一种含木质素类生物质转化合成姜黄素的方法与流程

本发明涉及一种木质素类生物质转化合成姜黄素的方法，属于生物技术领域。

背景技术：

姜黄素(curcumin,c21h20o6)是存在于姜黄属植物的根茎中的一类天然植物多酚，包括姜黄素、脱甲氧基姜黄素和脱二甲氧基姜黄素三种姜黄色素，含量最高的为姜黄素(1,7-二(3-甲氧基-4-羟基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮)。

近年来的研究发现，姜黄素不仅可以作为天然色素用于各类食品，而且具有广泛的生物活性，例如抗肿瘤、抗氧化、抗炎和抗老年痴呆等药理功能，可以用于医疗上加速伤口愈合、抗病毒、抗诱变、抗转移、降血脂和免疫调节等。美国国立肿瘤研究所将其列为第三代癌化学预防药。由于其在许多国家广泛作为普通的食品佐料和食用色素，其安全性已经被广泛认可。据记载，印度次大陆的老百姓食用姜黄已有5,000年的历史。高安全性使得许多保健品以姜黄素作为主要成分在市场迅速推广流行。

姜黄素在植物中的合成通常是由植物苯丙烷代谢途径提供前体，经iii型聚酮合酶催化得到。肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸和阿魏酸经对香豆酰辅酶a连接酶(4-comaratecoenzymealigase,4cl)催化生成相应芳香酸辅酶a酯类，然后经由姜黄素类合酶(curcuminoidsynthetase,cus)催化合成姜黄素类化合物。

植物提取法是生产姜黄素最为常用的方法，也有化学合成的相关报道。植物提取法是市场主流，目前90％以上的姜黄素来自于植物提取，然而由于提取工艺限制，所得到的姜黄素纯度较低，不能得到高含量的纯品，严重影响了其进一步在医药领域的应用。化学合成存在反应时间长，原料价格昂贵，收率低，而且来源非天然等缺点。

生物质资源的循环利用是目前国际上关注的焦点，植物生物质资源是生物质资源的重要组成，其成分主要包括纤维素、半纤维素和木质素，其中木质素作为天然芳香化合物的主要来源长久以来未得到重视和利用，如何将木质素成分转变为高值化产品是提高生物质利用的一个绿色可持续的方法。木质素解聚产物中含有大量的阿魏酸、肉桂酸、香草酸、香草醛和香豆酸等芳香化合物，如何高效的利用木质素解聚产物实现木质素的高值化利用对于开发利用木质素类生物质废弃物具有重要的现实意义，也是实现农林业可持续发展的要求。

本发明要解决的技术问题是通过构建基因工程菌株，提供一种高效的将木质素类生物质解聚产物转化制备姜黄素的方法。

技术实现要素：

本发明目的是公开一种将农林废弃生物质资源例如木屑和秸秆以及工业木质素、造纸黑液等廉价物质转化为高附加值的生物活性物质姜黄素的方法，本发明所述的方法解决了农林废弃物的高值化利用瓶颈，降低了姜黄素的生产成本，具有重要的工业价值。

本发明枯草芽孢杆菌基因工程菌；该菌命名为枯草芽孢杆菌m168c，已于2020年7月13日保藏位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，建议的分类命名为枯草芽孢杆菌bacillussubtilis，保藏号为：cgmccno.20353。

上述枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，按照下述步骤进行：

(1)敲除掉枯草芽孢杆菌的漆酶基因；

所述的敲除漆酶基因的方法包括同源臂重组或基因编辑的方法，所述漆酶基因序列如列表中序列1所示。

(2)优化4cl和cus编码基因的密码子，优化为芽孢杆菌偏爱的密码子，优化后的密码子如列表中序列2和序列3所示。

(3)获得4cl和cus的编码基因片段，并将基因片段通过内切酶酶切整合到质粒中，然后将携带4cl和cus编码基因的质粒通过电转化方法转入到敲除掉漆酶基因的枯草芽孢杆菌中，通过抗性基因筛选转化成功的基因工程菌，然后测序验证是否基因工程菌构建成功。所述获得4cl和cus的编码基因片段的方法包括pcr扩增或者基因合成手段；

