稀土荧光编码微球及其制备方法和荧光编码方法与流程

本发明涉及生物分子标记技术领域，具体是涉及稀土荧光编码微球及其制备方法和荧光编码方法。

背景技术：

当以直径在纳米、微米级之间的聚合物微球的表面或者内部负载了有机小分子染料或无机量子点，在受到了特定的外界能量刺激后就会发出特定波长的荧光，我们将此类微球称为荧光微球。通过调控微球负载的染料或量子点的种类、比例、浓度等，就可以得到不同波长或不同强度的荧光微球，构建出多种荧光编码微球。每种微球偶联特定的分子探针，通过与目标物质的特异性结合就可以实现生物分子标记检测。

相比于普通有机荧光染料和无机量子点，稀土材料具有荧光寿命长、发射光谱窄、stokes位移大等优势，更适用于制备荧光微球。微球负载的荧光物质为稀土配合物，此时的微球称之为稀土荧光微球。可以通过简单的调控负载的稀土配合物的量来进行荧光编码，得到多种稀土荧光编码微球。目前，制备稀土荧光编码微球多使用包埋法和共价键合法，但这两种方法制备出的稀土荧光微球容易发生粘连，单分散性不好，且荧光强度无法精确定量，不利于荧光编码。

另外，在中国专利公布第cn105295066a号中公开了一种通过溶胀法制备聚苯乙烯荧光微球的方法，其包括以下步骤：将ps微球液分散于溶胀介质中，将eu(dbm)3phen溶于溶胀剂中，然后混合在一起，进行溶胀反应；在适当温度下通过蒸发去除溶胀剂；在蒸发掉溶胀剂后对ps微球液先进行1～15min超声处理，再进行稀释；去除溶胀介质后，获得ps荧光微球沉淀物。该专利文献通过优化超声处理发生的时间，以及进一步优化溶胀剂类型及其用量、溶胀介质及其浓度、eu(dbm)3phen用量等工艺条件，形成微球溶胀与eu(dbm)3phen溶胀进微球的最佳条件，制备出荧光强度高、单分散性好、无变形的荧光微球。虽然该方法制备的荧光微球分散性提高，但仍然不能达到实际应用时的要求，并且由于稀土配合物的用量影响微球的制备，进而影响荧光编码。

技术实现要素：

针对现有技术中的至少部分技术问题，发明人深入研究后发现利用亲水基团改性疏水性微球，然后在溶胀剂中利用超声将稀土配合物直接包埋进改性微球中，而不受配合物用量的影响，从而能够进行有效地荧光编码，并且微球分散性更好。基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种稀土荧光编码微球的制备方法，其包括(1)利用亲水基团改性疏水性微球得到改性微球；和(2)将所述改性微球分散于醇溶液得到分散液，在超声条件下将所述分散液加入溶有稀土配合物的溶胀剂中进行反应，反应结束后加正己烷离心收缩得到粒径为0.1～10μm的稀土荧光编码微球。

根据本发明所述的稀土荧光编码微球的制备方法，优选地，其进一步包括通过超声将稀土荧光编码微球分散于水溶液的步骤。

根据本发明所述的稀土荧光编码微球的制备方法，优选地，所述稀土配合物为油溶性。

根据本发明所述的稀土荧光编码微球的制备方法，优选地，步骤(1)包括使苯乙烯和丙烯酰胺共聚反应得到聚合物，加热聚合物至40-60℃，向其中加入水合肼反应，然后加入丁二酸酐控制ph为3.5-4.5进一步反应，得到改性微球。

根据本发明所述的稀土荧光编码微球的制备方法，优选地，步骤(1)包括将pvp溶于无水乙醇，在惰性气体保护下加热至50～80℃，加入引发剂和苯乙烯反应得到聚合物颗粒，然后使聚合物颗粒、pa、二氯甲烷、硝基苯和氯化铝在45～55℃下反应，得到改性微球。

根据本发明所述的稀土荧光编码微球的制备方法，优选地，所述稀土配合剂选自eu(dbm)3phen、eu(bza)3phen、eu(btf)3phen和tb(acac)3phen中的至少一种。

根据本发明所述的稀土荧光编码微球的制备方法，优选地，所述溶胀剂选自二氯甲烷、氯仿、甲苯和二甲苯中的至少一种。

根据本发明所述的稀土荧光编码微球的制备方法，优选地，所述溶胀剂的用量为总溶液体积的5％～15％，优选6％～12％，更优选8％～10％。

本发明的第二方面，提供由第一方面的稀土荧光编码微球的制备方法得到的稀土荧光编码微球。

本发明的第三方面，提供一种荧光编码方法，其包括在第一方面的制备方法中调控纳米颗粒负载的稀土配合物的类型和负载量的步骤。

本发明通过表面改性微球和超声溶胀将疏水的稀土配合物包埋到微球的内部，构建粒径为0.1～10μm的稀土荧光编码微球。本发明的主要优点如下：采用该方法制备荧光编码微球简便快速，对设备要求低；相比传统的制备方法，具有单分散性好、荧光效率高、重现性好、可准确定量、损耗小等优势。

