一种牛肉胰酶消化液及其制备方法与流程

2021-02-02 18:02:42|

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本发明属于生物
技术领域：
，具体的，涉及一种牛肉胰酶消化液及其制备方法。
背景技术：
：白喉是由白喉杆菌所引起的一种急性呼吸道传染病，以发热、气憋、声音嘶哑、犬吠样咳嗽、咽、扁桃体及其周围组织出现白色伪膜为特征，严重者全身中毒症状明显，可并发心肌炎和周围神经麻痹。白喉杆菌是严格寄生于人类的细菌，没有中间宿主，病人及带病菌者是唯一的传染源，主要是呼吸道飞沫传播，也可以通过被污染的器具和食物传播。白喉疫苗系用白喉杆菌，在改良林氏培养基中培养产生的毒素，精制后经甲醛脱毒制成。疫苗最重要的组成成分就是白喉类毒素，是由白喉毒素在一定温度下加甲醛脱毒变成无毒而仍然保持有免疫性的生物制品，是预防白喉病最有效的制剂。培养白喉杆菌的改良林氏培养基是由氮源、碳源、无机盐、生长因子等组成，白喉杆菌生长所需的氨基酸主要来自其中的牛肉胰酶消化液(林氏消化液)。目前，制备林氏消化液使用的酶多用新鲜牛胰脏自制而成，用这种酶消化制作的基础培养基在培养产毒效果上不理想，同时，因为牛胰脏处理的方法不标准以及动物伦理等因素，也导致培养基的培养效果的批间差异较大。因此，有必要将其生产工艺改进的更为标准化。技术实现要素：本发明首先涉及一种牛肉胰酶消化液的制备方法，其包括如下步骤：(1)10份去脂去结缔组织的牛肉搅碎，加入15份的注射用水，加温至90℃；(2)再加入15份注射用水后，控制温度50～55℃，校正ph7.8～8.0；(3)每半小时加入一次胰蛋白酶，多次加入的蛋白酶总量为3u/每克牛肉，进行消化，消化过程保持ph在7.8～8.0，温度50～55℃，消化时间2～3小时；(4)消化结束后加入适量冰醋酸灭活胰酶，随后加热至沸腾；优选的，冰醋酸的量为0.04份(5)过滤溶液的残渣后即得所述的牛肉胰酶消化液。优选的，所述的胰蛋白酶的加入方式为：每半小时加入一次，前三次各加入两份，第四次加入1份；所述的ph校正为使用20％氢氧化钠溶液校正ph；所述的消化过程保持ph在7.8～8.0为：每10分钟使用20％氢氧化钠溶液校正ph；所述的过滤溶液为：使用滤布过滤溶液；本发明还涉及所述的方法制备获得的牛肉胰酶消化液。本发明还涉及使用所述的牛肉胰酶消化液制备的培养基。所述的培养基(每升)的成分为：含氮量(an)0.185％(wt)的牛肉胰酶消化液、10％酵母浸出液500毫升、乳酸(ch3chohcooh)25毫升、25％氯化钙溶液(cacl2)32毫升、磷酸氢二钠(na2hpo4)3.2克、白喉ⅰ号溶液40毫升、白喉ⅱ号溶液20毫升、余量为水。含氮量(an)0.185％(wt)的牛肉胰酶消化液指添加牛肉胰酶消化液至培养基中的含氮量为0.185％(wt)。本发明还涉及所述的牛肉胰酶消化液在培养白喉杆菌中的应用。本发明还涉及所述的牛肉胰酶消化液在制备白喉疫苗中的应用。本发明的有益效果在于，在制备改良牛肉胰酶消化液过程中，将传统的牛胰脏消化酶替换为标准胰蛋白酶，，制备工艺标准可控，制成培养基后，可获得更好及更稳定的细菌培养效果。附图说明图1、试201511001批次的牛肉胰酶消化液配置的培养基中白喉杆菌菌株的生长情况。图2、对照组培养基中白喉杆菌菌株的生长情况。