6-羟基硫酸褪黑素衍生物及其免疫原、特异性抗体的制备方法和应用与流程

本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种6-羟基硫酸褪黑素衍生物及其免疫原、特异性抗体的制备方法和应用，还涉及6-羟基硫酸褪黑素免疫检测试剂。

背景技术：

孤独症谱系障碍(autismspectrumdisorders，asd)是一种起病于婴幼儿期的神经发育障碍性疾病，患病率呈逐年上升趋势，该病以社会沟通与交往障碍，局限的、重复的刻板行为，狭窄的兴趣或活动为核心症状。近年来asd患儿所伴有的临床相关问题引起关注，特别是睡眠问题，有研究报道asd患儿常伴睡眠-觉醒障碍问题，其中失眠最为常见，以入睡困难，睡眠持续时间短和夜醒次数多等症状为主，这可能是由于asd患儿体内调节昼夜生物节律的下丘脑-垂体-肾上腺轴功能紊乱，引起相关神经递质代谢通路异常而导致的。研究发现asd患儿体内对昼夜生理节律及睡眠-觉醒节律的调节发挥重要作用的褪黑激素及其代谢产物6-羟基硫酸褪黑素(6-sulfatoxymelatonin，6-sm)的水平偏低。褪黑激素是一种重要的神经内分泌激素，对机体早期神经发育、睡眠-觉醒节律、氧化应激等生理机能发挥重要作用，其合成受光周期和位于下丘脑视交叉上核生物钟的调控，呈昼夜和季节性的变化规律，褪黑激素的分泌量在凌晨两点左右达到高峰，褪黑激素的主要代谢产物6-sm随尿液排出，其化学性质十分稳定，尿液中6-sm的水平可以代表血液中褪黑激素的水平。研究发现asd患儿晨尿中6-sm的水平明显低于健康儿童对照组。进一步研究发现asd患儿的6-sm水平与睡眠问题的严重程度呈明显负相关，即6-sm水平越低，asd患儿存在的睡眠问题就越严重，这表明asd患儿睡眠问题可能与其体内褪黑激素的分泌量减少有关。因此，对asd患儿尿液中的6-sm水平进行检测与监控，对于提高asd患儿的治疗与康复效果具有重要的临床意义。

检测6-羟基硫酸褪黑素的实验室方法有比色法、放射免疫分析法、高效液相色谱法、液相串联质谱法、酶联免疫吸附测定法、免疫比浊法等。比色法检测的是褪黑激素与6-羟基硫酸褪黑素等物质的总和而非单一化合物水平；放射免疫分析法稳定性较差，且存在放射线辐射和污染等问题；高效液相色谱法前处理复杂，要求目标分析物在色谱上被完全分离，因此分析时间较长；液相串联质谱法检测灵敏度高，快速，但结构复杂，维护成本高，需经过专门培训的技术人员操作，不易在基层医疗机构普及；酶联免疫吸附测定法灵敏度高，特异性好，但检测时间长，准确度差，难以用于批量检测。

因此，目前市面上缺乏线性范围宽、灵敏度高、准确度高、精密度高，检测时间短，样品处理简单，仪器自动化程度高，可多样本连续检测的6-羟基硫酸褪黑素检测产品。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种6-羟基硫酸褪黑素衍生物，该衍生物为新合成的化合物，自然界中不存在。

本发明的第一个目的采用以下技术方案实现：一种6-羟基硫酸褪黑素衍生物，其结构式如式ⅰ所示：

本发明的第二个目的在于提供一种如上所述的6-羟基硫酸褪黑素衍生物的制备方法，该制备方法不同于常规制备方法，具有良好的合成效果，显著提高了6-羟基硫酸褪黑素衍生物的合成效率。

本发明的第二个目的采用以下技术方案实现：一种如结构式i所示的6-羟基硫酸褪黑素衍生物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将化合物1与氯甲酸乙在碱性条件下酯反应，得到化合物2：

优选地，将化合物1与氯甲酸乙酯溶于合适的溶剂(如dcm)中，加入碱，n2条件下搅拌至反应完全，得到目标化合物2；优选地，化合物1与氯甲酸乙酯的摩尔投料比为1:0.5～1.5，更优选地，为1:1～1.2；

所述的碱为naoh、koh、na2co3、k2co3，或lioh中的一种，优选所述碱为naoh；

优选地，反应结束之后对反应混合物进行分离纯化，例如分别采用乙酸乙酯稀释，饱和食盐水洗涤，然后干燥处理，得到目标化合物。

(2)将化合物2与乙酰氯反应，得到化合物3：

优选地，将化合物2溶于适当的溶剂(如thf)中，然后加入三氯化铝和乙酰氯，在合适的温度(如20～30℃)条件下搅拌，反应结束后，进行纯化，得到化合物3；进一步优选地，反应结束后，向反应混合物中加入水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，有机层浓缩后色谱柱纯化，分离得到高纯度的化合物3。

