一种红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料及其制备方法和应用与流程

本发明涉及材料领域，具体涉及一种红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料及其制备方法和应用。

背景技术：

随着再生医学的发展，细胞疗法在心肌梗死、心力衰竭、糖尿病等重大疾病的治疗中表现出巨大的潜力。脂肪间充质干细胞(rascs)因其来源广泛、易获取、免疫原性低、心肌分化率高等优点，被广泛用于基础和临床研究中治疗细胞损伤相关疾病。但是细胞和组织坏死后，抗氧化/氧化动态平衡失调形成氧化应激微环境，导致移植的干细胞存活率及滞留率降低从而影响干细胞的修复效果，提高疾病后移植干细胞的存活能够显著促进心脏的修复效果。

新型壳聚糖温敏水凝胶由壳聚糖、β-甘油磷酸钠通过氢键和疏水相互作用形成的天然高分子材料。因其具有良好的生物组织相容性和降解性以及低温时呈现溶胶状态，而在人体温度时迅速转变为凝胶状态，并且已有研究发现其能抗菌、止血、调节免疫力，促进伤口愈合等作用，故广泛用于生物组织工程和药物释放领域研究。

红景天，景天科红景天属(rhodiola)植物红景天的干燥根和根茎，为青藏高原特色名贵中药材，因其可明显增强机体对一系列化学、生物学以及身体应激源的抵抗力而被研究人员归为“适应原”性药物。红景天苷(salidroside，sal)为其有效活性成份之一，大量研究证实，红景天苷具有抗低氧、抗疲劳、抗辐射、抗衰老、保肝等作用。上世纪70年代以来，人们陆续发现红景天苷在抗炎抗氧化、免疫调节、抑制肿瘤、清除自由基和抗菌抗病毒等方面有独特疗效，部分中成药或保健品已进入临床试验。而在心血管领域，红景天苷还具有显著的促进一氧化氮合成、减少前列素积累、抑制线粒体通透性转换孔开放等功能，以及增强心肺系统的耐低氧能力。但至今其在干细胞药理和疗法等方面研究还较少。

中国专利cn101225374b提供了红景天及红景天苷在诱导干细胞定向分化为肝系细胞中的应用，尤其是红景天苷与细胞生长因子fgf-4组合作为诱导剂用于诱导骨髓间充质干细胞定向分化为肝系细胞，但局限于骨髓间充质干细胞，且是对干细胞定向分化肝细胞的作用，而对细胞增殖、迁移和活性的保护作用缺乏；cn103436555b公开了携带mir-122的小鼠脂肪来源的间充质干细胞的构建方法，和携带mir-122的成人脂肪来源的间充质干细胞的构建方法，但转基因干细胞株的过程比较复杂、周期较长，且临床应用还比较困难；cn104845933a公开了一种增强脂肪间充质干细胞免疫调节功能和迁移能力的方法，但使用tlr3激活剂poly(i:c)主要限制于免疫调节功能，且效果有限。

技术实现要素：

基于现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料。

为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料，包括以下的原料：红景天苷、壳聚糖、β-甘油磷酸钠、ph调节剂及水；所述红景天苷在所述原料中的浓度为1～400μm/l。

本发明所提供的红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料含有特定浓度的红景天苷，对生物细胞具有抗氧化、抗疲劳、抗衰老及提高生命及增殖活性的功效；通过引入壳聚糖以及β-甘油磷酸钠，由于两种物质通过氢键和疏水作用形成的高分子材料，其在常温及人体温度时可保持为稳定的凝胶状态，以所述高分子凝胶作为载体，所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料具有良好的红景天苷包覆性及使用释放性。

优选地，所述红景天苷在所述原料中的浓度为50～200μm/l。红景天苷的浓度过低其作用效果不足，但其浓度过高则会对细胞产生一定的毒性。通过适当浓度红景天苷的负载，所述红景天苷的壳聚糖水凝胶复合材料可有效保护细胞活性、增殖以及氧化损伤。

优选地，所述原料中壳聚糖与β-甘油磷酸钠的质量比为1～1.4:10～12。通过所述比例的限定，两者按照上述比例可以使生成的壳聚糖水凝胶材料保持稳定性质。

本发明的另一目的在于提供所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料的制备方法。

本发明所述的红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)将壳聚糖溶于醋酸溶液中并混合均匀后，加热加压灭菌，得溶液a；

(2)将β-甘油磷酸钠溶于水中，震荡并加热保温25～35min后，过滤除菌，得溶液b；

(3)将溶液a和溶液b混合并冰浴搅拌1.5～2.5h并滴加ph调节剂保持混合液ph为7～7.2后，加入红景天苷混合均匀，即得所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料。

本发明提供的红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料的制备方法操作简单，实验条件及仪器要求低，原料成本低廉，可大规模工业化生产。