本发明可更广泛地运用到生物、化学、材料科学等领域，特别是在生物医学领域的荧光成像、荧光标记、荧光分析等方面具有有竞争力的前景。

附图说明

图1是实施例1制备的eu(dbm)3phen@ps在水中分散的透射电子显微镜结构形貌图。

图2是eu(dbm)3phen在乙腈溶液中的紫外吸收光谱图和荧光光谱图(ex：360nm)。其中，左侧曲线为uv-vis，右侧曲线为pl。

图3是实施例1制备的eu(dbm)3phen@ps在水中的荧光光谱图和紫外吸收光谱图(ex：360nm)。其中，左侧曲线为uv-vis，右侧曲线为pl。

图4是eu(dbm)3phen在不同ph下的归一化荧光光谱图。曲线分别对应了eu(dbm)3phen在ph分别为9.0、8.0、7.0、6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.8的br缓冲中的荧光光谱图。

图5是实施例1制备的eu(dbm)3phen@ps在不同ph下的归一化荧光光谱图。曲线分别对应了eu(dbm)3phen@ps在ph分别为12.0、11.0、10.0、9.0、8.0、7.0、6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.8的br缓冲中的荧光光谱图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。

本发明的稀土荧光微球的制备方法为一种基于微球表面改性和超声溶胀的方法，其包括(1)利用亲水基团改性疏水性微球得到改性微球；和(2)将所述改性微球分散于醇溶液得到分散液，在超声条件下将所述分散液加入溶有稀土配合物的溶胀剂中进行反应，反应结束后加正己烷离心收缩得到粒径为0.1～10μm的稀土荧光编码微球。本发明中稀土荧光编码微球的表面需具有亲水性基团。其中亲水基团的实例包括但不限于胺基、羧基等。只要具有此类基团，则对于微球成分不特别限定。

在某些实施方案中，本发明的步骤(1)包括在惰性气体中使苯乙烯与丙烯酰胺混合，然后加入过硫酸钾在搅拌下反应10-15小时。其中，苯乙烯与丙烯酰胺的用量比一般为200-300g丙烯酰胺/l苯乙烯，优选220-280g丙烯酰胺/l苯乙烯。过硫酸钾的加入量一般为20-30g，优选22-28g，更优选25-26g。在反应后还可进一步包括过滤步骤。例如使用脱脂棉过滤。可选地，进一步包括透析以获得所需分子量聚合物的步骤。例如用剪切分子量为8000-12000dalton的透析袋在超纯水中透析约3天，收集产物共聚物，由此得到纳米级微球。在得到纳米级微球后，在40-60℃下使微球与水合肼反应8小时以上。停止反应并冷却至室温，将产物用透析袋(剪切分子量：8000-12000dalton)在超纯水中透析约3天后收集产物。接下来，取收集产物，在磁力搅拌下加入丁二酸酐。在这个过程中，用naoh溶液等即时调节体系的ph，使其始终维持在4左右。加完丁二酸酐后继续搅拌反应2小时以上。产物同样用透析袋(剪切分子量：8000-12000dalton)在超纯水中透析约3天后收集。上述方法特别适合于制备100-500nm的纳米级稀土荧光编码微球。

在某些实施方案中，本发明的将两亲物质例如pvpk-30溶于极性溶剂例如无水乙醇，加入到装配有冷凝管、氮气导管和机械搅拌的三口烧瓶中。在搅拌下通惰性气体驱氧，水浴50-80℃，再缓慢加入溶有引发剂例如aibn的重蒸苯乙烯溶液，保持转速，恒温反应8h。将乳液样品离心分离，除去上层清液，并用乙醇和去离子水交替清洗多次，最后将聚合物微球分散于去离子水中保存。接下来进行接枝反应。例如，使用傅克酰基化反应，将微球、pa、二氯甲烷、硝基苯和氯化铝加入烧瓶中，50℃下搅拌反应8小时。然后，将反应物加入到烧结玻璃漏斗内，添加hcl猝灭反应。随后，依次使用去离子水、thf、去离子水清洗过滤，至5分钟内不再有水滴滴落表明清洗干净。上述方法特别适于制备600-2000nm的微球。

本发明的步骤(2)包括将改性微球例如聚苯乙烯微球分散在醇溶液中后直接加入处于超声中的溶有稀土配合物的溶胀剂中，通过超声溶胀将稀土配合物包埋在微球内部，反应完毕加正己烷离心收缩微球，用乙醇、水多次洗涤至上清无荧光，最后在水溶液中超声分散后保存。

在步骤(2)的超声溶胀过程中注意转动离心管使稀土更均匀地进入微球中，超声时间应长于15分钟，例如20-30分钟。超声使轻微粘连的微球分散开，过程中应注意转动离心管，时间应长于30min。

