一种肠道菌群保存液及制备方法与流程

本发明应用于生物
技术领域：
，具体涉及一种肠道菌群保存液及制备方法。
背景技术：
：肠道是人体消化与吸收的主要器官，其回旋盘转的结构被形象地称为人体第二大脑。而人体肠道内寄生数量繁多的微生物，包括细菌、真菌等，其中细菌占99％，大约有10万亿个，被称为肠道菌群。它们是人体内最重要的一种外环境，各种微生物按一定比例组合，相互制约，相互依存，在质和量上形成一种生态平衡。肠道菌群基因数量大约是人体基因的100倍，因此也被称为人体的“第二基因组”。肠道菌群不仅能影响人体对蛋白质、脂类、碳水化合物等营养物质的消化与吸收，还能合成多种人体生长发育必须的维生素，调节机体免疫力，抵御感染和自体免疫疾病的患病风险，还与肥胖、2型糖尿病、结直肠癌、炎症性肠病等数十种疾病密切相关，并且能控制人体对癌症治疗药物的反应。正常情况下，肠道各菌种与宿主相互依存、相互制约，维持一种动态平衡；一旦体内外环境发生改变(如使用药物等)，平衡状态就会被打破，导致肠道菌群失调，引发各种病症，如消化系统疾病、内分泌系统疾病、精神系统疾病、自身免疫性疾病以及一些感染性疾病。由此可见，肠道菌群对维持机体健康起着不可或缺的作用。伴随着生物技术和基因检测科技的发展，对人类第二基因组的“肠道菌群”的关注日益增加。由于肠道微生物种类繁多，研究肠道微生物的种类构成和原始比例及其对人体的影响极其重要。16srdna是原核生物编码16srrna的基因，长度约为1500bp，由10个保守区和9个可变区(v1-v9)组成，可变区反映了物种间的差异性。采用高通量扩增子测序技术来检测微生物16srrna基因的特定高变区，适用于环境微生物、肠道菌群等样品的细菌和古细菌相对丰度的鉴定。16srdna-seq是通过提取微生物菌群的dna，选择可变区的特定区段(v3-v4)进行pcr扩增，再通过高通量测序的方法，帮助研究人员分析特定环境中微生物群体基因组成及功能、微生物群体的多样性与丰度，进而分析微生物与环境、微生物与宿主之间的关系，发现具有特定功能的基因。利用16s技术，检测样本中的肠道微生物种类及丰度，指导受检者了解肠道微生态健康状况，评估相关疾病风险，营养合成和吸收的能力，定制个性化的健康管理方案。在医学领域，主要应用于肠道微生物与疾病的关联分析，揭示疾病与健康个体间微生物的差异，研究药物或饮食干扰后菌群差异，或某一病程发展过程中肠道菌群的变化，如腹泻、肠炎、结直肠癌等。粪菌中绝大部分为厌氧菌，其中有部分是严格厌氧菌，它们很容易在有氧环境中失去活性。传统的方法是用固体或是液体培养基对细菌进行分离培养，周期长，受技术影响难以分离培养出所有的肠道菌群，限制了人们对肠道菌群的研究。目前采用ngs高通量测序技术，不需要分离培养，通过对粪便样品进行dna提取检测，就能全面检测人体肠道菌群种类与数量。由于微生物样本的不稳定性与样本保存的复杂性，微生物常温保存与采集是大家普遍关心的问题。因此，粪菌样本保存的相对于其他细菌的保护条件更为苛刻。目前临床上一般采用冷藏法用于直接保存人体粪便，即当粪便采集后立即冻存在-20℃或者更低的温度中，由于细菌在低温状态下代谢速率降低，因此可以在一段时间内维持粪便中细菌的构成，从而达到稳定其微生物构成的目的。当需要进行fmt操作时，将冻存品再通过分离方法得到粪菌，这不仅增加了粪菌分离的难度和工作量，也需要更大的存储空间。此外，粪菌如作为一种治疗方法中的“药品”，不能够直接在临床中应用，反而需要先冻存粪便再提取后使用，这样的治疗过程无疑会增加操作和设备的依赖性，会阻碍粪菌移植治疗方法的发展。同时，我国很多医疗机构并不具备对粪菌进行分离的能力。因此，尽管专利文献一种粪便保存液(cn104480012a)报道了利用edta盐及柠檬酸钠等物质，以水和乙醇作为溶剂配制的保存液能够将粪便样本在密封常温下保存一周，但这种方法不适于对粪菌移植中的粪菌进行保存。目前临床在粪菌移植过程中常采用磷酸盐缓冲液(pbs)与供体粪菌混合，由于混合液的流体特征，临床上采用内镜下喷射或者灌肠过程中，与肠道壁接触时间短，影响粪菌定植效果。粪菌液如需保存，则需要额外加入甘油，过多的步骤容易增加外源性感染的机会。为此我们提供了一种易于肠道微生物采集、保存及运输的试剂配方及制备方法，方便对肠道微生物的研究。技术实现要素：本发明针对现有技术中存在的粪菌移植中的粪菌不易进行保存，易感染等问题，提供一种易于肠道微生物采集、长途运输、保持菌群丰富度和遗传物质稳定性的肠道菌群保存液及制备方法。本发明解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：一种肠道菌群保存液，其特征在于包括：进一步的，所述保存液的ph值为7.5。