一种温敏型大孔生物水凝胶及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医用材料技术领域，更具体地，涉及一种温敏型大孔生物水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

水凝胶是一种由亲水性聚合物链组成并通过物理交联或化学交联而形成的高分子材料。水凝胶中形成三维网状结构的聚合物起到骨架的作用，通过表面张力作用将大量的水锁在水凝胶当中。水凝胶所形成的网状结构能够维持聚合物分子链本身的亲水性，并且由于交联的作用，凝胶网络能够在水中保持形态不溶解(何畅，当代化工，2020，49(1)，249-252)。随着研究的深入，发现水凝胶具有可调节的物理和化学性能、可功能化、具有与细胞外基质类似的结构等特点，因此水凝胶的应用领域得以扩大，尤其在生物医用领域中，具有较大的孔径(可达到200μm)的大孔水凝胶在生物医学的组织工程领域显示出独特优势。

温敏水凝胶在受到外界温度变化的影响时，能够发生从溶液相转变为凝胶相的现象，引起该相态变化的温度称为临界相转变温度(或凝胶化温度)(战甜甜等，山东化工，2016，45(18)，52-54)。温敏水凝胶作为一种在生物医学领域具有较好应用前景的智能水凝胶，有希望应用于药物控释、分离萃取、酶的固定、免疫分析等。

温敏性大孔水凝胶结合了温敏水凝胶与大孔水凝胶两者的特点，较大的孔洞能够为细胞负载提供可能，为细胞提供培养空间；而体温敏感的特性能够使溶液状态的水凝胶基质通过注射方法进入体内，在体温状态下形成水凝胶。由于上述的特点，体温敏感大孔水凝胶将在生物医药领域发挥重要的作用。

目前制备大孔水凝胶的方法主要包括发泡法、致孔法等(丛巍巍等，材料导报a，2013，27(1)，90-93；杨桔等，功能材料，2011，42(2)，343-346)，然而，这些方法由于存在较多缺陷而难以在生物医药领域得到应用，如泡剂法因残留的表面活性剂难以除尽而降低大孔水凝胶的生物安全性，如中国专利cn104645946a(公开日2015.5.27)公开了一种以大孔聚n-异丙基丙烯酰胺-壳聚糖半互穿网络温敏水凝胶，利用乳液聚合的方法，以司班-80为表面活性剂，n,n′-亚甲基双丙烯酰胺(mba)为交联剂，过硫酸铵(aps)为引发剂制得温敏水凝胶，其中表面活性剂的残留会带来安全性问题，所以，如何制备具有较高生物安全性的温敏型大孔水凝胶仍有待探索。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有的温敏型大孔水凝胶生物安全性较低的缺陷和不足，提供一种温敏型大孔生物水凝胶的制备方法，所制得的温敏型大孔生物水凝胶生物安全性高，孔径可达200μm。

本发明的又一目的是提供一种温敏型大孔生物水凝胶。

本发明的另一目的是提供一种温敏型大孔生物水凝胶的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种温敏型大孔生物水凝胶的制备方法，将甲基纤维素、胶原蛋白溶于溶剂中得到甲基纤维素-胶原蛋白混合液，通入空气，通入空气的速度为0.1～10l/min，在20～40℃制得温敏型大孔生物水凝胶，其中，甲基纤维素在混合液中的质量百分浓度为8％～15％，胶原蛋白在混合液中的质量百分浓度为0.2％～0.7％。

甲基纤维素(methylcellulose，mc)作为一种水溶性甲基纤维素类生物大分子，安全无毒，且具有温敏性；胶原蛋白是一种细胞外的蛋白质，是结缔组织的主要成分，来自于生物体内，能够自然降解，对人体无毒；将胶原蛋白与甲基纤维素共混可制得温敏型水凝胶，且当温度低于凝胶化温度时，水分子通过氢键作用在甲基纤维素的甲基周围形成溶剂笼(水化层)，阻止甲基纤维素分子的聚集；当温度升高达到或超过凝胶化温度时，该氢键作用被减弱，笼状结构遭到破坏，甲基纤维素分子链上的甲基彼此间暴露发生疏水性结合，导致甲基纤维素分子间形成网络结构，形成凝胶。本发明还通过在甲基纤维素-胶原蛋白混合液中通入气体，由于粘性的影响，气体会存留在溶液中，再置于适宜的温度下形成大孔水凝胶。本发明遵循生物安全性原则，利用空气制孔，未使用化学致孔剂和表明活性剂，也不会有化学致孔剂和表明活性剂残留的问题。因此，本发明的温敏型大孔生物水凝胶不仅具有大孔径结构(可达200μm)、温敏性良好，而且安全无毒，具有很好的生物安全性，可以广泛应用于生物医药领域。