具体实施方式材料与试剂新鲜牛肉购自李记牛羊公司胰蛋白酶购自上海瑞永生物科技有限公司氢氧化钠、为国产分析纯；实施例1：改良林氏消化液的制备方法(1)准备材料：生物材料有新鲜牛肉、胰蛋白酶；20％氢氧化钠溶液；实验器具：滤布、橡皮塞、量筒、灭菌大立瓶、配制罐；(2)制备改良林氏消化液：先把去脂和结缔组织的10000克牛肉，绞碎加入配制罐，再加15000毫升注射用水，加温至90℃，再将剩余的15000毫升注射用水加入，控制温度至50～55℃，用20％氢氧化钠溶液校正ph7.8～8.0。加入胰蛋白酶消化，将胰蛋白酶总量(30000活力单位)分成7等分，每半小时加一次，前三次每次加入2/7，后一次加1/7。在消化的过程中，每10分钟用20％的氢氧化钠溶液校正ph一次，保持ph在7.8～8.0，并维持消化温度50～55℃，共消化2.5小时。消化结束，加入冰乙酸750ml搅匀，再加温煮沸。用滤布将滤清液分装至已灭菌的空瓶内，塞上橡皮塞包扎好储存备用。按照同样的方法配制三批林氏消化液，批号是试201511001、试201511002、试201511003。实施例2、改良林氏消化液配制改良的林氏培养基的制备方法(1)准备材料：每100ml的白喉ⅰ号溶液配方如下表1所示(余量为水)：表1序号品名数量百分比1l-胱氨酸100克10％2盐酸(hcl)100毫升10％每100ml的白喉ⅱ号溶液配方如下表2所示(余量为水)：表2改良的林氏培养基的成分及配制次序如下表3所示：表3表中，an：含氮量，含氮量(an)0.185％(wt)的指添加林氏消化液至培养基中的含氮量为0.185％(wt)。(2)制备改良林氏培养基将注射用水按批量的2/5加入已清洁的配制容器内，投料次序应按照配方所列次序1～2项，逐一投入已清洁的配制容器内，搅拌，转速200-300转/分钟，加温50～60℃。依次加入3～5项原材料(6-7项培养过程中加入)，搅拌，转速200-300转/分钟。用20％氢氧化钠溶液调整ph至8.2～8.4(初次加入培养基总量4％的20％氢氧化钠溶液，检测ph，再逐步加入20％氢氧化钠溶液调整ph)，搅拌均匀，补足批量。打开蒸汽阀加温煮沸保持5分钟。待所有材料完全溶解后，及时用20％氢氧化钠溶液进行ph的初步调节，调至ph至8.2～8.4。培养基冷却至70℃±5℃过滤，然后通过软管输送至已清洁的培养基储存罐。实施例3、白喉杆菌的接种培养及培养效果(1)材料准备白喉杆菌来自中国药品生物制品检定所改良林氏培养基(2)培养条件在大罐内，温度保持34～36℃，通气量为150～300l/min。培养总时间为48～50小时。(3)培养效果使用批号是试201511001、试201511002、试201511003的三批改良林氏消化液为基础配制的改良林氏培养基的培养效果见表4，以原有的使用新鲜牛胰脏自制酶制备的消化液为对照。表4批次结果试201511001300lf/ml试201511002290lf/ml试201511003290lf/ml自制酶消化的林氏消化液批次1240lf/ml自制酶消化的林氏消化液批次2220lf/ml自制酶消化的林氏消化液批次3195lf/ml由表2可看出，用本发明方法制得的改林氏消化液的培养效果比自制酶消化林氏消化液培养效果好。取少量培养完毕的培养液境检，结果可见，试201511001(图1)的培养液中，目标菌株的生长情况显著好于对照组(图2)的菌株生长情况。最后需要补充的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用做限定本发明的保护范围。当前第1页1 2 3

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