优选地，步骤(1)所述醋酸溶液的摩尔浓度为0.05～0.15mol/l，所述溶液a中壳聚糖的质量浓度为2～2.5％。当壳聚糖浓度过大会影响红景天苷在复合材料中的药效，而浓度过低则会导致在添加红景天苷后无法凝聚成凝胶。

优选地，步骤(2)所述β-甘油磷酸钠溶于ddh2o中，所述加热的温度为80～90℃，所述溶液b中β-甘油磷酸钠的质量浓度为54～58％。当β-甘油磷酸钠的质量浓度在所述范围内可保证凝胶的流体状态。

本发明的再一目的在于提供所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料在细胞培养及药物制剂制备上的应用。

优选地，所述药物制剂包括促进细胞增殖和/或迁移药物制剂。

优选地，所述药物制剂抑制细胞氧化损伤药物制剂。

优选地，所述细胞为脂肪间充质干细胞。

本发明所述的红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料中红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料协同通过抗氧化、抗凋亡和抗炎机制保护细胞；所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料性质稳定，可广泛用于各类药剂的制备中。

优选地，所述药物制剂包括注射制剂、冻干粉针剂、乳剂、胶囊制剂、颗粒剂、散剂、片剂、丸剂、涂层、薄膜和敷料。

本发明的有益效果在于，本发明提供了一红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料含有特定浓度的红景天苷，对生物细胞具有抗氧化、抗疲劳、抗衰老及提高生命及增殖活性的功效；通过红景天苷和水凝胶载体的协同作用下，通过抗氧化、抗凋亡和抗炎机制保护细胞。本发明还提供了所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料的制备方法，该方法操作简单，实验条件及仪器要求低，原料成本低廉，可大规模工业化生产。本发明还提供了所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料在细胞培养及药物制剂制备上的应用。

附图说明

图1本发明所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料在4℃、室温条件以及37℃下的形态图，其中图1a为红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料在4℃下的形态图，图1b为红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料在室温条件以及37℃下的形态图；

图2为本发明实施例8所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料对细胞生长活性和增殖测试实验结果图；

图3为本发明实施例9所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料对细胞存活及生长形态实验测试中细胞的激光共聚焦显微镜拍摄图(原图为彩色)；

图4为本发明实施例9所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料对细胞存活及生长形态实验测试中细胞的激光共聚焦显微镜软件3d图像合成以及奥林巴斯软件数字化处理后的结果图，图4a和4b为接种未处理细胞图，图4c和4d为经过红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料培养实验处理后细胞图(原图为彩色)。

具体实施方式

若无特别说明，本发明实施例和对比例中所用原料均购自市场，所使用的制备仪器均为市购的普通型号。

为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明，其目的在于详细地理解本发明的内容，而不是对本发明的限制。

实施例1

本发明所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料的一种实施例，包括以下原料：红景天苷、壳聚糖、β-甘油磷酸钠、ph调节剂及水。

本实施例所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料的制备方法为：

(1)将286mg壳聚糖溶于0.1mol/l醋酸溶液中并混合均匀后，高温加热加压灭菌，配制得到2.2％的壳聚糖溶液a；

(2)将2680mg的β-甘油磷酸钠溶于3ml的ddh2o中，震荡10min后置于85℃水浴箱保温30min后，使用0.22μm滤孔过滤除菌，配制56％的得β-甘油磷酸钠溶液b；

(3)将溶液a和溶液b按质量比5.5:2的比例混合并冰浴搅拌2h并滴加4.54％的nahco3溶液保持混合液ph为7～7.2后，得壳聚糖水凝胶材料；

(4)将步骤(3)所得壳聚糖水凝胶材料加入红景天苷混合均匀，使红景天苷的浓度为100μm/l，即得所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料。

将实施例1所得红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料分别置于4℃、室温条件(约28℃)以及37℃(人体温度)的保温箱内观察其凝聚时间。所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料在4℃下保持液态，如图1a所示；在室温条件下保温30min后呈凝胶态，而在37℃条件下仅保温5min即完全呈现凝胶态，如图1b所示。说明本发明所制备的红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料具有良好的温敏性。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于，所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料中红景天苷的浓度为50μm/l。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于，所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料中红景天苷的浓度为200μm/l。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于，本实施例所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料的制备方法为：

(1)将286mg壳聚糖溶于0.15mol/l醋酸溶液中并混合均匀后，高温加热加压灭菌，配制得到2.0％的壳聚糖溶液a；

(2)将2680mg的β-甘油磷酸钠溶于3ml的ddh2o中，震荡10min后置于85℃水浴箱保温30min后，使用0.22μm滤孔过滤除菌，配制58％的得β-甘油磷酸钠溶液b；

