐胁迫抗性增强的水稻。所述转化可采用农杆菌介导转化法、基因枪介导转化法，优选农杆菌介导转化方法。

本发明中通过构建水稻抗盐胁迫相关基因onac103的过表达转基因植株，使其在水稻中的表达量显著提高。利用150mmnacl模拟盐胁迫处理，观察盐胁迫后的表型，并统计成活率，最终确定onac103在水稻盐胁迫中的调控作用。

本发明中的水稻盐胁迫相关基因onac103的过表达转基因植株株系在盐胁迫处理后，复水后统计成活率发现，过表达onac103的转基因植株的成活率显著高于对照组。表明该基因的过表达转基因植株能够显著提高水稻对盐胁迫的抗性。本发明为培育盐胁迫抗性增强的水稻品种提供了一条重要途径。在农业生产上栽培盐胁迫抗性增强的水稻，对节能节水、盐碱地的利用、增加粮食产量等具有重要意义。

附图说明

图1为onac103的过表达转基因植株中，onac103的相对表达量检测，提取三叶一心期t0代转基因幼苗以及wt幼苗的总rna，反转录为cdna后，利用qpcr技术检测onac103的相对表达量。图中柱形图代表onac103在过表达转基因植株的相对表达量，wt代表野生型水稻品种台北309(tp309)，onac103^oe-1、onac103^oe-2、onac103^oe-3、onac103^oe-4、onac103^oe-5、onac103^oe-6、onac103^oe-7、onac103^oe-8、onac103^oe-9、onac103^oe-10代表t0代过表达转基因植株。柱形图代表onac103在转基因植株以及wt中的相对表达量。柱形图上的数线代表标准差(sd)，为生物学重复的标准差。每个生物学重复包括三个技术重复。

图2为t1代三叶一心期幼苗转基因植株以及相对应的同时期tp309盐胁迫处理情况。处理时基础培养基为1/2ms。处理的盐浓度为150mmnacl，在处理前拍照，处理7天后拍照，然后采用1/2ms复水20天后拍照，统计成活率。

图3为盐胁迫处理后成活率。在盐胁迫处理7天后，复水20天统计成活率。标准差(sd值)为三次重复试验的标准差。柱形图代表盐胁迫处理后的成活率，其上竖线代表三次实验重复的标准差；“*”表示onac103过表达转基因植株与野生型植株之间的成活率存在极显著差异(p<0.05)。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例1：抗盐胁迫相关基因onac103目的片段的获得

本发明中以tp309为材料，利用试剂盒提取总rna，通过反转录试剂盒将rna反转录为cdna。以cdna为模板，扩增目的片段可利用高保真酶，本发明中利用primerstarhsdnapolymerase扩增目的片段。引物序列为：

oe-onac103-for：gatgtttgggttcgggcacc

oe-onac103-rev：tcagaatagctgaggaggaagc

pcr扩增的反应体系为：

pcr的扩增条件为94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃1min10s，循环数为35个循环；72℃延伸5min。4℃保温。

利用胶回收或pcr产物纯化等手段对pcr产物进行回收，将回收的pcr产物加a尾。加a尾时利用easytaqdnapolymerase。反应体系为：

反应程序：72℃保温30min即可。

本发明中所用的过表达载体采用限制性内切酶xcmⅰ，37℃酶切3h。酶切后进行65℃热失活。热失活后进行连接，pcr产物50ng，酶切后载体100ng，5μlsolutionⅰ连接酶，16℃连接3h。热击转化进入大肠杆菌感受态细胞dh5α，37℃倒置培养过夜。然后进行pcr鉴定。pcr鉴定阳性的菌落提取质粒测序。测序正确后将正确的质粒转化进入农杆菌感受态eha105，用于水稻的遗传转化。20％甘油保存菌株在-80℃。

实施例2：农杆菌转化获得转基因水稻植株

第一步：水稻愈伤组织准备

1、选取tp309水稻种子去壳，置于50ml离心管中，用无菌水洗3次，每次1min；

2、用75％乙醇消毒种子三次，每次1min，用无菌水洗净；

3、加入10％次氯酸钠溶液，抽真空8min，再置于翻转混匀仪上30n/min，摇20min；

4、用无菌水洗净水稻种子表面的次氯酸钠溶液，将种子放置于灭菌的滤纸上吹干；

5、用镊子将种子接种于nbd培养基上，，黑暗条件下培养21d后进行掐芽处理，掐芽时注意完全掐去胚芽鞘、气生根等，只留下生长状态良好的愈伤组织(一般为橘黄色)，再培养3-7d用于农杆菌侵染。