优选地，所述通入空气的速度为1.2～1.5l/min。

优选地，所述通入空气的方法为利用气泵装置泵入空气。

优选地，所述气泵装置为充气泵。

优选地，所述气泵装置还包括气泵石。

优选地，所述气泵石的直径为2～5cm。

优选地，所述甲基纤维素的分子量为10000～180000，甲基取代度为2.6～5.0。

优选地，所述胶原蛋白为i型胶原蛋白-牛跟腱、ii型胶原蛋白-牛软骨、ii型胶原蛋白-牛鼻膜、ii型胶原蛋白-鸡中的一种或几种。

优选地，将甲基纤维素溶于溶剂中，于30～60℃加热溶解，降至室温，得到甲基纤维素溶液；再将胶原蛋白，加入到甲基纤维素溶液中于5～40℃下混合均匀，0.5～10小时后，在2～10℃冷藏1～25小时，得到甲基纤维素-胶原蛋白混合液。在溶解甲基纤维素的过程中，需要先将水温调整为30～60℃，有利于其溶解。并且由于甲基纤维素(mc)使用量远大于胶原蛋白，将胶原蛋白加入到甲基纤维素溶液中能够更好的溶解、共混。

优选地，先将甲基纤维素-胶原蛋白混合液冷冻干燥，得到甲基纤维素-胶原蛋白固体；将甲基纤维素-胶原蛋白固体溶解后再通入空气。先将甲基纤维素-胶原蛋白混合液冻干，得到固体，再溶解，是因为在冻干之前，mc溶液的浓度较低，可以使mc与胶原蛋白更好地共混，但是不利于成胶，冻干过后的材料再溶解，可以更容易成胶。

优选地，将甲基纤维素-胶原蛋白固体溶解的步骤为先加入溶剂，在15～50℃下分散，再将其置于冰水浴中溶解4～8小时，置于4～6℃冷藏6～24小时，所得溶液的质量浓度为5％～10％。

优选地，通入空气1～10分钟后，将溶液置于20～40℃水浴中，形成甲基纤维素-胶原蛋白温敏性大孔水凝胶。

优选地，所述溶剂为去离子水、超纯水、生理盐水中的一种。

本发明还保护上述温敏型大孔生物水凝胶在制备组织给药、干细胞治疗和注射治疗制剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明利用生物安全性较好且具有温敏性的甲基纤维素，和胶原蛋白共同制备温敏型大孔生物水凝胶，并且通入空气从而形成大孔结构，本发明采用的原料安全无毒，未使用表面活性剂或致孔剂，因此，本发明制得的水凝胶不仅具有大孔径结构(可达200μm)、良好的温度敏感性，还具有很好的生物安全性，可广泛应用于生物医药领域。

附图说明

图1为本发明实施例1制备温敏型大孔生物水凝胶的工艺流程图。

图2为实施例1所制备的温敏型大孔生物水凝胶的照片。

图3为实施例1所制备的温敏型大孔生物水凝胶冷冻干燥后的扫描电镜照片。

图4为实施例1所制备的温敏型大孔生物水凝胶的动态应力-应变扫描曲线(37℃)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。

图1为本发明实施例1的制备流程：将一定质量比的甲基纤维素和胶原蛋白溶解共混后冻干，得到甲基纤维素-胶原蛋白固体，再按一定浓度溶解该固体得到甲基纤维素-胶原蛋白溶液，利用连接气泵的气泵石往该溶液中鼓气，并置于一定温度下形成温敏型大孔生物水凝胶。

