杨树2n花粉的诱导和分离纯化方法与流程

本发明涉及2n花粉的诱导和分离纯化方法，尤其涉及杨树2n花粉的诱导和分离纯化方法，属于杨树2n花粉的诱导和分离纯化领域。

背景技术：

自1936年瑞典nilsson-ehle发现的巨型欧洲山杨被证明为天然三倍体以来(nilsson-ehleh.noteregardingthegigasformofpopulustremulafoundinnature.hereditas,1936,21:372-382)，三倍体育种已成为杨树遗传改良的重要方法，日益受到树木育种学家们的重视。现已在欧洲山杨、美洲山杨、银白杨、香脂杨以及毛白杨等树种中均发现了天然杨树三倍体的存在(nilsson-ehleh.noteregardingthegigasformofpopulustremulafoundinnature.hereditas,1936,21:372-382；tammyuaandyarvekyulgl.resultsofsearchesfortriploidaspeninestonia.lesovedenid,1975,6:19-26；everyadandwiensd.triploidyinutahaspen.madrono,1971,21(3):138-147；dillewijncvan.cytologyandbreedingofpopulus.ned.boschb.–tijdshr,1939,12:470-481；gurreiromg.thesilviculturalimprovementofpopulus.publ.serv.flor.aquic.portugal,1944,11(1/2):53-117；朱之悌,康向阳,张志毅.毛白杨天然三倍体选育研究.林业科学,1998,34(4):22-31)。近年研究发现，‘i-214’、‘中林46’、‘沙兰杨’、‘廊坊3号杨’、‘武黑1号’、‘辽河杨’等一些在中国广泛栽培的著名杨树品种实际上都是来源于天然2n花粉的三倍体(张守攻,陈成彬,韩素英.中国部分杨属植物的染色体数目.植物分类学报,2005,43(6):539-544；zhangsg,qilw,hansy.areportoftriploidpopulusofthesectionaigeiros.silvaegenetica,2004,53(2):69-75)。因此，利用天然2n花粉与单倍性雌配杂交是获得杨树三倍体最为直接有效的方式。但由于杨树天然2n花粉的发生频率低，致使三倍体的筛选鉴定工作量大，且三倍体得率低于0.1％。

1937年，美国植物遗传学家blakeslee发现秋水仙碱具有诱导植物细胞染色体加倍的功效。因此，杨树育种学家期望通过利用秋水仙碱人工诱导杨树花粉染色体加倍获得高频率的2n花粉，以提高三倍体的得率，加速林木三倍体育种的进程。目前，秋水仙碱已成功应用于诱导毛新杨、大青杨、银白杨以及毛白杨等杨树种的花粉染色体加倍并获得了10.9％～88.0％的2n花粉(康向阳,朱之悌.杨树花粉染色体加倍有效处理时期的的研究.林业科学,1999,35(4):21-24；李开隆,肖静,刘桂丰.秋水仙素处理诱导大青杨2n花粉方法的优化.核农学报,2006,20(4):282-286；李赟,郭倩,王君,等.秋水仙碱诱导银白杨花粉染色体加倍及其细胞学效应研究.核农学报,2014,28(5):749-756；zhaocg,tianmd,liyj,etal.slow-growingpollen-tubeofcolchicine-induced2npollenresponsibleforlowtriploidproductionrateinpopulus.euphytica,2017,213(4):94)。但由于单倍性花粉与2n花粉难以分离，不能进行纯化，因此授粉时存在单倍性花粉与2n花粉的竞争而导致三倍体得率低的问题。

为了提高2n花粉授粉时的竞争力，康向阳等(康向阳,朱之悌,林惠斌.白杨不同倍性花粉的辐射敏感性及其应用.遗传学报,2000,27(1):78-82)对白杨不同倍性花粉对辐射敏感性的差异进行了研究，发现白杨不同倍性花粉对辐射敏感性的差异不同，适宜剂量的辐射可以在一定程度上抑制单倍性花粉的萌发。利用1780rad照射后的毛新杨混合花粉与单倍性银腺杨雌配子杂交获得了16株杂种三倍体，三倍体得率可达12.9％(康向阳,朱之悌,张志毅.银腺杨与毛新杨正反交三倍体选育.北京林业大学学报,2000a,22(6):8-11)。由此可见，花粉辐射可以有效地提高三倍体得率，但提高的幅度仍然有限，难以满足大群体、强选择育种的要求。