所述质粒为pax01。

一种利用上述枯草芽孢杆菌基因工程菌转化含木质素类生物质合成姜黄素的方法，按照下述步骤进行：

(1)含有木质素生物材料的预处理；

所述木质素生物材料为包括秸秆或者蔗渣木屑等农林废弃物生物质原料；所述预处理包括通过气爆、稀酸、稀碱法或者酶预处理。

(2)工业木质素或者预处理后的预处理液进一步处理达到解聚木质素的目的，得到的解聚反应液ph调至中性备用；所述解聚木质素的方法包括热裂解、酶法、微波、金属催化剂、碱催化等方法。

其中步骤(2)所述的热裂解：将5-20％(v/v)的木质素水溶液在反应釜中以250-450℃的温度热裂解10-60分钟。压力控制在30兆帕以内。

其中步骤(2)所述的酶法：将漆酶或者染料脱色酶以0.1g/l的浓度溶解有乙酸盐缓冲液(ph4)中，然后将漆酶溶液以1:1(v/v)比例与5-20％的木质素溶液混合均匀，在30℃下反应6-24小时，采用漆酶时可以加入0.01-0.05mmol的2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(abts)，采用染料脱色酶时加入0.05-0.2mmol的h2o2。

其中步骤(2)所述的金属催化剂裂解方法：以金属催化剂(镍、钛、锌等)为催化剂，在10％的木质素溶液体系中100-300℃下处理0.5-2h。将木质素以1-20％(g/l)的浓度溶解于2-10％nacl溶液当中，然后在反应釜中60-200℃反应1-3小时后收集滤液备用。

其中步骤(2)所述的碱水解方法：将不高于10％(g/v)的氢氧化钠溶液加入木质素(溶液中木质素含量不超过20g/l)，在80-120℃下处理1-12h。

(3)将基因工程菌(保藏号：cgmccno.20353)冻存管接种到含有卡那霉素(50μg.ml^-1)的lb培养基中37℃活化预培养24h，然后按照1:10(v/v)的比例接种到发酵培养基，以解聚产物作为底物，配制发酵培养基，将预培养的枯草芽孢杆菌基因工程菌接种后在发酵罐中高密度发酵培养24h，培养温度37℃，通过naoh和hcl调整ph在6.8-7.2，转速在100-300rpm之间，溶氧通过控制通气量设置不低于20％,培养过程中通过补料方式在葡萄糖低于5g/l的时候补充葡萄糖，在发酵od值30以上时停止发酵，然后将发酵液置换为以木质素解聚产物为单碳源的mm63培养基,在37℃继续培养24h，ph控制在6.8-7.2，以hplc检测姜黄素合成量。

其中步骤(3)所述预培养培养基为lb培养基(g/l)：胰蛋白胨10g酵母提取物5gnacl10g。

其中步骤(3)所述发酵培养基为豆粕营养培养基(g/l)：酶解豆粕粉50，玉米浆粉30，葡萄糖10，feso40.1，mgso40.5，磷酸盐缓冲液50mm。

其中步骤(3)所述转化培养基为mm63培养基：100mmkh2po4,75mmkoh,15mm(nh4)2so4,1mmmgso4,3.9μmfeso4；木质素解聚产物含量1-20g/l。

(4)将发酵液离心，固液分离后收集上清液，上清液加入有机溶剂萃取，然后从分离的有机溶剂相中进行回收脂溶性的姜黄素。

(5)回收的姜黄素混合液经过硅胶柱、大孔树脂或者离子交换柱进行纯化，然后通过结晶重结晶得到纯化后的姜黄素。

本发明的有益效果：

枯草芽孢杆菌具有蛋白分泌能力强，生长速度快，耐受性好、发酵周期短和工人安全的特性，枯草芽孢杆菌是作为底盘细胞的最佳选择。而且枯草芽孢杆菌可以利用木质纤维素做碳源生长，具有较强降解木质纤维素的能力，因此适合用木质纤维素解聚转化合成姜黄素的底盘细胞。但是枯草芽孢杆菌中含有漆酶，而根据研究数据发现，漆酶能够以氧化肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸和阿魏酸生成其它物质(glazunova,olgaa.,etal.,2018,catalysts,8(4),152)，因此，如果以枯草芽孢杆菌作为合成姜黄素的底盘细胞，必须敲除漆酶基因，防止姜黄素的前体物质被漆酶氧化。