进一步优选地，化合物2、乙酰氯和三氯化铝的摩尔用量比为1:1～1.1:1～1.1；最优选地，化合物2与乙酰氯的摩尔投料比为1:1.05，化合物2与三氯化铝的摩尔投料比为1:1.05。

(3)将化合物3与2-(氨基氧基)乙酸叔丁酯在碱性条件下反应，得到化合物4：

优选的，将化合物3溶于适当的溶剂(如dmf)中，然后加入2-(氨基氧基)乙酸叔丁酯和碱，于60～90℃下搅拌，反应结束后，对反应物进行纯化，优选地，向反应混合物中加入水，然后用乙酸乙酯萃取，有机层浓缩并用快速色谱法纯化，得到化合物4；

其中优选地，化合物3与2-(氨基氧基)乙酸叔丁酯的摩尔投料比为1:0.8～1.2；其中所述2-(氨基氧基)乙酸叔丁酯具有如下结构：

所述碱为naoh、koh、na2co3、k2co3，或lioh中的一种，优选所述碱为k2co3。

(4)将化合物4通过水解反应，脱去叔丁基，得到6-羟基硫酸褪黑素衍生物：

优选地，将化合物4溶于合适的溶剂(如thf)中，然后向化合物4的thf溶液中加入酸，进行水解反应，得到式ⅰ所示的目标化合物，进一步优选地，所述酸为hcl与甲醇的混合溶液，其中hcl与meoh体积比为1:5～10，hcl的浓度为6mol/l～8mol/l。

本发明的第三个目的在于提供一种6-羟基硫酸褪黑素免疫原。

本发明的第三个目的采用以下技术方案实现：一种6-羟基硫酸褪黑素免疫原，所述6-羟基硫酸褪黑素免疫原由上述结构式ⅰ所示的6-羟基硫酸褪黑素衍生物与载体蛋白连接而成，其结构式如式ⅱ所示：

其中，载体蛋白为重组牛血清白蛋白，优选地，所述重组牛血清白蛋白的氨基酸序列为seqidno：1。

其中seqidno：1的序列如下所示：

mkwvtfisllllfssaysrgvfrrdthkkseiahrfkdlgeehfkglvliafsqylqqcpfdehvkklvneltefakktcvadeshagcekslhtlfgdelckkvaslretygdmadccekqepernecflshkddspdlpklkpdpntlcdefkadekkfwgkylyeiarrhpyfyapellyyankkyngvfqeccqaedkgacllpkkietmrekvltssarqrlrcasiqkkfgeralkawsvarlsqkfpkaefvevtkklvtdltkvhkecchgdllecaddradlakyicdnqdtissklkkeccdkpllekshciaevekdaipenlppltadfaedkkdvcknyqeakdaflgsflyeysrrhpeyavsvllrlakkeyeatleeccakddphacystvfdklkkhlvdepqnlikqncdqfeklgeygfqnalivrytrkkvpqvstptlvevsrslgkvgtrcctkkpesermpctedylslilnrlcvlhektpvsekkvtkccteslvnrrpcfsaltpdetyvpkafdeklftfhadictlpdtekkqikkqtalvellkhkpkateeqlkktvmenfvafvdkccaaddkeacfavegpkklvvstqtala

本发明第四个目的在于提供一种上述式ii所示的6-羟基硫酸褪黑素免疫原的制备方法。

本发明的第四个目的采用以下技术方案实现：一种上述式ii所示的6-羟基硫酸褪黑素免疫原的制备方法，包括以下步骤：

(b1)载体蛋白溶液的制备：将重组牛血清白蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中，得到载体蛋白溶液；

(b2)6-羟基硫酸褪黑素衍生物溶液的制备：将上述结构式ⅰ所示的6-羟基硫酸褪黑素衍生物与二甲基甲酰胺、乙醇、磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和n-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解，得到结构式ⅰ所示的6-羟基硫酸褪黑素衍生物溶液；

(b3)式ii所示的6-羟基硫酸褪黑素免疫原的合成：将步骤(b2)得到的6-羟基硫酸褪黑素衍生物溶液加入到步骤(b1)得到的载体蛋白溶液中，搅拌反应，经透析纯化，得到式ii所示的6-羟基硫酸褪黑素免疫原。

