一种人体血管周围脂肪组织单细胞悬液制备方法与流程

本发明涉及细胞生物学
技术领域：
，具体涉及一种人体血管周围脂肪组织单细胞悬液制备方法。
背景技术：
：血管周围脂肪组织(perivascularadiposetissue,pvat)是指围绕在不同血管床(脑血管、毛细血管、肺血管除外)周围的脂肪组织，近年来逐渐在心血管病理生理学领域发挥越来越重要的作用。pvat微环境由多种细胞类型和细胞因子组成。pvat旁分泌/内分泌的细胞因子可以归类血管周围因子(血管周围收缩、舒张因子)、脂肪因子(如脂联素和瘦素等)、炎性细胞因子(如肿瘤坏死因子-α和白介素等)以及某些气态分子，如一氧化氮(no)和硫化氢(h2s)。pvat由多种类型的细胞组成，主要包括血管周围的脂肪细胞，成纤维细胞，巨噬细胞，t淋巴细胞及b淋巴细胞。此外，pvat中的常驻多能干细胞，亦称为间充质干细胞，具有向脂肪细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和成骨细胞分化的多种分化能力。以往对pvat细胞构成和相关基因、蛋白的研究主要采用流式细胞术、组织转录组测序、全基因组测序、微阵列等方式进行。然而这些方法只能探索组织基因或已知蛋白的表达情况，不能排除脂肪组织异质性的局限性。单细胞测序技术的发明，为细胞异质性分析、细胞类型鉴定、信号通路差异响应、分子调控网络等领域带来了全新的研究方法与便利的实验手段。单细胞测序的实验关键在于单细胞悬液制备的质量(细胞活率要求高于80％)。脂肪组织相关单细胞测序研究较少的科学难题在于人体脂肪组织的消解难度较高，细胞活率较低(通常低于70％)。为推动血管周围脂肪组织的精准医学研究，亟需开发符合单细胞测序上机要求的血管周围脂肪组织单细胞悬液制备的方法。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种满足单细胞测序技术所需的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液制备方法，该方法获得的脂肪组织单细胞悬液的细胞平均活率可达91％。该培养方法采用从病人颈动脉周围获取的颈动脉血管周围脂肪组织，经组织消解、清洗等程序，获得满足单细胞测序上机要求的单细胞悬液。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本申请的一种人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：(a)脂肪组织预处理：将采集的脂肪组织清洗至无血液残留，再将清洗后的脂肪组织切成1-5mm的脂肪微粒；(b)预消化：脂肪微粒中滴加0.05％ii型胶原酶至覆盖住脂肪组织，再剪碎脂肪组织，直至脂肪组织变为酱状；(c)消化：将预消化后的脂肪组织再加入0.05％ii型胶原酶，37℃水浴消化20分钟，期间反复改变摇动方向，离心摇动；(d)过滤：将步骤(c)中获得的消化液过40μm孔径的细胞滤筛，加入相同体积的dpbs后置于冰上；(e)取筛网上未通过的组织块，重复步骤(c)至(d)；(f)将步骤(d)和步骤(e)中获取的消化液离心，离心后分层，吸取上清，将底部细胞用dpbs重悬，再离心，若杂质较多，再重复使用dpbs进行清洗，获得人体血管周围脂肪组织单细胞悬液。以上所述的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的制备方法，其中，(a)中脂肪组织清洗使用4℃预冷的dpbs缓冲液。以上所述的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的制备方法，其中，(b)中剪碎脂肪组织使用高压灭菌的眼科剪持续剪5-10分钟。以上所述的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的制备方法，其中，(c)中将预消化后的脂肪组织转移至15ml离心管，加入5ml0.05％ii型胶原酶。以上所述的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的制备方法，其中，(f)中如红细胞较多，再加入红细胞裂解液处理。以上所述的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的制备方法，其中，所述脂肪组织为行颈动脉内膜剥脱术或行颈动脉体瘤切除术期间在颈动脉分叉处获取颈动脉血管周围脂肪组织。以上任一所述的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的制备方法，其中，所述脂肪组织在运输过程中需要添加单细胞测序组织保存液进行密封冷藏，冷藏温度为2～8℃。以上所述的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的制备方法，其中，所述(a)至(f)的操作在生物安全柜中进行。以上所述的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的制备方法，其中，步骤(a)的操作均置于冰盒上进行。以上任一所述的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的制备方法制备得到的脂肪组织单细胞悬液。有益效果本发明公开了一种血管周围脂肪组织单细胞悬液制备方法，该方法制备的血管周围脂肪组织单细胞悬液，细胞状态好、活率高，满足单细胞测序技术的上机要求，可以有效利用临床标本，捕获更多细胞。