木质素作为自然界最丰富的可再生芳香化合物资源，一直未得到有效的高值化利用。本发明利用木质素作为底物转化合成姜黄素，首先突破了姜黄素只能由姜黄植物提取方式获得的限制，其次为木质素的高值化利用提供了途径，最后通过生物合成转化方式得到的姜黄素成分单一，纯度高，在医药方面更容易得到应用。由于植物提取的姜黄素通常是三种不同结构的混合物，只能作为保健品利用，而木质素通过生物合成转化获得的姜黄素只有一种主要成分，因此更有利于在生物医药方面的应用，例如作为注射药物，必须是单一成分。

附图说明

图1为姜黄素与植物提取物标准品hplc色谱图；

图2为姜黄素标准曲线。

具体实施方式

以下文详细的说明了本发明的实施方式。

本发明是提供一种利用含有木质素的生物质微生物合成姜黄素的方法，该方法包括含木质素生物质为原料，通过系列生物、化学或者物理方法解聚后以基因工程菌转化为姜黄素并提取到有机溶剂相中然后进一步精制纯化。

在本发明的姜黄素微生物合成制备方法中，作为底物的含木质素生物质只要是含有苯丙烷单元的木质素为主要成分之一的来源于植物生物质即可，没有特殊的限制。如：杨木、柳木、松木、木屑、芒草、柳枝稷、高粱秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆、麦秆、蔗渣、稻壳粉、麦麸、碱性木质素、木质素磺酸钠、木质素硫酸钠、磨木木质素、木糖渣、醋糟、造纸黑液等。

本发明所选用的枯草芽孢杆菌可以为枯草芽孢杆菌种的各亚种和菌株，如：枯草亚种(bacillussubtilissubsp.subtilis)，纳豆亚种(bacillussubtilissubsp.natto),沙漠亚种(bacillussubtilissubsp.inaquosorum)，内生亚种(bacillussubtilissubsp.endophyticus)斯皮兹亚仁亚种(bacillussubtilissubsp.spizizenii)等亚种的典型株和非典型株。

本发明所选用的枯草芽孢杆菌的酶基因敲除方法可以为同源臂重组方法或者crisp-cas9基因编辑方法或者其他能够将漆酶基因失活的方法。

本发明所用的酶编码基因序列例如4cl和cus的编码基因序列来自于植物，所述植物可列举如：水稻、姜黄、拟南芥等种属。作为姜黄素合成相关的基因，不仅可以为上述来源自植物的编码基因，也可以优选使用通过定向酶进化将蛋白的酶活性改良的变体或者重组体。

本发明的姜黄素合成制备方法中，木质素解聚方法包括并不限于热裂解、酶法、微波、金属催化剂、碱催化方法。

本发明中的“解聚”是指木质素结构能够达到产生阿魏酸、对香豆酸等单体芳香化合物的程度。

本发明中基因工程菌培养用的培养基和培养方法没有特殊的限制，只要有利于生长富集细菌细胞的培养基既可以使用。例如lb培养基，肉汤培养基，豆粕发酵培养基等，可以恰当的选择合适作为菌生长和转化的营养成分和培养方法，培养时间也没有特殊的限制，只要达到细菌细胞的高密度即可，培养方法可以为流加培养，或者高细胞浓度连续培养，以及分批补料培养。转化培养基所用的限定培养基没有特殊限制，只要为以木质素及其解聚产物为单一碳源，可以将木质素解聚产物能够转化合成所需目标量的姜黄素即可，例如mm63培养基或者无机盐培养基。在上述情况下的姜黄素的产量根据目的没有特殊的限制，就例如单位培养基中姜黄素的含量而言，可以是0.5μg/ml以上，优选1mg/ml以上，更优选2mg/ml以上。