第二步：农杆菌浸染液制备

1、小量yep培养基活化农杆菌，28℃200rpm(加入kan50mg/l、rif50mg/l)放4℃备用；

2、取活化菌液按1︰1000接种到100mlyep培养基(加入kan50mg/l、rif50mg/l)中。28℃200rpm震荡培养，每次间隔1h测定一次od600值。待od600为0.3～0.8时即可用于侵染；

3、将活化的农杆菌分装到50ml离心管中，4000rpm室温(约25℃)离心8min，弃上清，收集菌体；

4、用适量aam-as培养基重悬菌体(1︰1000加入100μmas)，最终使菌液od600为0.5左右，颠倒混匀即可。

第三步：愈伤组织的浸染、分化、生根

1、挑选生长状况良好、结构紧密的愈伤组织置于农杆菌侵染液中，充分颠倒混匀后，室温静置浸染30min；

2、倒掉农杆菌侵染液，将浸染过后的愈伤组织转移至装有灭菌滤纸的平皿中充分吹干，转移至nbd-as培养基上，26℃黑暗条件下培养3d；

3、愈伤洗涤。将共培养3d后的愈伤组织移至三角瓶，用灭菌水充分洗净，再用加有125mg/lcef和125mg/lcarb的无菌抽真空5min，28℃200rpm振荡20min；

4、将洗净的愈伤组织置于灭菌滤纸上充分吹干后移至筛选培养基，26℃黑暗条件下培养。培养过程中注意观察是否有污染，若有污染及时清理；

5、每隔20d后继代到新的筛选培养基，待浸染后的愈伤在筛选培养基中长出新的阳性愈伤，将阳性愈伤移至分化培养基；

6、待分化出新的水稻植株后，将水稻转基因苗移至生根培养基；

7、在生根培养基中生长一段时间后，移到水中驯化培养后，移栽到土中。置于自然条件下培养。

第四步：转基因苗鉴定

pcr鉴定取三叶一心期幼苗叶片，ctab法提取叶片dna，然后通过pcr扩增，由于过表达载体中采用泛素启动子(ubiquitin)，所以本发明中设计该启动子上的特异性引物ubifor引物用于转基因植株的鉴定。反向引物采用目的片段的反向引物。引物序列为：

ubifor：ttttagccctgccttcatacgc

oe-onac103rev:tcagaatagctgaggaggaagc

pcr鉴定时，本发明以tp309为阴性对照，以onac103的过表达载体为阳性对照。pcr鉴定时与阳性对照条带一致的为阳性转基因植株，与阴性对照一致的假阳性转基因植株。阳性转基因鉴定完毕后，通过qpcr检测onac103在过表达转基因植株中的相对表达量。首先提取onac103过表达转基因植株以及tp309的总rna，每个株系取3个生物学重复，每个生物学重复取3个技术重复，以水稻actin为内参基因。qpcr引物序列为：

qpcronac103for:gcactatcctccttgattcg

qpcronac103rev:cagtgctttcctctgaaacc

actinfor:tgtatgccagtggtcgtacca

actinrev:ccagcaaggtcgagacgaa

qpcr程序为：95℃30s预变性，95℃5s变性，60℃30s退火及延伸，循环数为40个。在每个循环60℃延伸最后5s进行荧光信号采集。扩增完成后，从60℃开始升温，每隔0.3℃采集一次信号，直至升高到95℃。程序完成后导出数据进行分析。数据分析时采用2-δδct相对定量的方法对目的基因相对表达量进行分析。qpcr结果如图1所示：相对于tp309，除3#过表达株系表达量提高20倍左右外，其他5个过表达株系的相对表达量都在40-50倍之间。因此，在过表达转基因植株中onac103表达量均显著高于wt。

实施例3：过表达转基因植株抗盐胁迫能力分析

图2为t1代三叶一心期幼苗转基因植株以及相对应的同时期tp309盐胁迫处理情况。处理时基础培养基为1/2ms。处理的盐浓度为150mmnacl，在处理前拍照，处理7天后拍照，然后采用1/2ms复水20天后拍照，统计成活率。

首先利用tp309和t1代onac103过表达转基因植株进行盐胁迫处理分析onac103对盐胁迫调控情况。具体过程如下：将脱壳的水稻种子，利用上文中所述的方法进行消毒之后，过表达转基因植株播种于含有50mg/l潮霉素的1/2ms培养基，tp309播种在固体1/2ms培养基中。待种子发芽，长出主根后移出组培瓶，转移到黑色组培盒，在1/2ms培养基中进行水培培养。在水稻幼苗长至21d时，挑选生长状态一致的幼苗进行处理，处理时采用液体1/2ms培养基进行水培。培养基中加入150mmnacl，模拟盐胁迫处理，处理后观察胁迫表型，并统计成活率。统计结果如图3所示：在150mmnacl处理后，tp309的成活率为25％，而onac103过表达植株的成活率为75％，onac103过表达植株的成活率显著高于tp309。以上说明onac103可以提高水稻对盐胁迫的耐受性。