与花粉染色体加倍相比，利用秋水仙碱诱导大孢子母细胞染色体加倍获得2n雌配子，则不存在授粉时花粉的竞争问题。lietal.(liyh,kangxy,wangsd,zhangzh,chenhw.triploidinductioninpopulusalbaxp.glandulosabychromosomedoublingoffemalegametes.silvaegenetica,2008,57(1)：37-40)以银腺杨为材料，在人工诱导大孢子母细胞染色体加倍选择三倍体方面进行了尝试，但由于大孢子母细胞包被于子房内的胚珠中，其减数分裂时期的观察不能通过简单的压片技术而实现，必须通过常规石蜡切片进行观察，从而给雌配子染色体加倍的有效时期判断带来困难，致使人工诱导2n雌配子的诱导率依然较低，难以满足多倍体育种实践的要求。

如果能在掌握植物花粉母细胞减数分裂规律的基础上，利用物理或化学诱变剂适时处理正在减数分裂的小孢子母细胞，诱导花粉染色体加倍，获得高频率2n花粉。然后利用细胞分选技术，从混合花粉中分离出2n花粉，进而利用纯化后的2n花粉与单倍性雌配子进行杂交，不但可以彻底解决单倍性花粉的竞争问题，获得100％的三倍体得率，还可以显著减少杂交工作量，提高育种效率。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种杨树2n花粉的诱导和分离纯化方法，该方法能够将秋水仙碱诱导型2n花粉从混合花粉中彻底分离出来得到100％的2n花粉。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案包括：

(1)用秋水仙碱诱导杨树花粉染色体加倍得到包括2n花粉在内的混合花粉；(2)将混合花粉用过滤器过滤进行初步筛选；(3)将虹吸孔管与橡胶管连接后固定于显微操纵器上；该虹吸孔管的最尖端孔径大小与2n花粉粒的直径大小相当；(4)将过滤后的花粉液滴于载玻片上，借助倒置显微镜分辨2n花粉和单倍性花粉，利用显微操纵器将2n花粉吸入到虹吸孔管中，实现将2n花粉从混合花粉中完全分离。

本发明通过试验发现，以秋水仙碱为诱变剂采用下述方法进行诱导能够获得高频率的诱导型2n花粉：当大部分花粉母细胞发育至粗线期时，利用0.5％的秋水仙碱溶液对雄花芽进行注射处理，待花药成熟开裂后收集花粉；其中，所述的注射处理的次数优选为7-11次，最优选为11次数注射。

本发明将杨树雄花枝切枝水培于10-20℃温室，当花粉母细胞减数分裂进入细线期、粗线期、双线期、终变期以及中期i时，分别使用浓度为0.5％的秋水仙碱溶液对花芽分别进行0、3、5、7、9和11次注射处理。处理结束后，银灰杨雄花枝继续水培于温室至花药完全开裂并散粉，分别不同处理组合收集花粉。然后以对照组花粉粒平均直径的1.28倍作为判别2n花粉的标准(zhang,p.d,andkang,x.y.occurrenceandcytologicalmechanismofnumericallyunreducedpollenindiploidpopuluseuphratica.silvaegenet.2013,62(6):285-291.)统计每个视野中总花粉粒数与2n花粉粒的数量，计算2n花粉诱导率。进而采用spss统计软件(18.0版本)对数据进行方差分析和多重比较，筛选出秋水仙碱处理的适宜减数分裂时期和处理次数，结果发现，当大部分花粉母细胞发育至粗线期时，利用0.5％的秋水仙碱溶液对雄花芽进行7-11次数的注射处理能够获得高频率的诱导型2n花粉。

步骤(2)将混合花粉用过滤器过滤进行初步筛选的方法包括：将混合花粉置于磷酸盐缓冲液中混匀后过滤，利用磷酸盐缓冲液将滞留在过滤器内的花粉粒洗脱至离心管中；所述的过滤可以用孔径为35-45μm的过滤器进行过滤，优选用孔径为40μm的过滤器进行过滤；通过该过滤处理，将2n花粉的比例由27.41％提升为70.31％。

所述的磷酸盐缓冲液(pbs)的组成成分以及用量优选为：nacl135.2mmol/l，kcl24.2mmol/l，na2hpo4·12h2o6.5mmol/l，kh2po41.5mmol/l，ph＝7.3-7.4。