进一步优选地，(b1)所述重组牛血清白蛋白氨基酸序列为seqidno：1。

在本发明的一个优选实施方式中，提供了一种式ii所示的述6-羟基硫酸褪黑素免疫原的制备方法，包括以下步骤：

(b1)载体蛋白溶液的制备：将载体蛋白溶解于0.2m的磷酸钾缓冲液(ph＝8.5)中，载体蛋白的终浓度为3-5mg/ml，得到载体蛋白溶液；

(b2)6-羟基硫酸褪黑素衍生物溶液的制备：将100-300mg上述的6-羟基硫酸褪黑素衍生物、2-6ml二甲基甲酰胺、2-6ml乙醇、3-10ml的磷酸钾缓冲液(10mm，ph＝5.0)、100-300mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、20-80mgn-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解反应30-120min，得到6-羟基硫酸褪黑素衍生物溶液；

(b3)6-羟基硫酸褪黑素免疫原的合成：将步骤(b2)得到的6-羟基硫酸褪黑素衍生物溶液加入到步骤(b1)得到的载体蛋白溶液中，并在0-8℃下搅拌过夜，经透析纯化，得到式ii所示的6-羟基硫酸褪黑素免疫原。

本发明的第五个目的在于提供一种抗6-羟基硫酸褪黑素特异性抗体。

本发明的第五个目的采用以下技术方案实现：一种抗6-羟基硫酸褪黑素特异性抗体，所述抗6-羟基硫酸褪黑素特异性抗体为使用式ii所示的6-羟基硫酸褪黑素免疫原对实验动物进行注射后所得到的特异性抗体，所述的实验动物为兔子、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、豚鼠或马中的一种。

本发明的第六个目的在于提供一种如上所述的抗6-羟基硫酸褪黑素特异性抗体的制备方法。

本发明的第六个目的采用以下技术方案实现：一种抗6-羟基硫酸褪黑素特异性抗体的制备方法，包含以下步骤：

(c1)将式ii所示的6-羟基硫酸褪黑素免疫原用磷酸盐缓冲液稀释，得到6-羟基硫酸褪黑素人工抗原溶液，然后将6-羟基硫酸褪黑素人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对上述的实验动物进行多点注射；

(c2)3-6周后，再用相同的6-羟基硫酸褪黑素人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对步骤(c1)所述的实验动物进行多点注射，之后每隔3-6周注射一次，共计注射3-10次；

(c3)对步骤(c2)中完成注射的实验动物取血，分离纯化，得到抗6-羟基硫酸褪黑素特异性抗体。

在本发明的一个优选实施方式中，提供了一种所述抗6-羟基硫酸褪黑素特异性抗体的制备方法，包含以下步骤：

(c1)将上述的6-羟基硫酸褪黑素免疫原用0.01m磷酸钠缓冲液(ph＝6.0)稀释至终浓度为1.0-3.0mg/ml，得到人工抗原溶液，然后将人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔子进行多点注射；

(c2)4周后，再用相同的人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对步骤(c1)所述的实验动物兔子进行多点注射，之后每隔4周注射一次，共计注射5-8次；

(c3)对步骤(c2)完成注射的实验动物兔子取血，分离纯化，得到抗6-羟基硫酸褪黑素特异性抗体。

本发明的第七个目的在于提供一种6-羟基硫酸褪黑素均相酶免疫检测试剂。

本发明的第七个目的采用以下技术方案实现：一种6-羟基硫酸褪黑素均相酶免疫检测试剂，由r1试剂与r2试剂组成，其中，所述r1试剂包含前述的抗6-羟基硫酸褪黑素特异性抗体与r1缓冲液；所述r2试剂包含6-羟基硫酸褪黑素重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物与r2缓冲液；

所述的r1缓冲液含有酶底物、辅酶、牛血清白蛋白及tris缓冲液，所述的酶底物为葡萄糖-6-磷酸，所述的辅酶为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；

所述的6-羟基硫酸褪黑素重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物由上述结构式ⅰ所示的6-羟基硫酸褪黑素衍生物与重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联而成；其结构式如式ⅲ所示：

所述的r2缓冲液为含有牛血清白蛋白的tris缓冲液。

进一步地，优选所述重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的氨基酸序列为seqidno：2。

其中，seqidno：2的序列如下所示：

msttpntptsashepsckkvsagphegpsspagkrpappctlvifgaggdltkkrllvpalynlavdgllddgmkiigvnhgeretsvwredlhkkslqqfaadkastfhagklddkawdwvaqrleymagefetddtftkklkqkldqapggnvifylavssrffkkpivehlgkagllkeadggsggfrrivvekkpfgtdlatardlnahilsyanesqvyridhflgkkdtvqsilavrfanalfepiwrreyidsvqitaaetigvegrgkkfyeqtgafrdmlpnhlfqllgmvameppnsfdkaeavrdkkaeifdaiqpltaddvvfgqyekkgpagvgyreepdvapdsttetyaaarvyvenwrwagvpfylrtgkkrlaarrteisvqlkkpvpfrlfrdtpvdaltpnvltlridpahgtsfdfnvkktpgplmqigavqssfdyadffaekkanvgyetllydcmlgdetlfqradsietswaavddvlhpkksggampvhgypagsegpaeadallardghawrplkkrdavekk