实施例1

一种温敏型大孔生物水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

s1.称取1.5克甲基纤维素(分子量10000，取代度2.6)，置于烧杯中，加入100毫升去离子水，于60℃下搅拌(转速900转/分钟)至完全溶解，降至室温，得到甲基纤维素溶液；

s2.称取0.1克i型胶原蛋白-牛跟腱(小分子)，加入到步骤s1所得甲基纤维素溶液中，在40℃下搅拌(900转/分钟)溶解10小时后，在2℃下冷藏稳定25小时，得到甲基纤维素-胶原蛋白共混体系i；

s3.将步骤s2所得共混体系i冷冻干燥，得到甲基纤维素-胶原蛋白共混材料ii；

s4.称取1.5克步骤s3中所得的共混材料ii，置于烧杯中，加入15毫升去离子水，在50℃下搅拌(转速900转/分钟)分散，再置于冰水浴中搅拌(900转/分钟)溶解8小时后，在4℃下冷藏稳定24小时，得到甲基纤维素-胶原蛋白溶液；

s5.将连接气泵装置的气泵石(直径为2cm)置于步骤s4所得的溶液中，泵入空气，泵气速度为10l/min，1分钟后，将溶液置于40℃水浴中，制得甲基纤维素-胶原蛋白温敏型大孔生物水凝胶。

实施例2

一种温敏型大孔生物水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

s1.称取0.5克甲基纤维素(分子量180000，取代度5.0)，置于烧杯中，加入10毫升去离子水，于30℃下搅拌(转速100转/分钟)至完全溶解，降至室温，得到甲基纤维素溶液；

s2.称取0.01克i型胶原蛋白-牛跟腱(大分子)，加入到步骤s1所得甲基纤维素溶液中，在40℃下搅拌(100转/分钟)溶解0.5小时后，在2℃下冷藏稳定1小时，得到甲基纤维素-胶原蛋白共混体系i；

s3.将步骤s2所得共混体系i冷冻干燥，得到甲基纤维素-胶原蛋白共混材料ii；

s4.取0.5克步骤s3中所得的共混材料ii，置于烧杯中，加入5毫升去离子水，在15℃下搅拌(转速100转/分钟)分散，再置于冰水浴中搅拌(100转/分钟)溶解4小时后，在4℃下冷藏稳定6小时，得到甲基纤维素-胶原蛋白溶液；

s5.将连接气泵装置的气泵石(直径为2cm)置于步骤s4所得的溶液中，泵入空气，泵气速度为10l/min，1分钟后，将溶液置于35℃水浴中，制得甲基纤维素-胶原蛋白温敏型大孔生物水凝胶。

实施例3

一种温敏型大孔生物水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

s1.称取1.5克甲基纤维素(分子量10000，取代度5.0)，置于烧杯中，加入100毫升超纯水，于60℃下搅拌(转速900转/分钟)至完全溶解，降至室温，得到甲基纤维素溶液；

s2.称取0.1克ii型胶原蛋白-牛软骨，加入到步骤s1所得甲基纤维素溶液中，在5℃下搅拌(900转/分钟)溶解10小时后，在2℃下冷藏稳定1小时，得到甲基纤维素-胶原蛋白共混体系i；

s3.将步骤s2所得共混体系i冷冻干燥，得到甲基纤维素-胶原蛋白共混材料ii；

s4.称取1.0克步骤s3中所得的共混材料ii，置于烧杯中，加入10毫升超纯水，在50℃下搅拌(转速900转/分钟)分散，再置于冰水浴中搅拌(900转/分钟)溶解8小时后，在6℃下冷藏稳定6小时，得到甲基纤维素-胶原蛋白溶液；

s5.将连接充气泵的气泵石(直径为5cm)置于步骤s4所得的溶液中，泵入空气，泵气速度为0.1l/min，10分钟后，将溶液置于40℃水浴中，制得甲基纤维素-胶原蛋白温敏型大孔生物水凝胶。

实施例4

一种温敏型大孔生物水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

s1.称取1.2克甲基纤维素(分子量180000，取代度2.6)，置于烧杯中，加入75毫升生理盐水，于50℃下搅拌(转速700转/分钟)至完全溶解，降至室温，得到甲基纤维素溶液；

s2.称取0.08克ii型胶原蛋白-牛鼻膜，加入到步骤s1所得甲基纤维素溶液中，在35℃下搅拌(700转/分钟)溶解6小时后，在5℃下冷藏稳定15小时，得到甲基纤维素-胶原蛋白共混体系i；

s3.将步骤s2所得共混体系i冷冻干燥，得到甲基纤维素-胶原蛋白共混材料ii；

s4.称取1.2克步骤s3中所得的共混材料ii，置于烧杯中，加入14毫升生理盐水，在42℃下搅拌(转速700转/分钟)分散，再置于冰水浴中搅拌(700转/分钟)溶解6小时后，在5℃下冷藏稳定18小时，得到甲基纤维素-胶原蛋白溶液；

s5.将连接充气泵的气泵石(直径为3cm)置于步骤s4所得的溶液中，泵入空气，泵气速度为1.5l/min，4分钟后，将溶液置于38℃水浴中，制得甲基纤维素-胶原蛋白温敏型大孔生物水凝胶。