在本发明的姜黄素合成转化方法中，从上述培养液中提取姜黄素时，可以从微生物培养液直接提取，也可以根据需要破碎上述细菌细胞成为细胞破碎物，从所述破碎物中提取。提取和破碎也可以同时进行。

本发明中姜黄提取时所用有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、丙酮、丁酮、环己酮、乙醚、石油醚、正己烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸正丙酯、二甲基亚砜等一种或多种以不同比例混合。

本发明中提取方法可以为热回流提取、微波辅助提取、超临界co2、超声波辅助提取或者其组合。

本发明中纯化方法可以是离子交换柱、大孔树脂或者硅胶柱洗脱。

下面参照以下实施例来解释描述本发明的技术方案，这些实施例仅为了例证的目的被提供，并且本发明不限于这些实施例，而是涵盖作为本文提供的指导的结果是显著的所有的变型。

实施例1：漆酶基因敲除枯草芽孢杆菌的构建

利用质粒puc57-kan获得的卡那霉素抗性框架，通过同源重组将枯草芽孢杆菌(拉丁文名称为bacillussubtilis)168(购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，cgmcc1.1391)的漆酶基因lacc(seqidno.1)敲除。在漆酶基因上下游200bp左右采用oligo软件进行辅助设计引物(附表1)。在lac-up-rev、lac-dw-fr、kan-fr和kan-rev引物中加入20bp的同源臂进行同源重组。以lac-up-fr和lac-dw-rev为引物，建立了融合pcr方法，对扩增的3个片段进行融合，得到1.2kb的融合产物。融合pcr需要在98℃下的初始循环2分钟，然后在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸2分钟。融合产物在1％(w/v)琼脂糖凝胶上进行分析，然后凝胶提取(takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0)。根据说明书，在16℃下将切除的融合产物与pmd18-t载体连接8小时。将连接产物直接电穿孔(bioradgenepulser电穿孔仪)到野生的枯草芽孢杆菌168。将20μl电穿孔细胞涂布在添加卡那霉素(50μg.ml^-1)的lb板上以挑选基因敲除目的菌。然后通过基因测序验证漆酶基因敲除。

表1基因敲除所用引物信息

实施例2：整合重组质粒pax01-4cl-cus的构建

采用invitrogen植物基因组提取试剂盒提取水稻的基因组dna和桑葚基因组dna，水稻由江苏大学生物质能源研究所种植提供，桑葚植物采集于江苏大学校园内。根据已公布的基因组信息序列(水稻：genbank:ap014963.1；桑葚：kj013409.1)，分别设计4cl(seqidno.2)和cus(seqidno.3)两个酶基因序列的引物(附表2)。

表2引物信息

以提取的基因组dna为模板，采用标准的pcr扩增体系和程序(taq50μl体系，包括1μldna模板，1μl上游引物和1μl下游引物，dntpmix5μl，mgcl23μl，taqpolymerase0.5μl，缓冲液及纯水补足50μl)，95℃预变性4min，变性95℃30s，退火57℃50s，延伸72℃90s，终延伸72℃10min，35个循环。扩增获取4cl和cus基因，通过电泳验证扩增成功。

pcr扩增获取的4cl和cus基因片段和质粒pax01(购自武汉淼灵生物科技有限公司)分别用限制性内切酶bamhi和sacii(takara，大连)进行双酶切，然后采用琼脂糖凝胶进行纯化，产物通过连接酶16℃过夜，电转化感受态的枯草芽孢杆菌细胞bacillussubstilis168(中国普通微生物菌种保藏中心，编号cgmcc1.1391，江苏大学生物质能源研究所保存提供)，挑单菌落pcr验证，阳性重组的克隆进行测序验证是否重组质粒pax01-4cl-cus构建成功，对成功整合的枯草芽孢杆菌命名为m168c，已于2020年7月13日保藏位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，建议的分类命名为枯草芽孢杆菌bacillussubtilis，保藏号为：cgmccno.20353。