具体的，所述6-羟基硫酸褪黑素均相酶免疫检测试剂的制备方法，包含以下步骤：

(d1)将0.25％牛血清白蛋白、50mmol/l葡萄糖-6-磷酸及50mmol/l氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依次加入50mmol/ltris缓冲液中搅拌溶解制成r1缓冲液，再将抗6-羟基硫酸褪黑素特异性抗体1以1∶500-1∶5000的体积比加入到上述r1缓冲液中混匀，再用6mol/l的盐酸调节ph至8.0，制成r1试剂；

(d2)将0.25％牛血清白蛋白加入100mmol/ltris缓冲液中搅拌溶解制成r2缓冲液，再将6-羟基硫酸褪黑素重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物以1:1000～1:8000的体积比加入到上述r2缓冲液中混匀，再用6mol/l的盐酸调节ph至7.6，制成r2试剂；

所述的6-羟基硫酸褪黑素重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物的制备方法，包含以下步骤：

(e1)称取15mg活力单位为100ku的重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，在室温条件下溶解于30ml磷酸钠(ph＝8.0)缓冲液中，然后加入225mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、135mg葡萄糖-6-磷酸以及0.75ml卡必醇，再逐滴加入2ml二甲基亚砜，得到重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；

(e2)在无水状态下称取10mg上述结构式ⅰ所示的6-羟基硫酸褪黑素衍生物，溶解于600μl二甲基甲酰胺中，将上述溶液温度降到-2～-8℃后加入3μl三丁胺、1.5μl氯甲酸异丁酯、1.5μln，n′-二环己基碳二亚胺，-2～-8℃下搅拌30分钟，得到6-羟基硫酸褪黑素衍生物激活液；

(e3)将6-羟基硫酸褪黑素衍生物激活液逐滴加入到重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，2-8℃搅拌反应12小时，反应结束后经g-25凝胶层析柱纯化得到结构式如式iii所示的6-羟基硫酸褪黑素重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物。

本发明的第八个目的在于提供一种6-羟基硫酸褪黑素胶乳增强免疫比浊检测试剂。

本发明的第八个目的采用以下技术方案实现：一种6-羟基硫酸褪黑素胶乳增强免疫比浊检测试剂，由l1试剂与l2试剂组成；

其中，所述l1试剂由前述的抗6-羟基硫酸褪黑素特异性抗体、ph＝8.0的缓冲液、牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸、促凝剂以及防腐剂组成；

所述l2试剂由6-羟基硫酸褪黑素-牛血清白蛋白复合体包被的聚苯乙烯胶乳颗粒、ph＝8.0的缓冲液、牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸以及防腐剂组成；

所述的6-羟基硫酸褪黑素-牛血清白蛋白复合体由前述结构式ⅰ所示的6-羟基硫酸褪黑素衍生物与牛血清白蛋白偶联而成，其结构式如式ⅳ所示：

所述的聚苯乙烯胶乳颗粒直径范围为50-250nm；

所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、mes缓冲液、硼酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液或巴比妥缓冲液中的一种；

所述促凝剂为peg-4000、peg-6000、peg-8000或硫酸葡聚糖钠中的一种；

所述防腐剂为叠氮钠、硫柳汞、苯酚或乙基汞硫代硫酸钠中的一种；

具体的，所述6-羟基硫酸褪黑素胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法，包含以下步骤：

(f1)将0.5mg/ml的抗6-羟基硫酸褪黑素特异性抗体溶解于50mmol/lph＝8.0的磷酸盐缓冲液中，然后添加质量分数为0.5％-2.5％的牛血清白蛋白、0.25％-1.0％的氯化钠、0.1％-0.5％的吐温-20、1.0％-5.0％的丙三醇、0.1％-1.0％的乙二胺四乙酸、0.5％-2.5％的peg-4000以及0.01％-0.1％的叠氮钠，搅拌均匀，调节ph＝7.5，制成l1试剂；