实施例5

一种温敏型大孔生物水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

s1.称取0.8克甲基纤维素(分子量100000，取代度4.8)，置于烧杯中，加入90毫升生理盐水，于35℃下搅拌(转速500转/分钟)至完全溶解，降至室温，得到甲基纤维素溶液；

s2.称取0.04克ii型胶原蛋白-鸡，加入到步骤s1所得甲基纤维素溶液中，在38℃下搅拌(500转/分钟)溶解7小时后，在4℃下冷藏稳定25小时，得到甲基纤维素-胶原蛋白共混体系i；

s3.将步骤s2所得共混体系i冷冻干燥，得到甲基纤维素-胶原蛋白共混材料ii；

s4.称取0.8克步骤s3中所得的共混材料ii，置于烧杯中，加入8毫升生理盐水，在20℃下搅拌(转速500转/分钟)分散，再置于冰水浴中搅拌(500转/分钟)溶解7小时后，在5℃下冷藏稳定18小时，得到甲基纤维素-胶原蛋白溶液；

s5.将连接充气泵的气泵石(直径为4cm)置于步骤s4所得的溶液中，泵入空气，泵气速度为1.2l/min，3分钟后，将溶液置于39℃水浴中，制得甲基纤维素-胶原蛋白温敏型大孔生物水凝胶。

实施例6

本实施例的温敏型大孔生物水凝胶的制备方法与实施例1相同，区别在于，不包括步骤s3和s4，直接进行步骤s5，将连接气泵装置的气泵石置于甲基纤维素-胶原蛋白共混体系i中进行制备水凝胶的操作。

对比例1

本对比例的制备方法与实施例1区别在于，将利用气泵石制孔替换为利用乳化剂span-80制孔，在甲基纤维素-胶原蛋白共混体系i中添加span-80，搅拌均匀后静置24h，用水洗去span-80后制得凝胶。

对比例2

本对比例的制备方法与实施例1区别在于，将利用气泵石制孔替换为利用pva制孔剂制孔，在甲基纤维素-胶原蛋白共混体系i中添加span-80，搅拌均匀后静置24h，用水洗去pva后制得凝胶。

对比例3

本对比例的制备方法与实施例1相同，区别在于，将泵气速度替换为0.01l/min。

对比例4

本对比例的制备方法与实施例1相同，区别在于，将泵气速度替换为15l/min。

性能测试

由图2可知，在室温下为液体状态的甲基纤维素-胶原蛋白溶液，经过气泵石泵入空气后，并在37℃下放置1小时后倒置的情况，可观察到甲基纤维素-胶原蛋白溶液在接近体温的温度下已成为不流动的水凝胶，表明制备出温敏型大孔生物水凝胶。

由图3可以看到，温敏型大孔生物水凝胶经冷冻干燥后，水凝胶结构较为松散，且存在大量的孔洞结构，且孔径可达200μm，证实制备出的水凝胶具有大孔结构。

图4的结果显示，实施例1制得的温敏型大孔生物水凝胶在应变(strain)低于40％时，储能模量(g′)高于损耗模量(g″)，显示出水凝胶的特性。

另外，本发明制备水凝胶的过程中并未使用表面活性剂或致孔剂，因此制得的水凝胶安全无毒，长时间作用不会产生毒副作用，可以广泛应用于制备组织给药、干细胞治疗和注射治疗制剂等生物医药领域。但是对比例1和2中制孔的步骤都依赖表面活性剂或致孔剂，虽然制得凝胶后利用水洗去除，但是无法保证没有残留，限制了其在生物医药领域的应用。而对比例3通入空气的速度过小，无法形成大孔结构，对比例4中通入空气的速度过大，会将溶液吹起来，而且形成的气泡特别大容易爆破，同样无法形成大量均匀的大孔结构。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除