实施例3：木质素解聚混合物的制备

将玉米秸秆先用粗粉碎机粗粉碎成0.5-1cm左右的大小碎片，然后再次粉碎至100目。将粉碎好的木质纤维素放入蒸汽爆破装置内，采用210℃爆破温度，保温时间10分钟，然后加入1％naoh(g/v)进行碱处理，然后离心除去固体收集液体。然后将液体利用间歇式高压反应釜在200℃的反应釜中进行水热解聚30分钟，解聚产物置入储罐备用。

实施例4：工程菌对木质素解聚混合物的发酵转化

将基因工程菌m168c接种到lb培养基(含有卡那霉素50μg/l)，三角瓶扩培24小时，然后接种到50l发酵罐，发酵培养基为lb培养基，37℃发酵18-20小时后去除培养液，置换为含有10％(v/v)木质素解聚混合物液的mm63培养基，然后继续培养24小时。通过hplc检测姜黄素的含量为238mg/l。

实施例5：脂溶性抽提物的制备与姜黄素单体化合物的制备

将实施例4所得到的发酵液经过均质机破壁后5000转离心，收集上清液，上清液用1-5倍体积的乙醚萃取，在索氏提取仪中提取1-8小时，然后减压浓缩回收乙醚，得到脂溶性浓缩液。将脂溶性浓缩液100ml和1kg80-100目硅胶搅拌混合均匀装柱上样，然后用石油醚和乙酸乙酯比例从1：10-10：1比例依次洗脱，将洗脱液薄层硅胶板(gf254)点样后于紫外灯下观察，合并含有姜黄素的流份，减压回收溶剂，即得纯化的姜黄素，将纯化后的姜黄素再进行结晶重结晶，最后获得结晶状姜黄素。hlpc检测与植物提取来源姜黄素标准品对照鉴定确认得到的晶体为姜黄素(附图1)。通过标准曲线计算，验证所获得的姜黄素纯度在91％以上(附图2)。经计算，木质素转化合成姜黄素的得率为0.15％。

实施例6：工业碱木质素的工程菌发酵转化合成制备姜黄素

将市售碱木质素通过裂解管热裂解，首先160℃预热4分钟，然后在升温至400℃保持温度裂解30秒钟，裂解产物备用。基因工程菌m168c用三角瓶活化后以5％接种量接种到装液量为70％的50l发酵种子罐，发酵培养基为豆粕营养培养基，ph调整到7.2。发酵20h后od值达到27，然后通过管道移种到500l发酵罐(装液量：豆粕营养培养基300l)，发酵24h，6h后开始补料葡萄糖，保持残糖量在5g/l，10h后开始补料10倍浓缩的培养基。发酵过程中以naoh和hcl调整酸碱度，ph保持在7-8之间，24h检测od600最高达到42。然后陶瓷膜过滤掉培养基，重新置换含有5％的热裂解市售碱木质素为单碳源的mm63培养基，继续培养30h后离心，收集浮在上清液表面的不溶姜黄素，然后加入1:5倍体积的石油醚在40℃萃取30分钟，然后将萃取液旋转蒸发后用50％丙酮溶解，溶解后与5倍体积的氧化铝混合搅拌均匀后装柱，用石油醚、乙酸乙酯和甲醇分别进行梯度洗脱，收集黄色洗脱组分后旋转蒸发仪浓缩后与1:5倍硅胶拌料后装柱，然后用氯仿甲醇混合溶液洗脱。收集黄色洗脱组分后浓缩进行结晶，得到黄色粉末。然后黄色粉末再次溶解于氯仿甲醇的混合液后进行重结晶，最后得到晶体198g，通过hplc鉴定成分，姜黄素纯度为96.4％，最终得率为1.32％。

序列表

<110>江苏大学

<120>一种含木质素类生物质转化合成姜黄素的方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>693

<212>dna

<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilits)

<400>1

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