(f2)将0.5mg表面带有羧基的直径为150nm的聚苯乙烯胶乳颗粒加入4.5ml0.05mol/lph＝6.2的mes缓冲液中，然后加入5mg碳二亚胺，在37℃下反应1小时，制成胶乳颗粒溶液，再将0.5mg6-羟基硫酸褪黑素-牛血清白蛋白复合体用4.5ml0.05mol/lph＝9.2的硼酸盐缓冲液稀释后，立即加入到上述胶乳颗粒溶液中，在37℃下反应12小时，然后加入1ml0.1mol/lph＝8.5的甘氨酸缓冲液搅拌2小时，反应终止后离心去除上清液，再将沉淀物用10ml50mmol/lph＝8.0的tris-hcl缓冲液洗涤3次，再用25ml50mmol/lph＝8.5的甘氨酸缓冲液稀释成胶乳悬浊液，最后加入质量分数为0.5％-2.5％的牛血清白蛋白、0.25％-1.0％的氯化钠、0.1％-0.5％的吐温-20、1.0％-5.0％的丙三醇、0.1％-1.0％的乙二胺四乙酸以及0.01％-0.1％的叠氮钠，搅拌均匀，制成l2试剂；

所述的6-羟基硫酸褪黑素-牛血清白蛋白复合体的制备方法，包含以下步骤：

将10mg牛血清白蛋白用5ml0.1mol/lph＝7.8的磷酸盐缓冲液稀释，然后加入100mg上述结构式ⅰ所示的6-羟基硫酸褪黑素衍生物，再加入50mg的偶联活化剂，在4℃下反应12小时，再用0.1mol/lph＝7.8的磷酸盐缓冲液在4℃下透析18小时，得到6-羟基硫酸褪黑素-牛血清白蛋白复合体；

所述的偶联活化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、n，n′-二环己基碳二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺、三丁胺、戊二醛、二异氰酸化合物或二卤化二硝基苯中的一种。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1.本发明设计的结构式i所示的6-羟基硫酸褪黑素衍生物及其合成方法均为针对性的新设计与研究，在现有技术中并不存在；

2.本发明以结构式i所示的6-羟基硫酸褪黑素衍生物制备出的抗6-羟基硫酸褪黑素特异性抗体的特异性强、灵敏度高，并且与常见的32种激素及激素代谢物无任何交叉反应，因此能够用于制备具有较高的准确性、精密度、灵敏度和特异性的6-羟基硫酸褪黑素检测试剂；

3.本发明使用经过基因工程改造得到的重组牛血清白蛋白与6-羟基硫酸褪黑素衍生物偶联得到6-羟基硫酸褪黑素免疫原，以及使用经过基因工程改造得到的重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与6-羟基硫酸褪黑素衍生物偶联得到6-羟基硫酸褪黑素酶标偶联物，偶联效率高，显著提高免疫原的免疫原性与酶标偶联物的稳定性。

4.本发明的两种6-羟基硫酸褪黑素检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对6-羟基硫酸褪黑素高通量、快速化的检测，能同时测定多个样品，具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低6-羟基硫酸褪黑素检测成本，有利于临床推广使用。

附图说明

图1为实施例4所述6-羟基硫酸褪黑素的elisa检测标准曲线；

图2为实施例8所述6-羟基硫酸褪黑素均相酶免疫检测试剂校准曲线；

图3为实施例10所述6-羟基硫酸褪黑素胶乳增强免疫比浊检测试剂校准曲线。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，这些附图均为简化的示意图，仅以阐释说明本发明的有益效果。除非特别指明，以下实施例中所用的试剂、仪器、设备、耗材均可从正规渠道商购买获得。

实施例1：6-羟基硫酸褪黑素衍生物的合成

(1)化合物2的合成：

将化合物1(50g,0.2mol)与氯甲酸乙酯(22g,0.2mol)溶解于dcm(250ml)中，然后向混合物中加入naoh(8g,0.2mol)，n2条件下搅拌过夜，然后将混合物用乙酸乙酯稀释，盐水洗涤，硫酸钠干燥，旋转蒸干，得到26g固体化合物，即为化合物2。

(2)化合物3的合成：

将化合物2(26g,85mmol)溶解于200ml四氢呋喃中，然后在溶液中加入三氯化铝(12g,90mmol)和乙酰氯(7g,90mmol)，然后室温搅拌0.5h；然后用水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，有机层浓缩并用色谱柱纯化，得到化合物3共14g。

(3)化合物4的合成：

将化合物3(2g,5.8mmol)溶解于dmf(20ml)中，然后加入2-(氨基氧基)乙酸叔丁酯(10g,5.8mmol)和碳酸钾(11g)，然后80℃搅拌过夜；反应结束后，向反应混合物中加入水，然后用乙酸乙酯萃取，有机层浓缩并用快速色谱法纯化，得到棕色固体1.2g，即为化合物4。

(4)式i所示6-羟基硫酸褪黑素衍生物的合成：

将化合物4(1.1g)溶解于thf(50ml)中，然后在溶液中加入10mlhcl与meoh的混合溶液(hcl与meoh体积比为1:5，hcl浓度为6mol/l)，室温搅拌过夜，反应结束后，将反应混合物浓缩，快速色谱柱纯化，得到0.6g式i所示的6-羟基硫酸褪黑素衍生物。