作为参考，步骤(3)中所述虹吸孔管的制备方法包括：根据诱导得到的2n花粉粒的直径大小，将带棉塞的玻璃巴氏管的一端烘烤并拉成与2n花粉粒的直径大小相当的虹吸孔管。

作为参考，步骤(3)中将虹吸孔管与显微操纵器相连接的方法包括：

将该玻璃巴氏管的没有烘烤并拉伸的另一端与橡胶软管相套接并固定到显微操纵器上；所述的橡胶软管的长度为30-100cm，优选为60cm。

步骤(4)中用移液器从离心管中优选吸取100-200μl过滤后的含有2n花粉的混合液滴于载玻片上。

本发明中所述的杨树是银灰杨(populuscanescens)、毛新杨(populustomentosa×populusbolleana)、银腺杨(populustomentosa×populusbolleana)、响叶杨(populusadenopoda)、银白杨(populusalba)、毛白杨(populustomentosa)等杨树树种。

本发明在优化秋水仙碱诱导银灰杨花粉染色体加倍技术条件的基础上，通过优化秋水仙碱处理诱导杨树花粉染色体加倍技术条件，获得高频率的诱导型2n花粉；借助孔径为35-45μm的过滤器进行过滤初选显著提升2n花粉的比例；再配套使用倒置显微镜、显微操纵器和带棉塞巴氏管虹吸而实现将2n花粉与其它的单倍性花粉彻底分离，获得100％的2n花粉；利用纯化后的2n花粉与单倍性雌配子杂交，避免了因授粉时单倍性花粉的竞争导致三倍体得率低的问题，三倍体得率提高至100％，有效提高三倍体育种工作效率，减少了工作量。

具体实施方式

以下结合具体实施例子来进一步阐述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

附图说明

图1虹吸巴氏管与橡胶软管以及显微操纵器的连接图。

图2银灰杨花粉经2％的醋酸洋红染色后在光学显微镜下进行花粉粒镜检结果；(a)对照组中的天然2n花粉(箭头)；(b)秋水仙碱诱导2n型花粉(箭头)；比例尺＝20.0μm。

图3经40μm孔径的过滤器过滤前后在光学显微镜下进行花粉粒镜检结果；(a)过滤前的2n花粉(箭头)；(b)过滤后的2n花粉(箭头)；比例尺＝20.0μm。

图4分离纯化后的2n花粉与单倍性花粉在光学显微镜下镜检结果；(a)秋水仙碱诱导型2n花粉；(b)单倍性花粉；比例尺＝20.0μm。实施例1杨树2n花粉的秋水仙碱诱导及其分离与纯化

1.材料与方法

1.1材料

本发明中所选用的银灰杨雄花枝采自于新疆阿勒泰市哈巴河天然林中的优良单株，采集好的花枝用塑料布包裹后运输至温室待用。

1.2秋水仙碱诱导银灰杨花粉染色体加倍的技术条件优化

将银灰杨雄花枝水培于北京林业大学温室(10～20℃)。每隔2h，随机采集2～3个花芽，经卡诺固定液固定后，利用醋酸洋红压片法观察花芽减数分裂进程。当观察到大部分花粉母细胞进入细线期、粗线期、双线期、终变期以及中期i时，使用浓度为0.5％的秋水仙碱溶液对花芽分别进行0次、3次、5次、7次、9次和11次注射处理，每次用针管注射1ml秋水仙碱溶液至有水珠溢出花芽表面，每次注射时间间隔2h，并对各处理组合进行编号记录。

1.3花粉收集

处理结束后的银灰杨雄花枝继续水培于温室。待花药完全开裂并散粉，分别收集不同处理组合的花粉，保存于放有硅胶的10ml离心管中，做好标记并用封口膜密封，放置于-20℃冰箱中储存备用。

1.42n花粉发生频率的统计

用镊子分别夹取少量不同处理组合的花粉，均匀地洒至滴有醋酸洋红的载玻片上制作临时涂片，并在olympusbx-51光学显微镜下随机选取5个视野观察和拍照，进一步利用imagej软件测量花粉粒直径。以对照组花粉粒平均直径的1.28倍作为判别2n花粉的标准，统计每个视野中总花粉粒数与2n花粉粒的数量，计算出不同处理组合的2n花粉发生频率。2n花粉频率＝(2n花粉数/观察的花粉总数)×100％。试验重复3次，每次重复测量200～300个花粉粒。