进一步的，所述防腐剂选自醇类或者醛类，优选的，所述防腐剂为羟基苯甲酸酯或氯丁醇。进一步的，所述固定剂选自蔗糖或乙醇，所述抗氧化剂选自硫脲，所述抗凝剂选自edta-二钠，所述缓冲液选自tris-hcl，所述离子强度维持剂选自dmso。优选的，所述固定剂选用蔗糖。乙醇能长时间里稳定地保存粪便样品中的微生物菌落结构，但是乙醇是易燃品，不易用于样品运输，故需运输的保存液选用蔗糖作为固定剂。一定比例的dmso作为离子强度维持剂，该比例下的dmso保存的新鲜样品可以在不超过37℃高温天气下保存一天，或者在25℃室温下保存两周；或者4℃冰箱存放一个月；或者-20℃长期保存而使dna保持完整免受降解。故本发明保存液不需要冷冻保存，在常温下即可保存两周。添加羟基苯甲酸酯或氯丁醇作为防腐剂，使菌群稳定。进一步的，一种肠道菌群保存液，包括：进一步的，一种肠道菌群保存液，包括：进一步的，一种肠道菌群保存液，包括：一种上述肠道菌群保存液的制备方法：按照配方称取各组分，将抗凝剂加入ddh2o完全溶解；在ddh2o中加入防腐剂、固定剂、抗氧化剂、缓冲液、离子强度维持剂并充分溶解后，加入溶解后的抗凝剂充分混合；调节溶液的ph值为7.5后加ddh2o定容至所需体积得到保存液。进一步的，所述防腐剂选自醇类或者醛类，优选的，所述防腐剂为羟基苯甲酸酯或氯丁醇。进一步的，所述固定剂选自蔗糖或乙醇，所述抗氧化剂选自硫脲，所述抗凝剂选自edta-二钠，所述缓冲液选自tris-hcl，所述离子强度维持剂选自dmso。一种上述肠道菌群保存液的保存方法：1)采集至少1g新鲜的粪便样品或者肠道内容物样品；2)按照样品和保存液用量的比例为1:3(w/v)，将收集的样品浸泡在保存液中；3)尽快将步骤2)中浸泡了样品的保存液运输至实验室进行核酸提取或保存于常温/超低温中备用。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明将采集的粪便或肠道内容物直接置于保存液中，无需冻存，即可达到稳定其中微生物构成的作用。本发明所述的粪便样品或肠道内容物样品的保存液中样品的dna收获率高，测序数据质量良好，确保样品中菌群的种类和丰度和新鲜样品的菌群丰度保持一致，样品储存在此保存液中可以常温运输，无需冷冻，常温保存可达2周时间。本发明的配方在室温条件下就能够长时间的对类粪便的样品中的dna进行有效保存，有效解决了现有技术采集粪便样本dna的保存时间短，且需要低温保存运输的缺陷，适合工业化大规模生产及应用。附图说明图1为本发明一种肠道菌群保存液及制备方法实验例中10例样品otus统计图。图2为本发明一种肠道菌群保存液及制备方法实验例中10例样品门水平上的物种相对丰度柱形图。图3为本发明一种肠道菌群保存液及制备方法实验例中10例样品菌群多样性分析。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。另外，除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备均可通过市场购买获得或现有方法制备得到。实施例1：一种肠道菌群保存液，包括：肠道菌群保存液的配制：按照上面配方称取各组分，将edta-二钠加入ddh2o完全溶解；在ddh2o中加入羟基苯甲酸酯、蔗糖、硫脲、tris-hcl、dmso并充分溶解后，加入溶解后的抗凝剂充分混合；调节溶液的ph值为7.5后加ddh2o定容至所需体积得到保存液。实施例2：一种肠道菌群保存液，包括：肠道菌群保存液的配制：按照上面配方称取各组分，将edta-二钠加入ddh2o完全溶解；在ddh2o中加入羟基苯甲酸酯、蔗糖、硫脲、tris-hcl、dmso并充分溶解后，加入溶解后的抗凝剂充分混合；调节溶液的ph值为7.5后加ddh2o定容至所需体积得到保存液。实施例3：一种肠道菌群保存液，包括：肠道菌群保存液的配制：按照上面配方称取各组分，将edta-二钠加入ddh2o完全溶解；在ddh2o中加入氯丁醇、无水乙醇、硫脲、tris-hcl、dmso并充分溶解后，加入溶解后的抗凝剂充分混合；调节溶液的ph值为7.5后加ddh2o定容至所需体积得到保存液。实验例1、保存液的配制按照本发明实施例1的方案配制保存液备用，命名为cn-2；按照专利cn104480012a的方案配制保存液：按照以上配方称取各成分，无菌去离子水溶解后，高压灭菌，室温保存备用，命名为cn-1。2、样品收集及处理收集同一个人的粪便样品平均分成10份，每份样品大于1g，分别编号为zs-1、zs-2、zs-3、zs-4、zs-10、zs-11、zs-12、zs-14、zs-15、zs-16。