实施例2：6-羟基硫酸褪黑素免疫原的制备

6-羟基硫酸褪黑素免疫原的制备方法具体步骤如下：

(1)载体蛋白溶液的制备：将重组牛血清白蛋白(氨基酸序列为seqidno：1)溶解于0.2m的磷酸钾缓冲液(ph＝8.5)中，载体蛋白的终浓度为3-5mg/ml，得到载体蛋白溶液；

(2)6-羟基硫酸褪黑素衍生物溶液的制备：将100-300mg上述的6-羟基硫酸褪黑素衍生物、2-6ml二甲基甲酰胺、2-6ml乙醇、3-10ml的磷酸钾缓冲液(10mm，ph＝5.0)、100-300mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、20-80mgn-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解反应30-120min，得到6-羟基硫酸褪黑素衍生物溶液；

(3)6-羟基硫酸褪黑素免疫原的合成：将步骤(2)得到的6-羟基硫酸褪黑素衍生物溶液加入到步骤(1)得到的载体蛋白溶液中，并在0-8℃下搅拌过夜，经透析纯化，得到6-羟基硫酸褪黑素免疫原，结构式如式ii所示：

实施例3：抗6-羟基硫酸褪黑素特异性抗体的制备

抗6-羟基硫酸褪黑素特异性抗体的制备方法具体步骤如下：

(1)将实施例2制备的6-羟基硫酸褪黑素免疫原用0.01m磷酸钠缓冲液(ph＝6.0)稀释至终浓度为1.0-3.0mg/ml，得到人工抗原溶液，然后将人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔子进行多点注射；

(2)4周后，再用相同的人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对步骤(1)中实验动物兔子进行多点注射，之后每隔4周注射一次，共计注射5-8次；

(3)对步骤(2)完成注射的实验动物兔子取血，分离纯化，得到抗6-羟基硫酸褪黑素特异性抗体。

实施例4：elisa法检验抗6-羟基硫酸褪黑素特异性抗体的性能

1、6-羟基硫酸褪黑素的elisa检测标准曲线的建立：

(1)elisa标准品的制备：

将6-羟基硫酸褪黑素粉末(购于sigma公司)溶解于甲醇溶液，制备成1mg/ml的储存液。用elisa缓冲液将储存液依次稀释为0.00ng/ml、10.00ng/ml、20.00ng/ml、40.00ng/ml、80.00ng/ml、160.00ng/ml的标准溶液。其中，elisa缓冲液含有50mmtris，145mmnacl和体积百分比0.25％的bsa。

(2)利用6-羟基硫酸褪黑素的elisa检验方法制备标准曲线：

用pbs将实施例3中所制备的抗6-羟基硫酸褪黑素抗体稀释成1:10000的终浓度溶液，100μl/孔包被在96孔酶联板上，4℃放置12-24h；用pbs将上述包被有抗6-羟基硫酸褪黑素抗体的96孔酶联板洗涤3次后，加入200μl/孔的体积百分比0.5％的bsa溶液，4℃封闭放置8-16h。然后用pbs洗涤3次，加入20μl/孔的标准品。再加入100μl/孔工作浓度的hrp-6-羟基硫酸褪黑素偶联物；室温下孵育30min后pbs洗板5次；然后每孔加入100μltmb底物，室温孵育30min。再每孔加入100μl终止液(2m硫酸)。测定450nm的吸光值。根据各标准品所对应的450nm的吸光值定标，制作标准曲线，结果如图1所示。

2、待测样品中6-羟基硫酸褪黑素含量的检测：

(1)制作待测样品：

制备方法：将6-羟基硫酸褪黑素粉末(购于sigma公司)溶解于甲醇溶液制成1mg/ml的储存液，并将此储存液稀释于空白尿液中，至终浓度分别为0.00ng/ml、30.00ng/ml、120.00ng/ml，分别形成空白、低值、高值浓度的尿液样本。空白尿液为不含6-羟基硫酸褪黑素的健康人尿液。

(2)测试方法：

利用上述6-羟基硫酸褪黑素的elisa检验方法，将上述空白、低值、高值浓度的尿液样本代替标准品，测试上述空白、低值、高值浓度的尿液样本在450nm的吸光值。

(3)测试结果：

对照图1中所示的6-羟基硫酸褪黑素的elisa检验的标准曲线，计算每个样本中6-羟基硫酸褪黑素含量，并对每个样本进行3个复孔测定，根据上述样本中6-羟基硫酸褪黑素的实际含量计算回收率，结果如表1所示。