(3)将溶液a和溶液b按质量比5.5:2的比例混合并冰浴搅拌2h并滴加4.54％的nahco3溶液保持混合液ph为7～7.2后，得壳聚糖水凝胶材料；

(4)将步骤(3)所得壳聚糖水凝胶材料加入红景天苷混合均匀，使红景天苷的浓度为100μm/l，即得所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于，本实施例所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料的制备方法为：

(1)将286mg壳聚糖溶于0.05mol/l醋酸溶液中并混合均匀后，高温加热加压灭菌，配制得到2.5％的壳聚糖溶液a；

(2)将2680mg的β-甘油磷酸钠溶于3ml的ddh2o中，震荡10min后置于85℃水浴箱保温30min后，使用0.22μm滤孔过滤除菌，配制54％的得β-甘油磷酸钠溶液b；

(3)将溶液a和溶液b按质量比5.5:2的比例混合并冰浴搅拌2h并滴加4.54％的nahco3溶液保持混合液ph为7～7.2后，得壳聚糖水凝胶材料；

(4)将步骤(3)所得壳聚糖水凝胶材料加入红景天苷混合均匀，使红景天苷的浓度为100μm/l，即得所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料。

实施例6

本实施例与实施例1的区别在于，所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料中红景天苷的浓度为20μm/l。

实施例7

本实施例与实施例1的区别在于，所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料中红景天苷的浓度为300μm/l。

实施例8

为验证本发明所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料对细胞生长活性和增殖的影响，将实施例1～3所得红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料分别置于共聚焦皿后转移至37℃培养箱保温10min后，负载rascs细胞(苏州赛业生物科技有限公司产品)并接种至96孔板，每孔接种量为50μl，分别标记为sal100μmol/l、sal50μmol/l和sal200μmol/l，在37℃下培养至细胞融合70～80％时使用500μmh2o2溶液分别处理0、1、3和7天，然后加入cck-8混合液(细胞培养液：cck-8溶液的体积比为1:9)，继续避光孵育4h，使用酶标仪测定各组在450nm处的吸光度od值，确定各组细胞活性。所述试验中设置对照组合空白组，分别标记为control组和h2o2组，所述对照组的实验条件为：不进行任何处理；所述空白组的实验条件为：仅进行h2o2处理。实验结果如图2所示。

如图2所示，刚接种的各组中的细胞活力无明显差异，而1天之后实施例1～3中的细胞活力增加，各细胞与红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料的相容性增加。当实验处理至第3天时，与control组相比，h2o2组细胞活力显著降低(***p<0.001)，sal100umol/l组活力增加(*p<0.05)，另外两组实施例对应组中的细胞活性无统计学差异。当实验处理培养至第7天时，与control组相比，h2o2组中细胞活力进步一步降低(***p<0.001)，sal50μmol/l组中开始活力降低(*p<0.05)，sal100μmol/l组中细胞活力明显增加(*p<0.05)，sal200μmol/l组中细胞活性无差异。实验结果表明h2o2处理制作氧化应激模型成功，且本发明所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料可增加rascs细胞对抗h2o2氧化应激能力，对细胞生长及增殖具有有益效果。

实施例9

为验证本发明所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料在细胞培养时对细胞存活及生长形态的有益效果，将二甲基亚砜稀释细胞染色剂cm-dildye并配制成浓度为1mg/ml的储存液，然后用无血清的培养基稀释cm-dildye储存液，配置成浓度为1μmol/l的染色工作液。取rascs细胞沉淀，用制备得到的染色工作液重悬，在37℃下孵育5min后，再在4℃孵育下15min后，使用pbs缓冲液清洗2次。将标记后的细胞按实施例8接种及培养出来方法进行细胞处理，同样将实施例1～3实验组分别标记sal100μmol/l、sal50μmol/l和sal200μmol/l组以及设置对照组和空白组，并标记control组和h2o2组，通过激光共聚焦显微镜拍摄第0、1、3和7天的各组细胞并统计细胞数量。结果如图3所示。

如图3所示，与control组相比，h2o2组在细胞数量第0、1天明显差异，但在第3、7天显著降低(***p<0.001，***p<0.001)；sal50μmol/l组中的细胞数量也在第3、7天细胞数降低(*p<0.05；**p<0.01)；sal200μmol/l组中的细胞数量第0、1、3天均无明显差异，第7天明显下降(*p<0.05)；sal100μmol/l组细胞数随时间无显著差异，说明所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料用于培养时可增加使用h2o2处理下rascs细胞的存活性，所述红景天苷-壳聚糖水凝胶复合材料在细胞培养时对细胞的存活性具有有益效果。

利用激光共聚焦显微镜软件3d图像合成以及奥林巴斯软件数字化处理观察sal100μmol/l组(即实施例1组)培养的rascs细胞3d生长形态。新鲜接种细胞呈散在圆形或椭圆形，膜光滑完整(见图4a和b)。随着时间培养，rascs细胞逐渐伸展，体积增大且出现分枝和细胞集落现象(见图4c和d)。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

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