实施例

1.准备材料：

鼓泡器、球形冷凝管、250ml三口烧瓶、机械搅拌棒、翻口塞、不锈钢针

2.具体步骤：

方法一：

在250ml三口烧瓶中加入100ml超纯水，氮气气氛中70℃水浴条件下搅拌除氧。1h后，用注射器加入10ml通过减压蒸馏纯化过的苯乙烯。继续搅拌5min后，加入用10ml超纯水溶解的2.5g经过重结晶纯化过的丙烯酰胺。继续搅拌5min后，加入用10ml超纯水溶解的0.25g经过重结晶纯化过的过硫酸钾。保持搅拌速度在700rpm，并在氮气气氛中反应12h，反应产物用脱脂棉过滤并用剪切分子量为8000-12000dalton的透析袋在超纯水中透析约3天，收集产物苯乙烯-丙烯酰胺共聚物pst-aam，平均粒径300nm。

在100ml圆底烧瓶中加入80mlpst-aam，在磁力搅拌下，缓慢加热升温，最后温度稳定在50℃，加入24ml水合肼(80wt％)，反应8h以上。停止反应并冷却至室温，将产物用透析袋(剪切分子量：8000-12000dalton)在超纯水中透析约3天后收集产物。

取40ml上一步的产物于100ml烧杯中，在磁力搅拌下将0.8g碾碎后的丁二酸酐在10min内分多次加入其中。在这个过程中，用naoh溶液即时调节体系的ph，使其始终维持在4左右。加完丁二酸酐后继续搅拌反应2h以上。产物同样用透析袋(剪切分子量：8000-12000dalton)在超纯水中透析约3天后收集，即得纳米颗粒。

方法二：

将0.5gpvpk-30溶于70ml无水乙醇，加入到装配有冷凝管、氮气导管和机械搅拌的三口烧瓶中。在120rpm搅拌下通氮气驱氧15min，控制氮气流速，水浴70℃，再缓慢加入10ml溶有0.1gaibn的重蒸苯乙烯溶液，保持转速，恒温反应8h。将乳液样品离心分离，除去上层清液，并用乙醇和去离子水交替清洗多次，最后将聚合物微球分散于去离子水中保存。得到的微球在15000rpm下5min可以完全离心下来，平均直径为2μm。

使用傅克酰基化反应，将微球、pa、二氯甲烷、硝基苯和氯化铝加入烧瓶中，50℃下搅拌反应8小时。然后，将反应物加入到烧结玻璃漏斗内，添加hcl猝灭反应。随后，依次使用去离子水、thf、去离子水清洗过滤，至5分钟内不再有水滴滴落表明清洗干净。

实施例1

将10mg方法一制备的纳米颗粒离心去上清，乙醇洗一次，倒置沥干后，加入950μl正丁醇分散，得到分散液。称取5mgeu(dbm)3phen超声溶于50μl二氯甲烷中，向其中加入备好的分散液，在适宜位置保持超声45min，每隔2min转动离心管。超声结束后，加入过量正己烷，离心去上清，用乙醇、水多次洗涤至上清无荧光。在水中超声分散60min，5000rpm*1min离心收集上清保存。

实施例2

将10mg方法一制备的纳米颗粒离心去上清，乙醇洗一次，倒置沥干后，加入900μl正丁醇分散，得到分散液。称取5mgeu(dbm)3phen超声溶于100μl二氯甲烷中，向其中加入备好的分散液，在适宜位置保持超声45min，每隔2min转动离心管。超声结束后，加入过量正己烷，离心去上清，用乙醇、水多次洗涤至上清无荧光。在水中超声分散60min，5000rpm*1min离心收集上清保存。

实施例3

将10mg方法二制备的颗粒离心去上清，乙醇洗一次，倒置沥干后，加入900μl异丙醇分散。称取10mgeu(bza)3phen超声溶于100μl三氯甲烷中，向其中加入备好的分散液，在适宜位置保持超声45min，每隔2min转动离心管。超声结束后，加入过量正己烷，离心去上清，用乙醇、水多次洗涤至上清无荧光。在水中超声分散60min，500rpm*1min离心收集上清保存。

实施例4

将10mg方法一制备的纳米颗粒离心去上清，乙醇洗一次，倒置沥干后，加入900μl正己醇分散。称取2mgtb(acac)3phen超声溶于100μl甲苯中，向其中加入备好的分散液，在适宜位置保持超声45min，每隔2min转动离心管。超声结束后，加入过量正己烷，离心去上清，用乙醇、水多次洗涤至上清无荧光。在水中超声分散60min，5000rpm*1min离心收集上清保存。

实施例5

将10mg方法二制备的颗粒离心去上清，乙醇洗一次，倒置沥干后，加入900μl正己醇分散。称取5mgtb(acac)3phen超声溶于100μl甲苯中，向其中加入备好的分散液，在适宜位置保持超声45min，每隔2min转动离心管。超声结束后，加入过量正己烷，离心去上清，用乙醇、水多次洗涤至上清无荧光。在水中超声分散60min，5000rpm*1min离心收集上清保存。

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

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