样品处理方式如下：样品编号样品处理方式zs-1不加入任何保存液，10分钟内直接提取肠道微生物dna，备用zs-2不加入任何保存液，室温保存24小时，提取肠道微生物dna，备用zs-10不加入任何保存液，室温保存3×24小时，提取肠道微生物dna，备用zs-14不加入任何保存液，室温保存7×24小时，提取肠道微生物dna，备用zs-3加入cn-1保存液，室温保存24小时，提取肠道微生物dna，备用zs-11加入cn-1保存液，室温保存3×24小时，提取肠道微生物dna，备用zs-15加入cn-1保存液，室温保存7×24小时，提取肠道微生物dna，备用zs-4加入cn-2保存液，室温保存24小时，提取肠道微生物dna，备用zs-12加入cn-2保存液，室温保存3×24小时，提取肠道微生物dna，备用zs-16加入cn-2保存液，室温保存7×24小时，提取肠道微生物dna，备用样品zs-3、zs-11、zs-15、zs-4、zs-12、zs-16加入保存液的保存方法为：各样品与保存液用量比例为1:3(w/v)，按照比例将各样品浸泡在保存液，采用一次性10ml灭菌管室温保存。3、样品dna提取本步骤2中粪便dna提取采用美基生物生产的粪便dna提取试剂盒(货号：d3141),操作步骤按照说明书进行。具体步骤如下：转移150～200mg粪便样品至2ml离心管中。立即加入1.2mlbufferssl至样品中，最高涡旋1分钟充分打散样品。70℃水浴10分钟。涡旋15秒。室温下，≥14000×g离心10分钟。转移250μl上清液至新的1.5ml离心管中。加入20μlproteinasek和250μlbufferal上清液中。颠倒混匀10次。70℃水浴10分钟。加入250μl无水乙醇至样品中，颠倒混匀10次。把hipurednaminicolumni装在2ml收集管中。转移混合液至柱子中。10000×g离心30～60秒。倒弃流出液，把柱子装回收集管中。加入500μlbuffergw1(已用无水乙醇稀释)至柱子上。10000×g离心30～60秒。倒弃滤液，把柱子装回收集管中。加入650μlbuffergw2(已用乙醇稀释)至柱子中。10000×g离心30～60秒。buffergw2须用无水乙醇稀释。倒弃滤液，把柱子装回收集管中。13000×g离心2分钟甩干柱子。将柱子装在1.5ml离心管中。加入50～200μl预热至70℃的bufferae至柱子的膜中央，室温放置2分钟。13000×g离心1分钟。丢弃dna结合柱，把dna保存于-20℃。4、16srrna测序将10个样品进行16srrna测序，通过分析比较10个样品的菌群结构的差异和变化。本实验例通过对微生物16srrna的v3-v4区进行检测。采用illumina生产的miseq高通量测序仪进行测序。5、菌群结构分析通过16srrna测序数据及生物信息学分析，获得10个样本对应的菌群，计算物种多样性指数进行比较。参见表1，本发明人员统计了10号样本测序结果并评估测序质量符合分析要求。本发明分析了10例样本的otus统计数据及样品门水平上的细菌相对丰度构成(参见附图1、附图2)和菌群多样性构成(参见附图3)。参见表1及附图1-3，基于细菌丰富度，菌群关系，以及菌属构成的分析，随着时间的推移，本发明配方保存液细菌丰富度变化小(zs-4、zs-12、zs-16)，而保存液cn-1细菌丰富度在第3天时就产生较大的变化(zs-3、zs-11、zs-15)，而不使用任何保存液的样品细菌丰富度变化更大；可见本发明保存液与保存液cn-1、不添加任何保存液相比显示出较好的维持细菌相对丰度的作用。本发明配方保存液菌群多样性在第7天由6.36变为6.19，而保存液cn-1菌群多样性在第7天由6.25变为5.96，虽然在第1天后两者菌群多样性相差较小，但随着时间推移冻存液的菌群多样性变化较大，可见本发明配方保存液在菌群多样性方面优于传统的冻存液。从统计结果表明，采用保存液cn-2常温运输保存，高效稳定期可达7天。本发明保存液配方，其效果与传统的冻存液(cn-1)处理相比有明显的优异性，且明显优于实验例中涉及到的不做任何处理的保存方案。表110个样品16srrna测序质量统计表以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。对于本
技术领域：
的技术人员来说，在不脱离本发明技术构思前提下所作任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3 

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