序列表

<110>厦门大学

<120>水稻抗盐胁迫相关基因onac103及编码蛋白与应用

<130>onac103

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1041

<212>dna

<213>oryzasativa

<400>1

atggagatgacgatgtcgtcggcggcgacgtcgctgccgccggggttccggttccacccg60

acggacgaggagctgatcctgcactacctccgcagccgcgccaccgccgggcagtgcccc120

gtccccatcatcgccgacgtcgacatctacaagttcgatccatgggacctgccatcgaag180

gcggtgtacggggagagtgagtggtatttcttcagcccgcgagaccgcaagtaccccaac240

ggaatccggccgaaccgcgccgccgggtcggggtactggaaggcgacgggaaccgacaag300

cccatccacgacagcgccaccggcgagagcgtcggcgtcaagaaggccctcgtcttctac360

cgcggccgccctcccaagggcaccaagaccagctggatcatgcacgagtaccgcctcgcc420

gccgaccctctcgccgccgccgcaaacacctacaagccctcctcctcctcccgattccgc480

aacgtctccatgaggctggacgactgggtgctctgccggatctacaagaagtccggccag540

gcgtcgccgatgatgccgccgctcgccgccgactacgaccacgacgagccgtccggagtc600

cttgacgacgcctacagcttctacgcgccgccgatgatcagcaccacgctcatccccaag660

ctccccaagatcccctccatctccgagctcttcgacgagcacgcgctcgcccagatcttc720

gacgccgccgccgacccgccggccgaccaccatcagcatgccctcgccgtccacccctcc780

ctgaaccagctcctcggcgtcggcgacaacttcctcgcggagtgctacccgtcgacggcg840

tccacggccaccgttgccggcggcaagcgcaaggcgagcccggccggagactacgccggc900

ggcggccacacgccggcgaagaggctcaacggctcatgcttcgacgtggcgccgcagtcc960

gtggtgggcggcttgcaagcgacgccgtcgtcagtcctcgccggactcaaccaccagatg1020

cttcctcctcagctattctga1041

<210>2

<211>346

<212>prt

<213>oryzasativa

<400>2

metglumetthrmetserseralaalathrserleuproproglyphe

151015

argphehisprothraspglugluleuileleuhistyrleuargser

202530

argalathralaglyglncysprovalproileilealaaspvalasp

354045

iletyrlyspheaspprotrpaspleuproserlysalavaltyrgly

505560

gluserglutrptyrphepheserproargasparglystyrproasn

65707580

glyileargproasnargalaalaglyserglytyrtrplysalathr

859095

glythrasplysproilehisaspseralathrglygluservalgly

100105110

vallyslysalaleuvalphetyrargglyargproprolysglythr

115120125

lysthrsertrpilemethisglutyrargleualaalaaspproleu

130135140

alaalaalaalaasnthrtyrlysproserserserserargphearg

145150155160

asnvalsermetargleuaspasptrpvalleucysargiletyrlys

165170175

lysserglyglnalaserprometmetproproleualaalaasptyr

180185190

asphisaspgluproserglyvalleuaspaspalatyrserphetyr

195200205

alaproprometileserthrthrleuileprolysleuprolysile

210215220

proserilesergluleupheaspgluhisalaleualaglnilephe

225230235240

aspalaalaalaaspproproalaasphishisglnhisalaleuala

245250255

valhisproserleuasnglnleuleuglyvalglyaspasnpheleu

260265270

alaglucystyrproserthralaserthralathrvalalaglygly

275280285

lysarglysalaserproalaglyasptyralaglyglyglyhisthr

290295300

proalalysargleuasnglysercyspheaspvalalaproglnser

305310315320

valvalglyglyleuglnalathrproserservalleualaglyleu

325330335

asnhisglnmetleuproproglnleuphe

340345

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>oryzasativa

<400>3

gatatgtttgggttcgggcacc22

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>oryzasativa

<400>4

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<210>5

<211>20

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<213>oryzasativa

<400>5

gcactatcctccttgattcg20

<210>6

<211>20

<212>dna

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<400>6

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<210>7

<211>21

<212>dna

<213>oryzasativa

<400>7

tgtatgccagtggtcgtacca21

<210>8

<211>19

<212>dna

<213>oryzasativa

<400>8

ccagcaaggtcgagacgaa19

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