表1：6-羟基硫酸褪黑素的elisa检测结果

由表1中结果可知：采用本发明提供的6-羟基硫酸褪黑素的elisa检测试剂测定不同浓度样品中的6-羟基硫酸褪黑素回收率都较高，均在99％-101％之间，说明本发明所述的抗6-羟基硫酸褪黑素特异性抗体可以用于样本中6-羟基硫酸褪黑素的检测，并且结果准确度高。

实施例5：34种常见激素及激素代谢物干扰试验

选取34种常见激素及激素代谢物进行干扰检测，调整浓度至1mg/l，采用实施例4的elisa检验方法对相应干扰物质的浓度进行测定，34种常见激素及激素代谢物名称以及测定结果详见表2。

表2：常见干扰物名称及测定结果

测定结果显示：上述34种常见激素及激素代谢物等价于6-羟基硫酸褪黑素的浓度均为0.00ng/ml。由此可见，本发明的抗体是抗6-羟基硫酸褪黑素的特异性抗体，与常见干扰物无交叉反应。

实施例6：6-羟基硫酸褪黑素均相酶免疫检测试剂的制备

6-羟基硫酸褪黑素均相酶免疫检测试剂的制备方法，具体步骤如下：

(1)将0.25％牛血清白蛋白、50mmol/l葡萄糖-6-磷酸及50mmol/l氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依次加入50mmol/ltris缓冲液中搅拌溶解制成r1缓冲液，再将抗6-羟基硫酸褪黑素特异性抗体1以1∶1500的体积比加入到上述r1缓冲液中混匀，再用6mol/l的盐酸调节ph至8.0，制成r1试剂；

(2)将0.25％牛血清白蛋白加入100mmol/ltris缓冲液中搅拌溶解制成r2缓冲液，再将6-羟基硫酸褪黑素重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物以1∶3000的体积比加入到上述r2缓冲液中混匀，再用6mol/l的盐酸调节ph至7.6，制成r2试剂。

所述的6-羟基硫酸褪黑素重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物的制备方法，包含以下步骤：

(1)称取15mg活力单位为100ku的重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(其氨基酸序列为seqidno：2)，在室温条件下溶解于30ml磷酸钠(ph＝8.0)缓冲液中，然后加入225mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、135mg葡萄糖-6-磷酸以及0.75ml卡必醇，再逐滴加入2ml二甲基亚砜，得到重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；

(2)在无水状态下称取10mg实施例1合成的6-羟基硫酸褪黑素衍生物，溶解于600μl二甲基甲酰胺中，将上述溶液温度降到-2～-8℃后加入3μl三丁胺、1.5μl氯甲酸异丁酯、1.5μln，n′-二环己基碳二亚胺，-2～-8℃下搅拌30分钟，得到6-羟基硫酸褪黑素衍生物激活液；

(3)将6-羟基硫酸褪黑素衍生物激活液逐滴加入到重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，2-8℃搅拌反应12小时，反应结束后经g-25凝胶层析柱纯化得到6-羟基硫酸褪黑素重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物，结构式如式iii所示：

实施例7：6-羟基硫酸褪黑素校准品、质控品的制备

(1)校准品制备：将6-羟基硫酸褪黑素纯品粉末分别加入6份浓度为50mmol/lph＝7.2的tris-hcl缓冲液中，搅拌溶解，至终浓度分别为0.00ng/ml、10.00ng/ml、20.00ng/ml、40.00ng/ml、80.00ng/ml、160.00ng/ml，然后在每份溶液中分别加入质量分数为0.5％的氯化钠、1.0％的牛血清白蛋白、0.75％的乙二胺四乙酸、0.05％的叠氮钠，搅拌均匀，即为6-羟基硫酸褪黑素校准品(6个浓度)。

(2)质控品制备：将6-羟基硫酸褪黑素纯品粉末分别加入3份浓度为50mmol/lph＝7.2的tris-hcl缓冲液中，搅拌溶解，至终浓度分别为0.00ng/ml、30.00ng/ml、120.00ng/ml，然后在每份溶液中分别加入质量分数为0.5％的氯化钠、1.0％的牛血清白蛋白、0.75％的乙二胺四乙酸、0.05％的叠氮钠，搅拌均匀，即为6-羟基硫酸褪黑素质控品(3个浓度)。

实施例8：6-羟基硫酸褪黑素均相酶免疫检测试剂校准曲线制作及质控实验

1、制作均相酶免疫检测校准曲线：

在迈瑞bs480全自动生化分析仪中放入r1试剂、r2试剂及校准品，然后对生化分析仪进行反应参数设置，具体参数详见表3；实际操作过程中需不断调整r1试剂和r2试剂的体积比例，同时调整测光点，最后由生化分析仪自动得出均相酶免疫检测校准曲线，如图2所示。