1.52n花粉的分离与纯化

选取2n花粉比例高的混合花粉，用镊子夹取少量花粉置于装有pbs缓冲液的1.5ml离心管中并充分混匀。花粉混合液经孔径为40μm的过滤网过滤后，用pbs缓冲液将将滞留在过滤网上2n花粉混合物洗脱至离心管中。用移液枪吸取100-200μl2n花粉混合液，滴于洁净的载玻片上。将带有棉塞的一次性玻璃巴氏吸管尖端在酒精灯上烧烤至玻璃软化，用镊子迅速拉出玻璃孔管，将玻璃孔管最尖端的直径大小调整到与诱导型2n花粉直径相当。然后取一段60cm左右的胶皮软管连接到玻璃巴氏管的没有烘烤并拉伸的另一端口并固定到显微操纵器上(图1)。借助倒置显微镜分辨2n花粉和单倍性花粉，利用显微操纵器将2n花粉吸入到玻璃巴氏管中使诱导型2n花粉从花粉混合液中彻底分开。

需要说明的是，本发明所使用的显微操纵器和倒置显微镜没有任何特别的要求，市场上出售的任何规格和型号的显微操纵器和倒置显微镜均能适用于本发明。

1.6数据分析

将2n花粉频率百分比数据经倒数转换后，利用spss统计软件(18.0版本)进行方差分析与多重比较。

2.实验结果

2.1秋水仙碱诱导银灰杨产生2n花粉的技术条件优化

银灰杨雄花芽经0.5％的秋水仙碱注射处理后，继续水培于温室至花药成熟开裂后，对照组和各处理组合均收集到了一定量的花粉。花粉经2％的醋酸洋红染色后，在光学显微镜下进行花粉粒镜检，可观察到大部分花粉粒被染成深红色，且着色比较均匀，表明该花粉粒具有较好的生活力。通过花粉粒形态比较可以发现，银灰杨对照组花粉中存在低频率的天然2n花粉(图2-a)。秋水仙碱各处理组合的花粉中，均观察到一定频率的2n花粉(图2-b)。不同处理组合2n花粉诱导率见表1。

从表1可以看出，不同处理组合间获得的2n花粉诱导率存在明显差异，2n花粉平均诱导率介于2.75％～30.27％之间。其中以粗线期注射11次的诱导效果最好，平均2n花粉诱导率可达(30.27±8.69)％；中期ⅰ注射3次的诱导效果最差，平均2n花粉诱导率为(2.75±0.43)％。未经秋水仙碱处理的对照组合也可观察到天然2n花粉的存在，天然2n花粉发生频率(2.08±0.40)％。不同处理组合2n花粉诱导率的差异显著性分析结果表明，减数分裂时期、注射次数以及减数分裂时期与注射次数的交互效应均对银灰杨2n花粉的诱导率具有极显著影响(表2)。减数分裂时期和注射次数的多重性比较结果显示(表3)，粗线期的2n花粉诱导率显著高于细线期，双线期以及中期ⅰ；秋水仙碱注射11次的2n花粉诱导率显著高于其他注射次数。因此，当花粉母细胞发育至粗线期时，利用0.5％的秋水仙碱进行11次注射是诱导银灰杨花粉染色体加倍获得2n花粉的最优处理组合。

表1不同处理组合2n花粉诱导率

表2不同处理组合2n花粉诱导率的方差分析

注：**代表差异极显著(p<0.01)。

表3不同减数分裂时期和不同注射次数2n花粉诱导率的多重比较

注：不同小写字母代表差异显著(p<0.05)。

2.22n花粉的分离与纯化

选取秋水仙碱在粗线期注射11次的处理组合花粉置于pbs缓冲液中并混合均匀，经40μm孔径的过滤器过滤，去除部分直径较小的单倍性(1n)花粉粒，提高混合花粉中2n花粉的比例；表4是经40μm孔径的过滤器过滤前后秋水仙碱诱导型2n花粉比例的统计结果。图3是过滤前后花粉照片。

表4经40μm孔径的过滤器过滤前后秋水仙碱诱导型2n花粉比例

将过滤后的花粉产物利用倒置显微镜、显微操纵器和虹吸孔管装置的联用，通过虹吸作用将pbs缓冲液中的的2n花粉从混合花粉中吸出实现完全分离纯化诱导型2n花粉，获得100％的2n花粉。

染色体数目增加后，其诱导型2n花粉粒直径均在40μm以上(图4-a)，显著大于单倍性花粉粒(图4-b)。利用纯化后的诱导型2n花粉与单倍性雌配子进行杂交，理论上可使三倍体得率达100％。采用本发明的的分离纯化方法就不必利用流式细胞仪和体细胞染色体计数法进行三倍体筛选与鉴定，可显著减少工作，提高三倍体育种效率。

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