附图说明图1为基于捐赠者1的颈动脉血管周围脂肪组织的单细胞悬液制备后台盼蓝染色光镜下照片；图2为基于捐赠者2的颈动脉血管周围脂肪组织的单细胞悬液制备后台盼蓝染色光镜下照片；图3为基于捐赠者3的颈动脉血管周围脂肪组织的单细胞悬液制备后台盼蓝染色光镜下照片；图4为基于捐赠者4的颈动脉血管周围脂肪组织的单细胞悬液制备后台盼蓝染色光镜下照片；图5为基于捐赠者5的颈动脉血管周围脂肪组织的单细胞悬液制备后台盼蓝染色光镜下照片；图6为基于捐赠者6的颈动脉血管周围脂肪组织的单细胞悬液制备后台盼蓝染色光镜下照片。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实验试剂和耗材如下：血管周围脂肪组织单细胞悬液制备流程必须是在符合gmp条件的超净环境下制备。与细胞相关的材料必须是无菌、无致热原的，并严格按照操作说明书使用，有特殊说明的情况除外。实验所用试剂如表1所示。表1实验用耗材名称批号厂家dmem培养基10-013-cvrcorning-cellgro0.4％台盼蓝溶液20160108北京索莱宝科技有限公司dpbs14190144invitrogenii型胶原酶c6885-1gsigma-aldrich40μm细胞筛网352340bd-falcon红细胞裂解液c3702上海碧云天生物技术有限公司伯优tm单细胞测序组织保存液21903-10上海伯豪生物技术有限公司ao/pi双染试剂盒bb-4142贝博生物实施例：一种人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的制备方法，具体包括如下步骤：(1)脂肪组织采集：在2019年12月至2020年7月期间，于中国医学科学院北京协和医院血管外科采集行颈动脉内膜剥脱术或行颈动脉体瘤切除术患者颈动脉分叉处的颈动脉血管周围脂肪组织，放入单细胞测序组织保存液中密封冷藏(2～8℃)后进行转运；(2)脂肪组织预处理：在生物安全柜中，用10cm直径培养皿装碎冰并盖上形成冰盒，将脂肪组织放在6cm直径培养皿，将放有脂肪组织的培养皿置于冰盒上，用4℃预冷的dpbs缓冲液将采集的脂肪组织清洗至无血液残留，用手术刀片将清洗后的脂肪组织切成1-5mm的脂肪微粒；本步骤中先用手术刀片对脂肪组织进行切碎，增加脂肪组织与消化酶液的接触面积，从而提高消化效率，缩短暴露时间；(3)预消化：向脂肪微粒中滴加少量0.05％ii型胶原酶覆盖住脂肪组织，使用一次性滴管将脂肪组织移入ep管中，使用高压灭菌的眼科剪在ep管中进行剪碎，持续5-10分钟，直至脂肪组织变为酱状；本步骤中将脂肪组织浸泡在消化液中进行剪碎，而不是先剪碎再浸泡在消化液中，可以使相同时间内脂肪组织的消化效率增加，相比于传统的先剪碎再浸泡的方法，总暴露时间短，因此对细胞活率提升有利，在不降低细胞活率的情况下，还增加了单位重量脂肪组织的活细胞数；(4)消化：将ep管中的脂肪组织转移至15ml离心管，加入5ml0.05％ii型胶原酶，在37℃水浴锅消化20分钟，期间手持离心管多方向摇动(也可使用可多方向摇动的温控摇床进行，满足可多方向反复摇动及温控条件即可)，相比摇床单一方向摇动增加了摇动方向，促进消化酶液与组织均匀接触；摇动期间需随时观察消化情况；(5)将消化液过40μm孔径的细胞滤筛，加入相同体积的dpbs后置于冰上，无需使用含血清制品终止消化；(6)吸取/钳取筛网上未通过的组织块，重复步骤(3)-(4)；本实施例的方法中将传统方法中共40分钟的消化，拆分成两个20分钟，即步骤(4)中消化20分钟后，过滤一遍，把未消化的组织再消化20分钟，可以避免过度消化导致的细胞死亡，还可以提高单位重量脂肪组织的消化效率；(7)将获取的最终的消化液，900g离心30分钟。离心后分层，底部可见细胞沉淀，上层是油脂。吸取上清，将底部细胞用dpbs重悬，800g离心5分钟。若杂质较多，可再重复使用dpbs进行清洗；若红细胞较多，可加入红细胞裂解液；(8)离心后弃上清，加入1mldpbs重悬细胞计数。获得的脂肪组织单细胞悬液在显微镜下质检，台盼蓝染色测活率，荧光活率检测仪再次测活率。本实施例采用了荧光活率检测仪，荧光染料ao可以透过活细胞的细胞膜，将活细胞染成黄绿色；荧光染料pi不能透过活细胞的细胞膜，所以活细胞不被染成红色，只有死细胞被荧光染料pi染成红色；基于荧光染色的识别分析仪器(bodbogejsy-fl-044，购自广州博大博聚科技有限公司)能准确分析活细胞与死细胞或细胞碎片，避免因焦距等因素影响台盼蓝染色判读结果的情况，大大提高了计数的准确性和稳定性。表2：基于本发明方法的血管周围脂肪组织单细胞悬液活率计数表从表2可见，基于本发明方法的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液平均活率达到了91％，满足单细胞测序技术的上机要求(80％活率)，且质量优异。人体血管周围脂肪组织获取难度高，样本量小，十分珍贵。基于本发明的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液制备将更有效地利用有限的人体血管周围脂肪组织标本。从图1～6(对应实验例1至实验例6)可以看出，采用本发明方法得到的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液活率高，杂质少。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3 

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