表3：迈瑞bs480全自动生化分析仪反应参数

2、质控实验：

利用上述的6-羟基硫酸褪黑素均相酶免疫检测方法，对质控品进行测定，并根据步骤1中制作的均相酶免疫检测校准曲线，计算每个质控品中6-羟基硫酸褪黑素的含量，每个质控品重复测定10次，检测结果及数据分析详见表4。

表4：6-羟基硫酸褪黑素均相酶免疫检验试剂检测结果及数据分析

实验结果表明：测定不同浓度质控品中6-羟基硫酸褪黑素含量的cv值均低于3％，回收率均在98％-102％之间，说明本发明的6-羟基硫酸褪黑素均相酶免疫检测试剂测定生物样本中6-羟基硫酸褪黑素含量的精密度较高，结果准确。

实施例9：6-羟基硫酸褪黑素胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备

6-羟基硫酸褪黑素胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法，包含以下步骤：

(1)将0.5mg/ml的抗6-羟基硫酸褪黑素特异性抗体溶解于50mmol/lph＝8.0的磷酸盐缓冲液中，然后添加质量分数为1.25％的牛血清白蛋白、0.75％的氯化钠、0.25％的吐温-20、2.75％的丙三醇、0.5％的乙二胺四乙酸、1.25％的peg-4000以及0.03％的叠氮钠，搅拌均匀，调节ph＝7.5，制成l1试剂；

(2)将0.5mg表面带有羧基的直径为150nm的聚苯乙烯胶乳颗粒加入4.5ml0.05mol/lph＝6.2的mes缓冲液中，然后加入5mg碳二亚胺，在37℃下反应1小时，制成胶乳颗粒溶液，再将0.5mg6-羟基硫酸褪黑素-牛血清白蛋白复合体用4.5ml0.05mol/lph＝9.2的硼酸盐缓冲液稀释后，立即加入到上述胶乳颗粒溶液中，在37℃下反应12小时，然后加入1ml0.1mol/lph＝8.5的甘氨酸缓冲液搅拌2小时，反应终止后离心去除上清液，再将沉淀物用10ml50mmol/lph＝8.0的tris-hcl缓冲液洗涤3次，再用25ml50mmol/lph＝8.5的甘氨酸缓冲液稀释成胶乳悬浊液，最后加入质量分数为1.25％的牛血清白蛋白、0.55％的氯化钠、0.25％的吐温-20、3.0％的丙三醇、0.45％的乙二胺四乙酸以及0.03％的叠氮钠，搅拌均匀，制成l2试剂；

所述的6-羟基硫酸褪黑素-牛血清白蛋白复合体的制备方法，包含以下步骤：

将10mg牛血清白蛋白用5ml0.1mol/lph＝7.8的磷酸盐缓冲液稀释，然后加入100mg上述的6-羟基硫酸褪黑素衍生物，再加入50mg的n-羟基琥珀酰亚胺，在4℃下反应12小时，再用0.1mol/lph＝7.8的磷酸盐缓冲液在4℃下透析18小时，得到6-羟基硫酸褪黑素-牛血清白蛋白复合体，结构式如式iv所示：

实施例10：6-羟基硫酸褪黑素胶乳增强免疫比浊检测试剂校准曲线制作及质控实验

1.、制作胶乳增强免疫比浊检测试剂校准曲线：

在奥林巴斯au480全自动生化分析仪中放入l1试剂、l2试剂及校准品，然后对生化分析仪进行反应参数设置，具体参数详见表5；实际操作过程中需不断调整l1试剂和l2试剂的体积比例，同时调整测光点，最后由生化分析仪自动得出胶乳增强免疫比浊检测校准曲线，如图3所示。

表5：奥林巴斯au480全自动生化分析仪反应参数

2、质控实验：

利用上述的胶乳增强免疫比浊检测方法，对质控品进行测定，并根据步骤1中制作的胶乳增强免疫比浊检测校准曲线，计算每个质控品中6-羟基硫酸褪黑素的含量，每个质控品重复测定10次，检测结果及数据分析详见表6。

表6：6-羟基硫酸褪黑素胶乳增强免疫比浊试剂检测结果及数据分析

实验结果表明：测定不同浓度质控品中6-羟基硫酸褪黑素含量的cv值均低于3％，回收率均在98％-102％之间，说明本发明的6-羟基硫酸褪黑素胶乳增强免疫比浊检测试剂测定生物样本中6-羟基硫酸褪黑素含量的精密度较高，结果准确。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思做出其它各种相应的变更以及修改，而所有的这些变更以及修改都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110>湖南苏阳医疗科技有限公司

<120>6-羟基硫酸褪黑素衍生物及其免疫原、特异性抗体的制备方法和应用

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